单细胞分离检验技术在法医学中的应用
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法医学中的法医学新技术法医学是一门关于犯罪学和法律的交叉学科,它主要通过科学分析和研究来帮助解决一些与法律相关的问题。
随着科技的不断发展,法医学也在不断进步,涌现出了许多新的技术。
本文将介绍几种在法医学中已经逐渐得到应用的新技术。
一、DNA分析技术DNA分析技术是当前法医学中最为重要和常用的技术之一。
通过对物证样本中的DNA进行分析,可以得出犯罪嫌疑人或者受害者的身份信息,对于破案和解决一些无头案件起到了关键作用。
随着技术的不断进步,法医学中的DNA分析技术也越来越准确和可靠。
二、尸表面温度分析技术尸表面温度分析技术是一种利用红外线热像仪对尸体的温度分布进行检测和分析的技术。
通过分析尸表面不同部位的温度差异,可以推断尸体的死亡时间。
这对于犯罪嫌疑人的判定以及案件调查的进行具有重要意义。
三、微量物证分析技术微量物证分析技术可以对一些微小的物证进行检测和分析,包括指纹、毛发、纤维等。
这些物证虽然微小,但在犯罪现场留下的痕迹丰富而重要。
通过对这些微量物证进行分析,可以得出犯罪嫌疑人的信息,从而协助案件调查。
四、毒物检验技术毒物检验技术主要用于进行尸体和组织样本中毒物的检测和分析。
在破解一些涉及毒品或者有毒物体的犯罪案件时,毒物检验技术发挥了重要作用。
通过对毒物的检测和分析,可以获得有关毒物种类、摄入量和作用方式等信息,为案件调查提供有力支持。
五、数字取证技术数字取证技术主要用于对计算机、手机和其他数字设备中的信息进行提取和分析。
在现代社会中,数字证据在犯罪调查中的作用越来越重要。
数字取证技术可以帮助法医学家从被调查对象的电子设备中提取关键信息,如通话记录、短信内容、图片和视频等。
这些信息对于犯罪嫌疑人的判定和案件破解具有重要意义。
六、违章断痕分析技术违章断痕分析技术是通过对犯罪现场的痕迹进行检测和分析来推断案件发生的过程和作案手段的技术。
利用先进的技术装置和仪器,法医学家可以还原犯罪现场的情况并分析痕迹。
法医学中的法医细胞生物学技术与细胞解剖学在法医学领域中,法医细胞生物学技术和细胞解剖学是两项非常重要的技术和学科。
它们通过对细胞的研究和分析,为刑事调查和司法鉴定提供了必要的科学依据。
本文将对这两个方面进行探讨,并介绍其在法医学中的应用。
一、法医细胞生物学技术法医细胞生物学技术是法医学领域中的一门重要学科,主要是通过对人体组织和细胞进行分析和鉴定,帮助解决刑事案件和其他相关法律事务。
这项技术主要包括以下几个方面:1. 细胞遗传学分析:细胞遗传学是研究细胞染色体和遗传物质(如DNA)的学科。
在法医学中,通过对犯罪现场的细胞样本、受害者和嫌疑人的细胞样本进行DNA分析,可以确定是否存在犯罪嫌疑人。
这项技术在破解犯罪案件中发挥着重要的作用。
2. 细胞毒理学分析:细胞毒理学是研究细胞对外界有害物质的反应和损伤程度的学科。
在法医学中,通过对受害者的细胞样本进行毒理学分析,可以确定是否存在中毒现象,以及中毒的类型和原因。
这项技术对于判断涉案物质的危害性和作用机制具有重要意义。
3. 细胞免疫学分析:细胞免疫学是研究免疫系统和免疫细胞的学科。
在法医学中,通过对受害者或嫌疑人的免疫细胞进行免疫学分析,可以确定是否存在某种特定的免疫反应或免疫疾病。
这项技术在判断是否存在某种特定的疾病或病理变化上非常有用。
二、细胞解剖学细胞解剖学是研究细胞结构和组织构造的学科。
在法医学中,细胞解剖学技术被广泛应用于以下几个方面:1. 细胞病理学分析:细胞病理学是研究细胞和组织病变的学科。
在法医学中,通过对受害者或嫌疑人的组织样本进行细胞病理学分析,可以确定是否存在某种特定的疾病或损伤。
这项技术对于法医学的鉴定和诊断具有重要价值。
2. 细胞形态学分析:细胞形态学是研究细胞外观和形态特征的学科。
