鸡毒支原体的分离与鉴定

鸡毒支原体病的诊断和防治措施作者：丁爱君，王海兰，李宁，李玉燕，来庆梅，韩艳娇，李月，刘松来源：《家禽科学》2021年第07期中圖分类号：S858.31 文献标识码：C 文章编号：1673-1085（2021）7-0022-03鸡毒支原体病也称鸡慢性呼吸道病（CRD），是由鸡毒支原体（MG）引起的一种以呼吸道症状为主的传染性呼吸道病。

该病病程长，发病率高，死亡率低。

临床上主要以呼吸道症状为主，表现为流鼻涕，面部肿胀，咳嗽，严重时张口呼吸或呼吸困难，有的可明显地听到湿啰音。

剖检可见鼻腔、气管卡他性渗出物，气囊炎、窦炎或者病变器官干酪样渗出。

随着养殖企业设备设施科技化、养殖规模扩大化的不断发展，养鸡企业的饲养模式也发生了很大改变，同时鸡群饲养密度也在提高，鸡毒支原体引起雏鸡的慢性呼吸道疾病发病率也越来越高，其对雏鸡健康的危害性也更加突出，主要使雏鸡生长缓慢、饲料利用率降低和降低产蛋鸡产蛋率。

鸡毒支原体可以水平传播，也可通过种蛋垂直传播给后代，造成养殖企业的重大经济损失，受到养殖场的普遍关注。

1 病原学特征鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）又称鸡败血性支原体，为很小的原核生物，大小介于细菌与病毒之间，区别于细菌的是没有细胞壁，只有细胞膜包裹。

MG的培养需要一个复杂的培养基，一般培养基不能生长。

MG对外界理化因素的抵抗力较弱，多数常用的化学消毒剂均对其有效。

2 流行特点该病在寒冷的冬春季节多发，其他季节散发。

环境因素改变或者鸡群应激时诱发该病或者加重呼吸道病症，增加死淘率。

只有鸡毒支原体感染时，鸡群中死亡率偏低，而大肠杆菌与鸡毒支原体的协同致病对鸡群的危害尤为严重，造成较高的死亡率。

其他细菌如绿脓杆菌、副鸡嗜血杆菌、沙门氏菌等的混合感染也能加重支原体感染症状。

鸡毒支原体主要通过水平传播和垂直传播感染易感鸡群。

感染的种鸡通过种蛋将鸡毒支原体垂直传给后代雏鸡，经蛋传播的雏鸡发病率与种鸡感染鸡毒支原体的严重程度和排毒有关。

广东规模化鸡场死鸡胚中鸡毒支原体的分离鉴定、致病性及药物敏感性陈玥彤;刘晓涵;王芷洋;赵宇馨;周铁忠;胡增金;朱悦;王少辉;田明星;丁思羽;祁晶晶;于圣青【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2024(55)1【摘要】旨在从广东某规模化鸡场死鸡胚进行鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的分离,并进行遗传进化分析、致病性及药物敏感性研究。

本研究从广东某规模化鸡场的带菌死胚卵黄组织中分离禽支原体,通过菌落观察、血清学试验、16S rRNA支原体通用引物序列鉴定等方法,对分离的菌株进行种属鉴定,同时将分离的毒株对鸡胚和SPF鸡进行攻毒试验及抗菌药物敏感性试验。

结果显示:显微镜下菌落呈典型的“荷包蛋”状。

平板凝集试验显示其与MG阳性血清有凝集反应,与MS阳性血清不反应;16S rRNA序列测序发现各分离株与MG相似性达99.9%,因此确定分离株为MG。

将各分离株感染7日龄SPF鸡胚,结果显示感染鸡胚大多于临近出壳时死亡;感染3周龄的SPF鸡,3周后解剖发现鸡气囊发生显著病理变化,说明其具有较强致病力;药物敏感性试验结果显示,5株分离株对盐酸沃尼妙林、多西环素、泰万菌素及泰妙菌素有较高敏感性,对替米考星、泰乐菌素、恩诺沙星、红霉素、吉他霉素、林可霉素呈现出不同程度耐药性。

综上,从广东某规模化鸡场死鸡胚中成功分离到5株MG分离株,各分离株均可引起红细胞凝集,导致鸡胚死亡,对SPF鸡可引起典型的气囊炎症状,且对多种药物存在不同程度耐药性。

本研究为临床MG的分离鉴定及用药选择提供了可参考的技术方法及指导,为MG 攻毒模型建立提供了研究基础。

【总页数】10页(P290-299)【作者】陈玥彤;刘晓涵;王芷洋;赵宇馨;周铁忠;胡增金;朱悦;王少辉;田明星;丁思羽;祁晶晶;于圣青【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所;锦州医科大学畜牧兽医学院;山东畜牧兽医职业学院;扬州优佳创生物科技有限公司【正文语种】中文【中图分类】S852.62【相关文献】1.鸡毒支原体的分离鉴定及AA肉种鸡场慢性呼吸道病的流行状况分析2.鸡毒支原体与新城疫病毒相互关系的研究Ⅰ、鸡毒支原体与鸡新城疫病毒在鸡胚中的相互影响3.鹅源鸡毒支原体分离鉴定与致病性研究4.不同地区鸡毒支原体的分离鉴定及药物敏感性研究5.乌鲁木齐市某鸡场致病性大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性试验因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鸡毒支原体治疗方案简介鸡毒支原体（avian mycoplasmosis）是由鸡毒性肺炎支原体引起的一种鸟类传染病。

该病主要通过呼吸道传播，并能引起鸡只的严重呼吸系统症状和生产性能下降。

针对鸡毒支原体的治疗方案是保护鸡只的生命和健康，减少经济损失的重要措施。

诊断诊断鸡毒支原体感染需要通过以下方法：1.临床症状观察：注意鸡只是否出现呼吸困难、打喷嚏、鼻流清涕等不适症状。

2.病原学检测：采集鸡只呼吸道分泌物样本，进行细菌培养或PCR检测，以确认是否存在鸡毒支原体感染。

3.血清学检测：通过鸡只血清中的抗体检测，可以确定鸡毒支原体感染的存在。

治疗方案鸡毒支原体的治疗方案主要包括药物治疗和预防措施。

药物治疗目前常用的药物治疗方案包括以下几种：1.抗生素治疗：可以选择利福平、特比菌素等广谱抗生素进行治疗。

药物的使用剂量和时间应按照兽医师的建议进行调整。

2.支原体疫苗：可以使用鸽脑综合症疫苗进行预防和治疗，该疫苗可以减轻病情和提高鸡只的免疫能力。

3.支原体生物制剂：可以使用支原体溶菌酶进行治疗，该制剂可以降低病毒对鸡只呼吸道的损害。

预防措施除了药物治疗，以下预防措施也是重要的防控手段：1.强化饲养环境的管理：保持鸡舍的通风、卫生和温湿度适宜，减少鸡只之间的近距离接触，从而减少病原体的传播机会。