在法医学中,通过对受害者或嫌疑人的细胞样本进行形态学分析,可以确定是否存在某种特定的细胞异常或变化。
这项技术对于法医鉴定和研究细胞损伤机制具有重要意义。
分离细胞的方法单细胞的分离是单细胞序列测定中最难的一步,其方法复杂、操作繁琐、成本高,制约了单细胞序列的进一步发展。
近年来,由于单细胞分离技术的不断创新,使细胞损耗和操作费用明显减少,单个细胞的捕捉速率和准确度得到明显改善。
目前,单细胞分离方法主要有口吸管技术、极限稀释技术、激光捕获显微切割技术、荧光流式细胞分选技术、微流控技术等。
其中,极限稀释法、显微操作方法等是一种低通量、高劳动强度的单细胞分离方法,而流式分选技术则能实现稳定、自动化地获得单一细胞,极大地促进了高通量单细胞测序技术的发展。
近年来,随着微流控技术的发展,使得以低廉的价格,可以在同一时间内,对成千上万的个体细胞进行测序,并逐步推进了单细胞测序的三代测序法。
下一步,我们将着重于把个别细胞分离出来用于后续的分析和培养。
1.口吸式技术通过显微镜观察,可以选用形态良好的细胞,再用吸管技术将单个的细胞吸出,由于可视化操作,可以获得完整的形态和几乎没有损伤的细胞。
但是这种工艺需要熟练的操作者,而且受人工干扰,流量小。
2.极限稀释法很多实验室和企业都采用手工吸液器,将细胞悬液稀释,从而将个体细胞从体内分离出来。
由于细胞在悬浮液中的分布及浓度,将其分为许多小块,在高稀释样本中,每个样本中的细胞数目会很少,直到每一份样本只有一个细胞。
这种方法不需要特别的设备,具有操作简便、费用低廉的特点。
但它易失活,效率低下。
3.激光捕获显微切割技术激光捕捉显微切割技术是一项能够将大多数实体组织标本中的单细胞或胞间室分离出来的新技术。
用显微镜对组织进行观察,并用肉眼辨认出靶细胞。
操作者在显示器上划出一条线,把要切割的那一段划出来。
沿着这个路径,用激光切割,取出组织。
有些 LCM系统还可以对活体组织进行解剖,这样就可以将活的细胞取出用于培养和分析。
LCM与免疫组化法相结合,为固体样品在单细胞层面上的分析提供了强有力的工具。
近年来,利用 LCM技术对单细胞进行单细胞分析,包括单细胞RT-PCR 、法医学中的短链重复分析、蛋白质印迹技术、质谱技术等。
法医学在法医学领域中的创新研究法医学是一门独特而重要的学科,通过对尸体、生物体和物证进行检验、分析和评估,以揭示死因、犯罪行为和损害程度。
随着科技的不断发展和进步,法医学在近年来取得了许多创新研究成果,极大地推动了法医学的发展。
本文将探讨法医学在法医学领域中的创新研究进展。
首先,法医学在DNA分析领域的创新研究为犯罪侦查和身份识别提供了更加准确和可靠的手段。
DNA分析技术的快速发展使得法医学家能够从极其微小的生物样本中提取和分析DNA,从而确定个体的身份和关系。
除了传统的DNA指纹技术外,新兴的基因组学研究为发现和利用更多基因标记提供了可能性,进一步提高了身份识别和犯罪调查的效率。
其次,法医学在病理学研究中的创新有助于对死因进行准确的诊断和鉴定。
病理学是法医学中的一个重要分支,通过对组织和细胞的检查,帮助确定死者的死因和损伤程度。
近年来,基于组织学和免疫组化的分子病理学研究不断发展,为法医学家提供了更准确和敏感的检测和诊断手段。
例如,免疫组化技术可以通过标记特定抗体来检测肿瘤标记物,帮助确定是否存在恶性肿瘤。
此外,法医学在物证学研究中的创新也为犯罪现场调查和证据分析提供了新的方法和工具。
物证学是法医学的另一个重要分支,通过对现场遗留的物品、痕迹和痕迹物质的分析,帮助还原犯罪过程和现场情况。
随着纳米技术和化学分析技术的进步,现代物证学越来越注重微观和纳米尺度的研究。
比如,纳米粒子标记技术可以用于增强现场痕迹的检测和鉴定,光谱学技术可以用于分析和鉴别不同物质的化学组成。