2.疫苗接种：及时接种支原体疫苗，提高鸡只的免疫力，减少感染的风险。

3.快速隔离和治疗：一旦发现感染，需要及时隔离患病鸡只，并给予适当的治疗，以防止疫病的扩散。

4.加强饲养管理：保证鸡只的营养均衡，增强其免疫力和抵抗力，减少感染的可能性。

结论鸡毒支原体的治疗方案包括药物治疗和预防措施，如抗生素治疗、支原体疫苗接种和饲养管理等。

药物治疗可以通过广谱抗生素的使用和支原体溶菌酶的应用来抑制病菌的生长和繁殖。

预防措施主要包括饲养环境管理、疫苗接种和快速隔离等方法，以预防疾病的发生和传播。

通过综合应用这些治疗方案和预防措施，可以有效控制鸡毒支原体感染，降低经济损失，并保护鸡只的生命和健康。

鸡毒支原体感染的诊治方法鸡毒支原体的诊治方法山西省太原市万柏林区化客头街办畜牧兽医站殷玉仙山西省动物疫病预防控制中心张娟支原体又称霉形体,是一类缺乏细胞壁,仅由胞浆膜包裹,是具有自体繁殖能力和合成自身大分子微生物中体积最小,构造最简单的原核微生物.广泛存在于人,动物,植物,昆虫体内,在兽医学上是一类重要的病原微生物,主要侵害呼吸道和生殖系统,还能引起关节炎,乳腺炎以及眼部感染.禽支原体中,最常见的有鸡毒支原体,火鸡支原体和滑液支原体.鸡毒支原体感染也称为慢性呼吸道疾病,主要表现为气管炎,气囊炎等症状.1.病原鸡毒支原体在分类学上属于软皮体纲支原体目支原体科支原体属.到目前只发现1个血清型,一般分离株主要侵犯呼吸道.鸡毒支原体有一般支原体形态特征,格兰3.预防对危险因素及早发现有助于腹泻的早期诊断和预防.如能早期诊断并配合防治措施,犊牛腹泻的死亡率会得到有效控制.规范疫苗的接种,给怀孕期的母牛注射用当地流行的致病性大肠杆菌株制成的菌苗,犊牛初生12h后投喂呼吸道,肠道病毒疫苗和冠状病毒I型疫,2—4周龄时接种牛病毒性腹泻症菌苗,另外对于刚出生的犊牛,可以尽早投服预防剂量的抗生素药物,同时给犊牛补铁补硒,使其产生主动免疫,对于防止本病的发生具有一定的效果.在生产实践中应注意坚持对牛舍,牛栏,牛床,运动场和周围环境用5%福尔马林彻底消毒;防止犊牛受潮和寒风侵袭,乱饮脏水,以减少病原菌的入侵机会;冬春季节注意保暖防寒,防潮湿,勤换垫草;对怀孕母牛要加强产前产后的饲养和护理,要引导犊牛及时吮吸初乳,犊牛饲料要配比适当,断乳期饲料不要突然变化.发现病牛要及时与健康犊牛完全隔离,良好的饲养管理措施是降低犊牛腹泻的最好办法.4.治疗当犊牛刚出现腹泻症状时应减少牛奶喂量,同时补充电勰质,缓解酸中毒,要将口服补液盐加温水调至36aI=一38~C给犊牛饮用,饲喂助消化药,并适当服用抗菌药物.当腹泻严重并有脱水症状时应用葡萄糖盐溶液加抗菌药物, 维生素C静脉输液进行治疗.2011.O2总第207期氏染色阴性,发酵葡萄糖,不水解精氨酸,不从尿素取得能源,对毛地黄皂苷敏感,还原四氮唑,吸附鸡红细胞,溶解绵羊红细胞,不形成膜与斑,具有缓慢运动的能力.鸡毒支原体致病力因株系不同而不一致.有致病力的株经过培养基中传代会很快地失去致病力.即使是有致病力的株,在自然感染的鸡体上也经常不引起症状.有致病力的鸡毒支原体经过卵黄囊接种鸡胚可能导致鸡胚矮小, 水肿,出血,死亡.鸡毒支原体对环境抵抗力弱,离开禽体失去活力.对干热敏感,45cI=1h或50'U20min即被杀死,在水中15℃存活8～18d,4~C存活1020d以上.在阳光紫外线直射下会很快失去活力.一般消毒药可很快将其杀死.对链霉素,四环素族,氯霉素,红霉素,泰乐菌素敏感,对新霉素,多粘菌素,醋酸铊,磺胺类药物有抵抗力,容易产生耐药性.2.流行特点鸡毒支原体感染流行于全世界,我国各地都有发生.根据血清学调查,感染率平均在70%～80%之间.(1)支原体传播方式①水平传播:随呼吸道分泌物排出,通过飞沫和尘埃经呼吸道感染.被支原体污染的饮水, 饲料,用具也能传播病原.②垂直传播:感染鸡将病原通过卵传染给下一代.用带有支原体的鸡胚制作弱毒苗时,易造成疫苗污染而散播该病.(2)影响鸡毒支原体感染流行的因素①鸡毒支原体感染力随鸡龄增长而减少.小鸡比成年鸡易感,病情表现也更严重.②营养不足.特别是蛋白质和维生素缺乏.③新城疫,传染性支气管炎等呼吸道病毒感染及大肠杆菌混合感染会使呼吸道病症状明显加重,当鸡毒支原体在体内存在时,弱毒疫苗气雾免疫也可能激发该病.④环境作用.寒冷,拥挤,通风不良,潮湿等可促进该病的发生并降低鸡的抵抗力.3.临床症状该病常年发病,寒冷季节居多.人工感染潜伏期为4～21d,自然感染潜伏期的长短与鸡的日龄,品种,菌株及有无并发感染有关.有的感染鸡群不出现症状或直到有并发感染或有诱发因素出现时, 才表现临床症状.幼龄鸡发病时,症状较典型,表现为浆液或浆液黏液性鼻液,使鼻孔堵塞妨碍呼吸,摇头,喷嚏,咳嗽,窦炎,结膜炎和气囊炎.当炎症蔓延至下呼吸道时,则喘气和咳嗽更为显着,并有呼吸哕音.到了后期因鼻腔和眶下窦中蓄积渗出物而引起眼睑肿胀.病鸡食欲不振,生长停滞.肉鸡生长发育缓慢或停顿,逐渐消瘦,经济损失显着.蛋鸡多表现为产蛋率下降,通常会维持在一个低的产蛋水平上,会持续几十天至几个月不发生变化,往往会被养鸡人员所忽视.受精率和孵化率下降,出雏率下降到40%左右,死胚和弱胚增多,且弱雏的气囊炎发生率高.如果发生输卵管炎则可能产出软皮蛋.如果没有并发感染其他疾病,一般死亡率不高,如伴有其他病毒性和细菌性疾病,特别是伴有大肠杆菌感染时,死亡率较高.4.病理变化病变主要出现在呼吸道,有时也出现在输卵管.单纯感染鸡毒支原体的病鸡,鼻孔,鼻窦,气管和肺出现比较多的黏性液体或卡他性分泌物,气管壁轻度水肿.随感染的发展气囊逐渐浑浊,气囊壁出现干酪样渗出物,开始如珠状,严重时成堆成块.眶下窦出现炎症,眶下窦呈现黏性和干酪样渗出物.自然感染的病例多为混合感染,如有大肠杆菌,传染性支气管炎病毒参与,则容易见到纤维素性肝周炎和心包炎.组织学变化较为特征,被侵害的组织由于单核细胞浸润和黏液腺的增生而使黏膜显着增厚,黏膜下常见有局灶性淋巴组织增生区(淋巴滤泡反应),以及淋巴细胞,网状细胞和浆细胞浸润.呼吸道的组织损伤表现为纤毛上皮的肥大,增生和不同程度的水肿.在肺部除了肺炎和淋巴滤泡反应外,有时还出现肉芽肿.实验性感染鸡可以造成输卵管炎,并有千酪性分泌物,但自然感染病例并不多见. 5.诊断根据流行病学,临床症状和病理变化可以作出初步诊断.在临床上应注意和禽流感,传染性鼻炎,传染性支气管炎,传染性喉气管炎,黏膜型鸡痘以及维生素缺乏症等相区别.要确诊鸡群是否感染了支原体需作病原分离鉴定和血清学试验.(1)血清学反应常用的血清学反应是平板凝集反应,试管凝集反应,血凝抑制试验和酶联免疫吸附检测(EUSA).(2)病原支原体的分离分离病原支原体是可靠的诊断方法.分离病原时必须有适于鸡毒支原体生长发育的培养基.