此外,法医学在临床医学领域的创新研究也为识别和处理伤害、暴力和虐待案件提供了新的视角和方法。
临床法医学是法医学学科的又一重要分支,致力于研究和评估人体疾病和伤害的医学诊断和评估。
随着临床医学科学的发展,医学影像学成像技术的进步提供了更详细和清晰的图像信息,有助于诊断和评估各种外伤和创伤。
综上所述,随着科学技术的进步和法医学的创新研究,法医学在领域中展现出更广阔和深远的应用前景。
法医学在DNA检验中的应用随着科技的不断进步和发展,法医学在犯罪侦查中起到了越来越重要的作用。
其中,DNA检验作为一种重要的身份鉴定手段,具有高度的准确性和可靠性。
本文将探讨法医学在DNA检验中的应用,并分析其对犯罪侦查和司法公正的意义。
一、DNA检验的基本原理和操作过程DNA(脱氧核糖核酸)是人体细胞内的遗传物质,包含了个体的遗传信息。
DNA检验通过对个体DNA样本的分析,确定个体之间的亲缘关系或者确认特定个体的身份。
其基本原理是通过比对个体DNA序列的相同点和差异点,从而判断其关系或者身份的不同。
DNA检验的操作过程主要包括采集样本、提取DNA、扩增DNA、分离并检测DNA以及结果分析等步骤。
首先,需要采集被检测者的样本,常见的有唾液、血液等。
然后,通过提取样本中的DNA,获得足够纯净的DNA材料。
接下来,利用PCR技术对DNA进行扩增,使其数量足够用于后续的检测。
然后,通过电泳或其他检测方法,对扩增后的DNA进行分离和检测,最终得出检测结果。
二、法医学在刑事侦查中的应用DNA检验作为现代刑事侦查领域中一种重要的科学手段,可以帮助解决许多疑难案件。
首先,通过DNA检验可以确认犯罪嫌疑人与现场遗留的生物样本之间的关系。
例如,通过对作案现场遗留的血迹进行DNA检验,可以确定嫌疑人是否存在于现场。
其次,DNA检验可以用于寻找失踪人口和遗体的身份鉴定。
通过与失踪人口或遗体家属的DNA样本对比,可以确认其身份,为破案提供线索。
此外,DNA 检验还可以用于判断亲子关系和确定基因疾病的携带者。
三、DNA检验在司法公正中的意义DNA检验的应用在司法公正中起到了重要的作用。
首先,DNA检验具有高度的准确性和可靠性,通过科学的分析和技术手段,可以为司法机关提供客观、可信的证据。
其次,DNA检验能够有效地辨别人类遗传物质,避免了其他证据可能存在的误判和操纵的问题,保证了公正的司法判决。
此外,DNA检验还可以帮助纠正以往的冤假错案,使司法更加公正合理。
法医学在食物中案件鉴定中的技术手段法医学是一门研究应用科学技术来解决法律问题的学科,在刑事司法领域发挥着重要作用。
在食物中案件鉴定方面,法医学采用了各种先进的技术手段,以确保案件调查的准确性和公正性。
本文将介绍法医学在食物中案件鉴定中的一些常见技术手段。
一、DNA分析技术DNA分析是法医学中的重要技术手段之一,可以通过对食物中的DNA进行分析,来确定食物来源和人员身份。
DNA分析技术以其高度准确性和可靠性而闻名,因此被广泛应用于食物中的案件鉴定中。
通过提取食物中的DNA,法医学可以确定食物的来源,例如判断食物是否来自某个特定的生产厂家或特定的区域。
此外,DNA分析还可以用于识别人员身份,例如确定食物中是否含有某个人的DNA,从而判断其是否参与了案件。
二、毒物分析技术毒物分析技术是法医学在食物中的案件鉴定中另一个重要的技术手段。
毒物分析可以确定食物中是否存在有害物质或毒药,以及测量其含量。
这对于判断食物是否被故意污染或投毒至关重要。
法医学通过采用各种分析方法,如色谱-质谱联用技术、气相色谱技术等,可以对食物中的毒物进行准确的鉴定和分析。
三、显微镜检验技术显微镜检验技术在食物中案件鉴定中也发挥着重要作用。
通过显微镜观察食物中的微观结构和特征,可以确定食物是否被篡改或掺假。
这一技术手段可以有效地揭示食物中可能存在的非法添加物或掺假成分,帮助调查人员辨别真伪。
四、化学分析技术化学分析技术在食物中案件鉴定中同样不可或缺。
通过对食物中的化学成分进行分析,可以判断食物的组成和性质。
法医学通过采用各种化学分析方法,如高效液相色谱技术、质谱分析技术等,可以对食物中的营养成分、添加剂、农药残留等进行准确的检测和分析。
综上所述,法医学在食物中的案件鉴定中运用了多种技术手段,包括DNA分析技术、毒物分析技术、显微镜检验技术和化学分析技术等。
这些技术手段的应用,可以帮助调查人员准确判断食物的来源、内容物和品质,为案件的调查提供科学依据。
法医学在法医学职业发展规划中的应用法医学是一门综合性学科,涉及法律、医学、科学技术等多个领域,其应用延伸到刑事司法领域。
在法医学职业的发展规划中,法医学的应用起着重要的作用。
本文将从法医学在司法调查、司法鉴定、法庭审判以及法医学人才培养等方面展开论述。
一、法医学在司法调查中的应用1. 遗体解剖:法医学通过对遗体的解剖分析,可以判断死因、确定死亡时间,为破案提供科学依据。
例如,通过解剖尸体,法医学可以确定是否存在暴力侵犯,是否存在药物中毒等。
2. 病理学检测:法医学在司法调查中运用病理学检验技术,可以鉴定疾病是否为自然病变导致,还是他人故意造成的。
这对于确认死因是否与疾病相关具有重要意义。
3. 痕迹学鉴定:法医学在司法调查中还可以通过痕迹学鉴定技术,分析、鉴定作案现场的痕迹,提供物证,协助破案。
比如,通过血液痕迹、指纹、纤维、土壤等痕迹的分析鉴定,可以找到凶手,还原犯罪过程。
二、法医学在司法鉴定中的应用1. 鉴定伤情:法医学通过对伤情的鉴定,可以确定伤害的性质和程度,有助于查明案件事实,为法律裁判提供依据。
2. 遗传学鉴定:法医学运用遗传学技术,对亲子关系、亲属关系等进行鉴定,为继承纠纷、亲权纠纷等法律案件提供证据。
3. 鉴定精神病学评定:法医学起着重要的作用在对精神病患者进行鉴定,判断其刑事责任能力,为刑事司法提供科学依据。
三、法医学在法庭审判中的应用1. 出庭作证:法医学专家可以出庭作证,根据科学实验、技术手段的鉴定结果,对案件进行现场解读,为法官采纳正确的科学观点提供支持。
2. 亲证效力:法医学在法庭审判中的亲证效力很大,因为法医学证据往往是客观、科学、可靠的。
法医学可以提供无可辩驳的证据,有助于确认犯罪事实和犯罪嫌疑人的罪责。
3. 辩护意义:法医学可以为被告人提供辩护,通过鉴定、证明被告人的刑事责任能力、伤情和其他与案件有关的科学依据,有助于维护被告人的合法权益。
四、法医学人才培养的意义1. 增加专业技术队伍:加强法医学人才培养,有助于增加专业技术队伍,提高法医学的研究与应用能力。
法医学中的法医学新技术法医学是一门旨在应用科学和法律原则解决与法律案件相关的医学问题的学科。
随着科技的不断进步,法医学也在不断地发展和创新。
新技术的引入和应用,让法医学在调查和鉴定犯罪行为时具备更高的准确性和可靠性。
本文将介绍法医学领域中的一些新技术,并探讨它们在实践中的应用。
一、基因检测技术基因检测是通过对人体DNA的分析和测定,来判断个体的遗传特征和疾病倾向。
在法医学中,基因检测技术被广泛应用于刑事案件的调查和鉴定。
例如,通过对DNA在犯罪现场的留下的痕迹进行分析,可以确定涉案人员的个体特征,如血型、性别等,从而为破案提供关键线索。
二、数字化图像技术数字化图像技术是通过将物体的图像数字化,然后进行处理和分析,来获得更详细和准确的图像信息。
在法医学中,数字化图像技术被用于对尸体的病理变化进行观察和分析。
例如,通过对尸体进行CT扫描和三维重建,可以清晰地显示内脏器官的损伤情况,帮助鉴定死因。
三、毒物分析技术毒物分析技术是通过对人体组织、尸体、药物样品等进行化学分析,来确定是否存在毒物和毒物的种类和浓度。
在法医学中,毒物分析技术常被用于解决涉及毒物的死亡和中毒案件。
例如,通过对尸体组织的毒物浓度进行分析,可以确定死因是否与毒物有关。