通常取气管或气囊的渗出液,鼻甲骨,肺的悬浮液或鼻窦的渗出液均可接种培养基,并用抗鸡毒支原体阳性血清对分离物进行鉴定.常用的鉴定方法有生长抑制试验, 代谢抑制试验和表面荧光抗体试验等,也可以利用血细胞吸附抑制试验进行快速鉴定.(3)鉴别诊断由于鸡毒支原体病的外表症状并不是特有的,要注意与新城疫,传染性支气管炎,传染性鼻炎, 滑液支原体感染以及鸡霍乱的鉴别诊断,鉴别诊断时有时可以应用血清学方法,有时可用病原分离的方法.6.预防与治疗目前国内还没有培育成无鸡毒支原体感染的种鸡群,可以说所有鸡场都存在着鸡毒支原体感染,因此必须加强饲养管理,经常清扫,清毒,注意鸡舍的通风换气,及时接种疫苗,预防其他呼吸道疾病的发生.避免应激的诱因,饲料营养全价,采用"全进全出"的饲养方式,在生产实践中可以采取下述措施减少损失或净化该病.(1)疫苗免疫接种免疫后可有效地防止该病的发生和种蛋的垂直感染,并减少诱发其他疾病的机会,增加产蛋量.弱毒疫苗既可用于尚未感染的健康小鸡,也可用于已感染的鸡群,免疫保护率在80%以上,免疫持续时间达7 个月以上.灭活疫苗以油佐剂灭活疫苗效果较好,多用于蛋鸡和种鸡.(2)清除种蛋内鸡毒支原体经卵传播是鸡毒支原体的一条重要的传播途径,阻断这条途径是培育无鸡毒支原体鸡群的基础.可以采用抗生素处理和加热法来降低,消除种蛋内支原体.①抗生素处理法:将孵化前的种蛋加温到37℃而后立即放人5~C左右的对鸡毒支原体有抑制作用的抗生素溶液中1520rain;也可以将卵放在密闭容器抗生素溶液中,抽出部分空气,再放人空气使药液进入卵内;或将抗生素溶液注射人卵内.这类方法的缺点是:清除卵内支原体不彻底,增加了某些对抗生素有抗力的细菌的污染机会和影响卵的孵化率.②加热法:对孵化器中的种蛋压人热空气,使温度在12～14h内均匀上升到46.1℃, 后转入正常孵化,可以有效地消灭种蛋内鸡毒支原体,只要温度控制适宜,对孵化率无明显影响.对鸡进行其他传染性疾病进行预防接种活疫苗时,应严格选择无鸡毒支原体污染的疫苗.(3)建立无鸡毒支原体感染鸡群利用鸡毒支原体对不利环境,药物和温度的脆弱性,可以培育无支原体感染鸡群.无鸡毒支原体感染鸡群每只母鸡比普通鸡群鸡平均多生产0.5一lkg蛋.培育无鸡毒支原体感染鸡的主要程序:①选用对支原体有抑制作用的药物降低种鸡群鸡毒支原体的带菌率和带菌强度;②用45~C处理种蛋14h,消灭蛋中的鸡毒支原体;③种蛋小批量孵化,每批100～200 只,减少出雏时相互传染机会;④小群分群饲养,定时进行血清学检查,一旦出现确实的阳性反应鸡,立即淘汰小群.在进行全部程序时,要做好孵化箱,孵化室,用具,房舍等的消毒和隔离工作,防止外来感染.这种程序育成的鸡群, 在产蛋前全部进行一次血清学检查,必须是无阳性反应群才能用作种鸡.当完全阴性反应亲代鸡群所产种蛋,不经过药物或热力处理孵出的子代鸡群,经过几次检测都未出现阳性反应鸡后,可认为已建立无支原体感染鸡群. (4)治疗病初可以试用对鸡毒支原体有抑制作用的抗生素进行治疗.土霉素和四环素的用量为每吨饲料400g;泰乐菌素为每4.5L水内加2—3g;北里霉素为每吨饲料内300～500g;泰妙菌素饮水含量为120—500mg/L, 不论饮水或饲料拌服都要连用几天.有条件的可进行药物敏感试验.当并发其他疾病时,要注意对并发症的治疗.才能取得好的效果.。