四、手机取证技术随着智能手机的普及,手机取证技术在法医学中扮演着越来越重要的角色。
手机内存中的通话记录、短信、照片等信息,都可能成为法医学研究的重要证据。
通过对手机进行取证和分析,可以还原涉案人员的通信和活动情况,为案件调查提供线索。
五、人脸识别技术人脸识别技术是通过对人脸的图像进行分析和比对,来确认人物身份的技术。
在法医学中,人脸识别技术被用于刑事案件的嫌疑人辨认和死者身份确认。
例如,通过对涉案监控视频中的嫌疑人脸部特征进行提取和比对,可以迅速确定嫌疑人的身份。
六、脑电图技术脑电图技术是通过记录人脑中产生的微弱电流变化,来了解人脑功能活动的一种方法。
在法医学中,脑电图技术被用于判断嫌疑人或被告人的心理状态。
法医学在法医学物分析中的物检测与分析方法法医学在法医学物证分析中的物检测与分析方法法医学物证分析是刑事侦查中不可或缺的重要环节,它通过对物证的检测与分析,为破案提供科学依据。
在物证分析中,法医学所运用的物检测与分析方法至关重要。
本文将介绍几种常见的法医学物检测与分析方法。
一、显微镜检验显微镜是法医学物证分析中常用的仪器。
通过显微镜检验,法医学人员可以观察到物证上的微小痕迹,如纤维、毛发、颜色、纹理等,并从中获取相应的信息。
在显微镜检验中,法医学人员需要准确地操作显微镜,对物证进行细致入微的观察,以确定物证的特征和可能的来源。
二、色谱分析色谱分析是一种常见的物证分析方法,其基本原理是利用样品中物质在静态相和动态相的分配行为,来分析样品中的成分。
常用的色谱方法有气相色谱(GC)和液相色谱(LC)。
在物证分析中,法医学人员可以通过色谱分析方法,对物证中的毒品、爆炸物、有机物等进行检测和分析,从而找到案件的线索。
三、光谱分析光谱分析是一种能够通过测量物质与辐射的相互作用来研究物质的化学、物理性质的方法。
在法医学物证分析中,常用的光谱分析方法有红外光谱(IR)和拉曼光谱(Raman)。
通过对物证进行光谱分析,法医学人员可以非常准确地确定物证中的成分和结构,从而为案件的侦破提供重要的线索。
四、质谱分析质谱分析是一种通过测量物质的摄入能量分析其组成和结构的方法。
在法医学物证分析中,常用的质谱仪有气相质谱仪(GC-MS)、液相质谱仪(LC-MS)等。
通过质谱分析,法医学人员可以对物证中的有机物、药物、毒物等进行定性和定量分析,获取相关的信息。
五、生物学检验生物学检验是法医学物证分析中的重要方法之一。
通过对物证中的生物学标记物进行检测和分析,法医学人员可以判断物证与嫌疑人或受害人之间的关联。
常见的生物学检验方法有DNA分析、血型鉴定、酶标技术等。
这些方法的应用可以明确物证来源,并为案件的侦破提供有力的证据。
六、其他分析方法除了以上几种常见的方法外,法医学中还有一些其他的分析方法被广泛应用于物证分析中。
法医学中的法医分子生物学技术与分子解剖学法医学是一门综合性的学科,它运用科学的方法和技术对死因、死因准确程度及死后变化等进行研究探索,为法律和司法提供科学依据。
法医学的发展与时代进步密不可分,其中,法医分子生物学技术和分子解剖学的应用为法医学的发展带来了革命性的突破。
一、法医分子生物学技术在法医学中的应用法医分子生物学技术是指运用分子生物学的理论和方法,通过分析、检测和鉴定目标物的生物分子结构、功能以及相关性的技术手段。
在法医学中,法医分子生物学技术具有以下应用:1. DNA鉴定技术的应用DNA鉴定技术是法医分子生物学技术中最为重要的一项。
通过对受害人、嫌疑人等人体组织或遗留物的DNA进行提取、扩增、分离和检测,可以准确地确认身份信息,为司法案件提供科学依据。
在谋杀案、家庭纠纷等各类案件中,DNA鉴定技术的应用起到了关键作用。
2. 父权鉴定的应用父权鉴定是应用法医分子生物学技术的一项重要内容。
通过检测孩子和父母之间的亲子关系,可以准确地确定父亲的身份。
这在离婚纠纷、亲子认定等方面有着重要意义。
3. 痕量物证检测的应用痕量物证检测是通过法医分子生物学技术检测微量物质的方法,可以提取犯罪现场遗留下的微量物质,如血迹、唾液、指纹等,对其进行分析检测,从而推断犯罪嫌疑人的特征和身份。
这对于侦破和定案有着重要的作用。
二、分子解剖学在法医学中的应用分子解剖学是对人体的微观结构和组织的研究,运用现代生物学和分子生物学的技术手段,对细胞、组织和器官的结构和功能进行探索和研究。
在法医学中,分子解剖学的应用主要包括以下几个方面:1. 病理解剖学的应用病理解剖学是对病理变化的解剖学研究,通过对死者尸检和组织切片的观察、分析和鉴定,可以诊断出病理性死因。
病理解剖学在鉴定死因、推断死亡时间以及判断死者健康状况等方面发挥着重要作用。
2. 组织学与免疫组织学的应用组织学是对组织结构和功能进行研究的学科,而免疫组织学则是在组织学的基础上,通过对组织中的免疫反应进行观察和检测,从而达到诊断和鉴定的目的。
单细胞分离检验技术在法医学中的应用生物体是由单个细胞构成的,人体大约由不同组织的3.72×1013个细胞组成。
微量混合DNA的检验一直都是法医DNA检验的难题。
虽然通过计算的方法能够对混合DNA图谱拆分解释,但是对于复杂混合图谱,比如一个成分占主要时次要成分的检验,或者3人以上混合图谱的解释就非常困难。
细胞分离是一种获得单一个体DNA分型相对直接的方式,低至几个细胞甚至单个细胞的单细胞检验技术也是微量DNA检验的有效途径。
以高通量为特点的第二代测序技术(nextgenerationsequencing,NGS),能够对几十万条DNA同时测序,实现了快速、高效、低成本的测序。
近几年来,单细胞分离技术和二代测序技术结合而产生的单细胞测序(single-cellsequencing,SCS)技术将为法医DNA检验带来全新的技术手段。
1单细胞分离单细胞分离的方法很多,包括显微操作技术(micromanipulation)、激光捕获显微切割技术(lasercapturemicrodissection,LCM)、微流控技术(microfluidicplatforms)等。
当前在法医DNA检验中实际应用的技术平台有两种,显微操作技术和激光捕获显微切割技术。
1.1细胞染色因为在实际案件中获得的细胞,细胞形态并不是实验室理想的形态,为了更好的识别细胞,在普通显微镜下观察时需要对细胞实行染色。
对于上皮细胞,我们研究组尝试了不同的染色方法,通过联用显微操作技术对龙胆紫浓度梯度即时间梯度染色实行研究发现,0.5μL龙胆紫染液(0.05g/mL)加入100μL细胞悬液,5min后胞核着色即已明显,能有效提升显微捕获单细胞分离检验技术的检测效能,另外,染色时间不影响DNA结果分析7。
对于精子细胞染色,DiMartino等通过对比核固红与巴氏染色法,证实巴氏染色法不但能清晰的观察精子细胞,而且不影响下游PCR扩增8。
Sanders等通过大量的实验发现,苏木素/伊红染色法(H&E)染色后的精子细胞STR分型峰高下降幅度较小,不影响分型结果9。
也能够用荧光原位杂交技术对精子细胞的性染色体实行标记。
1.2显微操作技术显微操作技术是在显微镜下通过微毛细管吸取单个细胞。
典型的显微控制系统包含一个倒置显微镜加上一个操纵杆操作,电动精密控制平台。
其优点是操作容易实行,通过显微镜直观地分离单个细胞,成本低,主要用于较小细胞群体中的目标细胞分离。
该平台适合对案件中上皮细胞实行分离,3个口腔上皮细胞平行16次试验均可获得完整分型,甚至低至一个细胞也可得到完整分型,该方法已成功应用于一起强奸案的检验。
在该案件中,提取受害人皮肤上的唾液斑,通过在镜下分离有核的口腔上皮细胞(来自于犯罪嫌疑人)和无核角化的上皮细胞或细胞碎片(来自于受害者皮肤),成功获得嫌疑人的STR分型。
在案件中常碰到的血烟头检材,因为血液量大,常规方法很难获得烟头上唾液来源个体的STR分型,即使用单细胞分离检验时,也常常获得混合STR分型。