Experimental research | 试验研究1.2 方法为进一步验证分离得到的支原体的致病性，分别使用2种不同浓度的菌液进行攻毒试验，每组分别10枚鸡胚。

并对每组进行再次划分，划分为试验组和对照组，试验组分别接种菌液，对照组接种生理盐水，每个试验组接种菌液0.3 mL，对照组接种生理盐水0.3 mL。

接种结束后，放置在2个孵化箱中分别孵化，每天观察鸡胚的生长情况及死亡情况。

支原体样品试验主要选择使用最低抑菌浓度检测法。

在96孔细胞培养板的2排24孔中各添加100 μL的支原体液体培养基培养物，将上述已稀释的1 280 μL/mL的无菌溶液滴加到第1孔，充分混合均匀后取100 μL滴加到第2个孔，以此类推添加到第21个孔，舍去多余的液体。

将稀释到105 μL/mL的菌液与细胞板的第1到第21个孔中各添加100 μL，第22个孔作为阳性对照。

第23个孔加入100 μL已经稀释到1 280 μL/mL无菌药液作为抗菌液对照组，密封细胞板持续培养，温度控制37 ℃，当阳性对照变成黄色抗菌液，对照孔不发生颜色变化后为止。

未发生颜色变化的最低药物浓度，作为该菌药的抑菌浓度[2]。

2 结果2.1 鸡胚死亡情况鸡胚接种毒支原体后，每天对鸡胚的生长情况进行认真细致的检查，并记录鸡胚的死亡情况。

其中大剂量接种组的5只鸡胚在接种7 d后陆续死亡，接种第21 d 后全部鸡胚死亡，死亡率高达100%。

低剂量接种的鸡胚在接种10 d左右开始死亡。

接种到第21天停止死亡，死亡率70%。

2个试验组没有接种菌液的鸡胚能正常孵化。

试验组的鸡胚大多数不能正常孵化。

通过对病变的鸡胚组织进行进一步解剖发现，未孵化的鸡胚存在气管支气管内部白色栓塞。

孵化出来的弱雏死亡后，解剖发现存在支气管和气囊纤维素性渗出物附着。

其中大剂量接种的鸡胚病理变化最为明显，几乎整个气囊布满了黄白色的干酪样渗出物，气囊严重增厚粗糙。

2.2 药敏试验药敏试验发现研究选择的78%磷酸替米考星、98%延胡索酸泰妙菌素、98.5%盐酸沃尼妙林、98%酒石酸泰勒菌素、酒石酸吉他霉素、89.5%盐酸林可霉素、50%可溶性氟苯尼考、98%强力霉素、99%的盐酸恩诺沙星、98%的盐酸诺氟沙星、90.5%的盐酸左氧氟沙星、盐酸大观霉素、硫酸丁胺卡那霉素、70%的水溶性阿奇霉素等抗生素中，敏感抗生素包括盐酸沃尼妙林、盐湖索酸泰妙菌素、强力霉素，中敏抗生素是盐酸大观霉素、水溶性氟苯尼考、酒石酸泰乐菌素，上述几种抗生素抑菌浓度分别为1015、1013、1012、1010、109、109。

禽支原体病诊断技术禽支原体病(avian mycoplasmosis)又称鸡败血支原体(mycoplasm gallisepticum，简称MG)，常引起鸡的慢性呼吸道疾病。