本课题组在显微操作标准流程的基础上实行改进,将吸取的细胞先在TNE缓冲液中清洗几次,以彻底去除血液细胞碎片和游离DNA,最终获得完整唾液来源个体的DNA分型。
也有报道将显微操作分离的方法用于精子分离,但精子细胞体积非常小,直径只有约6μm,毛细管吸取操作相对困难,下面介绍的激光捕获显微切割技术平台更加适合精子细胞的分离操作。
显微操作法存有以下几个方面的不足。
第一,因为依赖手工操作,对实验员的经验与操作水平要求较高,自动化水准较低,而且玻璃吸针脆性大,操作时易碎。
第二,耗时较长,操作繁琐。
第三,对于涂片后的检材,必须在液体环境下实行操作,容易受蒸发的影响,检材蒸干后,再补水时容易造成检材的损失,甚至带来污染。
第四,对于案件中陈旧样本,根据形态识别细胞容易出错。
1.3激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术是利用UV(320~400nm)激光切割并捕获涂于覆膜玻片上的细胞。
仪器设备较昂贵,自动化水准较显微操作技术平台高,是当前法医学应用最有效的单细胞分离方法,可用于上皮细胞、精子细胞、白细胞等不同类型的细胞分离。
当前,该平台应用较多的是性侵案中差异裂解法无法消除女性成分干扰的精斑检材,通过在显微镜下寻找并捕获精子细胞以消除女性成分。
因为精子细胞是单倍体,理论计算证明捕获15~20个未降解的精子细胞,有极大的可能性获得完整的STR分型,实验证明至少捕获30个精子细胞可获得完整的STR分型。
也有学者应用悬液荧光原位杂交(suspensionfluorescenceinsituhybridization,S-FISH)对性侵案样本实行标记,通过这种方法能够明显减少前处理操作步骤。
对于多个精子贡献者的混合精斑,差异裂解法不能将每个贡献者完全分离。
近年来,我们研究组在这方面有深入的研究。
通过联合使用激光捕获显微切割方法和低体积扩增技术,能够实现以单个精子细胞DNA 为模板,实行Y-STR扩增检测,并成功获得三人混合精斑中各个来源人的Y-STR分型。
研究组进一步使用荧光原位杂交技术标记Y型精子,特异性挑选Y型精子,通过优化组合Y-STR基因座与10个常染色体STR基因座(auto-STR),构建全新的YA-STR复合系统。
其中,Y-STR 基因座用于区分不同个体,通过组合Y-STR相同的图谱,实现个体的常染色体STR分型检验。
首次尝试将该技术应用于三人混合精斑的检验,准确地获得了三个个体的STR分型。
近年来,我们研究组还利用该平台建立了男女混合血液样本的分离检验技术方法。
该平台在寻找细胞这个步骤时耗时耗力。
有研究组开发了自动化的图像识别软件,通过度析图像中的光强、颜色和形状,可实现快速识别细胞,但是对不同种类细胞准确快速的识别仍需要进一步的研究。
1.4微流控技术最近兴起的微流控技术平台因其高通量、自动化、可有效防止污染而备受注重。
微流控装置封闭的操作空间能够有效地避免污染,微升至纳升的操作体积能够保证较高的样品浓度,同时减少试剂消耗,虽然当前还没有在法医学单细胞分离中实际应用,但未来有很大的发展潜力。
2单细胞裂解分离得到单细胞后,需将细胞裂解获得基因组DNA。
传统的法医DNA检测需要对基因组DNA实行纯化,而对于单细胞检验,为了避免DNA的损失,常略去纯化步骤,裂解后直接实行PCR扩增。
所以,裂解步骤要保证不影响后续PCR扩增反应的顺利实行。
当前主要使用蛋白酶裂解,常用蛋白酶K或Protease(德国QIAGEN公司),酶解后高温使胞内蛋白质及蛋白酶K变性失活,利于基因组DNA的释放和下游PCR反应。
对于精子细胞可加入DTT,打断二硫键,使细胞充分裂解。
3PCR扩增一个细胞中的总DNA量仅有数匹克,常规的PCR管扩增需要的细胞数目较多,我们的研究结果显示至少20个口腔上皮细胞或60个精子细胞检测到Identifiler®PCR试剂盒(美国ABI公司)中全部分型。
最近几年发展起来的微量化反应,即芯片-低体积PCR扩增(on-chiplowvolume-polymerasechainreaction,LV-PCR)系统23,24,在低至1.5μL的PCR体系中,DNA模板与引物和聚合酶结合的机会明显提升,使微量细胞甚至单个细胞实行DNA分型变为现实,不但检测的灵敏度得到提升,而且检验范围也大大拓宽了。
LV-PCR使用贝克曼公司的AG480FAmpliGridslide实行扩增,前期大量的研究都是使用该产品实行,而且实验证明该产品灵敏度、准确性可满足法医单细胞检验的要求。
另外一种最新的方法也值得注重,是在微液滴里实行PCR扩增。
首先将单个细胞和荧光标记引物结合的微珠随机扩散在1.5nL的油包裹的琼脂微流液滴中,在大量微液滴内实行平行的PCR扩增反应后,于PCR扩增管内实行二次扩增,常规毛细管电泳检测,通过对大量单个细胞实行平行9重STR检测,获得混合样本各成分的STR分型。
4数据分析单细胞检验因为DNA模板量非常低,其缺带、多带等现象经常发生,stutter峰较常规扩增强,单细胞检验的数据分析和低拷贝DNA的分析方法类似,需平行扩增,综合多次结果获得最终的STR分型。
一般来说至少需获得5次有效分型(获得13个基因座以上的结果)28,重复3次及以上的位点才能确认为有效位点。
5单细胞测序在二代测序技术和全基因组扩增技术(wholegenomeamplification,WGA)发展的基础上,2011年,Navin等人首次发明了单细胞测序(single-cellsequencing,SCS)技术,测定了人体单个细胞的基因组DNA。
单细胞测序的文章呈逐年递增状态,从2011~2014年,由5篇文章上升至近30篇,涉及生物学多个领域,发表于生物学顶级期刊上。
2013年《,科学》杂志将单细胞测序列为年度领域榜首《,自然方法》杂志将单细胞测序列为2013年年度最重要的方法学进展。
5.1全基因组扩增技术因为单个细胞DNA含量有限,需实行全基因组扩增才能满足二代测序的最低DNA量。
当前,已有多种以单个基因组为模板的全基因扩增技术,简称寡核苷酸引物PCR技术(degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR)和多重置换扩增技术(multipledisplacementamplification,MDA)。
其中DOP-PCR方法覆盖率低,但可获得准确的拷贝数。
MDA方法是在恒温下利用具有强模板结合的phi29DNA聚合酶和六聚物实行链置换扩增反应。
Phi29DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性,并且具有特殊的多重置换和连续合成特性,产生的DNA片段较大,约为50~100kb,能够覆盖基因组的90%以上,和DOP-PCR方法一样也会产生不同区域扩增不平衡性,MDA方法产生的不平衡性不具有重复性。
2012年,首次报道了基于多次退火环状循环的扩增技术(multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles,MALBAC),该方法结合MDA扩增技术和PCR扩增技术的优势,利用特殊设计的引物,巧妙地使扩增子的结尾通过互补而成环,进而在一定水准上防止了基因组DNA的指数性扩增,明显降低了扩增偏倚性,并显著提升覆盖度,但是该方法使用Bst聚合酶,没有校错活性(proofreadingactivity)。
现有的商业化试剂盒各项参数见表1。
全基因组扩增技术虽然仍然会有基因缺失等问题,但是相信随着时间的推移和技术的进步,扩增的准确性会逐步提升。
5.2二代测序技术对单细胞全基因组扩增后实行二代测序。
二代测序技术具有快速、高效、低成本的优点。