MG也可感染火鸡，引起传染性窦炎。

世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE]将本病例B类动物疫病，我国将其列为二类疫病。

本标准规定的方法与OIE《诊断试验与疫苗标准手册》推荐相应方法一致。

本标准的附录A为规范性附录。

本标准由农业部畜牧兽医局提出。

本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:农业部动物检疫所。

本标准起草人:郭福生、尹燕博、蒋正军、孙淑芳、陆明哲、龚振华。

1范围本标准规定了禽支原体(MG)分离鉴定和快速血清凝集试验(RSA)的技术要求。

本标准适用于鸡和火鸡及其产品MG的检测。

2禽支原体的分离和鉴定2.1材料准备2.1.1培养基制备见附录A(规范性附录)。

2.1.2兔抗MG阳性血清和抗兔荧光抗体结合物。

2.2分离2.2.1采样活禽从鼻腔、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样。

死禽从鼻腔、眶下窦、气管或气囊采样，也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。

对于鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。

2.2.2样品的处理采样后应尽快培养。

如须运输，小块组织置于支原体培养基中，拭子在培养基中用力搅拌数次，将培养基运回实验室尽快培养。

2.2.3接种将样品0.2mL接种于1.8mL支原体液体培养基中，依次10倍稀释至10-3，密封，37℃培养。

同时将样品接种于支原体固体培养基中，置于含5%～10%二氧化碳(CO2)培养箱中培养。

2.2.3.1每天检查液体培养基酸碱度，一旦发现pH值变化，立即接种于固体培养基中培养。

若培养基酸碱度没有变化，每隔3d～5d盲传一代，共传3代，培养10d后接种于固体培养基上培养。

鸡毒支原体操作细则一、物品准备1 2万毫升瓶：6个，洗净，装1.6万毫升溜水，消毒后备用。

2 1.5万毫升瓶：20-25个，洗净，干烤消毒（瓶口包扎纸头）。

3 100毫升注射器：5个（带长针头）；5、10毫升注射器各5个（普通针头）。

10毫升吸管若干支。

4 棉塞：每个转瓶一个，约30个左右。

5 人用青霉素钠4000单位。

6 约6000毫升犊牛血清（灭活）。

7 500毫升1%的苯酚红。

8 接种用喷灯：一台；酸度计：一台。

9 生理盐水1000毫升二、溶液的配制：取消毒无离子水若干瓶，将鸡毒支原体合成培养基（约含3%比例）加入，摇匀后加入1%苯酚红至含量0.1%，然后用5NNaOH溶液调节PH至7.8，最后将培养基溶液瓶用棉塞包扎，15磅30分高压消毒，取回后放温室备用。

三、接种：取鸡毒支原体菌种、青霉素GNa、灭活牛血清，喷灯护口逐瓶分别加入菌种至含量1%、青霉素GNa含400单位/ml、牛血清含量10%，摇匀包扎放温室37℃水平放置静止培养。

注：留部分培养基、青霉素GNa、灭活牛血清作测毒用和成品检验用。

四、收毒：培养过程中根据PH变化分阶段抽取PH检测样品，用酸度计测定培养菌液的PH，当PH达到6.5—6.7时停止培养，可暂时放15---25℃保存，待测毒结果出来后配苗。

五、测毒：取培养菌液用培养基（加灭活牛血清、青霉素GNa）10倍系列稀释至10-12-10-14放置于37℃温室静止培养观察3-4天，测定PH≤6.7时判定结果。

测毒小管达到10-8管判定合格，另外，培养菌液放37℃温室及0-4℃两种方式各保存5天。

PH值变化情况：0-4℃无明显变化，37℃温室保存的PH可达6.2以下。

六、无菌检验和纯粹检验：取放置室温5天的培养菌液姬姆萨染色呈浅染球状（弱阴性球形），均一、纯粹。

用普通培养基和合成培养基分别接种培养菌液，温室培养4-5天，普通培养基上不生长，在合成培养基上生长。

七、配苗：将苗与小分子明胶保护剂按3.1：0.4配苗，3.5ml分装冻干，然后作无菌检验八、成品检验：备注：关于鸡毒支原体测毒结果判定1、用适宜培养基作为稀释液，每个小管内加入4.5ml适宜培养基。