RT-PCR个人总结
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pcr试验员年终总结
尊敬的领导:
今年是我作为PCR试验员的第二年工作,在这一年里,我努
力学习和改进自己的实验技术,取得了一定的进步。
现将我的年终总结如下:
技术能力方面,我通过积极参加培训、学习相关文献和经验总结,不断掌握和提升PCR技术操作的熟练度。
在实验操作中,我能够熟练操作PCR仪器,合理设置PCR反应体系,并且能
够及时解决出现的常见问题。
在实验结果分析和评估上,我能够准确判断PCR扩增的结果,对实验数据进行合理解释和统
计分析。
对实验管理和质控方面,我积极参与实验室的质控体系的建设和执行,确保实验室的工作质量和数据的准确性。
我严格按照实验室的规范和标准操作,保证实验环境的洁净和PCR试剂
的质量。
同时,我也定期参加实验室组织的质量评估和学术讨论会,积极向他人学习和交流,提高自己的实验能力和学术水平。
在团队合作方面,我积极与其他实验员进行沟通和合作,相互配合完成日常实验任务。
我尊重他人的意见和建议,乐于帮助他人,保持良好的团队合作氛围。
在工作中,我也时刻关注实验室的工作进度和效率,积极提出改进建议,以达到更高的工作效果。
在问题处理和解决能力方面,我能够快速发现问题的源头,分析问题的原因,并积极采取解决措施。
同时,我也能够及时向上级领导和同事汇报情况,并充分听取他人意见和建议,共同解决问题。
虽然在工作中我取得了一些成绩,但我也意识到仍有许多需要提升和改进的地方。
明年,我将继续努力,不断提高自己的技术水平和工作能力,为实验室的发展做出更大的贡献。
谢谢领导对我的支持和关怀!
此致
敬礼
PCR试验员。
pcr工作总结个人
PCR工作总结
在过去的一段时间里,我参与了PCR实验的进行并进行了相
关数据分析。
以下是我的个人总结:
1. 设计合适的引物和探针: 在PCR实验中,选择合适的引物和
探针非常重要,因为它们直接影响到反应的特异性和效率。
我在设计引物和探针时充分考虑了目标序列的特性,并通过生物信息学工具进行了引物的有效性和特异性检验。
2. 优化PCR反应条件: 我进行了一系列的试验,优化PCR反
应条件以提高扩增效率和特异性。
我尝试了不同的温度梯度、不同反应体系的比例和浓度,并通过监测反应产物的大小和纯度评估了优化效果。
3. 建立PCR实验流程: 我详细记录了PCR实验的步骤和条件,并建立了实验流程,以确保实验的重复性和可靠性。
我还优化了DNA提取和PCR反应的操作步骤,减少了潜在的污染和误差。
4. 数据分析和解释: 在PCR反应完成后,我对产生的数据进行
了分析和解释。
我使用统计学方法评估了扩增效率,并将结果与已知的参考数据进行了比较。
通过对扩增曲线和产物的大小进行分析,我能够确定目标序列的特异性和数量。
5. 结果和结论: 基于实验结果和数据分析,我得出了一些结论,
并提出了相应的建议。
我希望进一步优化PCR反应条件,尽量提高扩增效率和特异性。
另外,我还发现一些PCR反应中的问题,并提出了改进的措施。
总的来说,我的PCR工作经验使我对PCR技术有了更深入的理解,并提高了实验设计、操作和数据分析的能力。
在未来的工作中,我将继续应用这些技能,进一步拓展和应用PCR技术。
pcr个人工作总结全程在过去的工作周期中,我在PCR项目中承担了一系列的责任和任务。
在全程参与项目的过程中,我经历了需求分析、设计、开发、测试和部署等各个阶段,并取得了以下成绩和经验总结。
首先,在需求分析阶段,我主要负责与项目所有者和使用者沟通,了解其需求和期望。
通过与他们的深入交流,我能够准确理解他们的需求,并将其转化为具体的功能和需求文档。
同时,在这个阶段,我也深入研究了市场的竞争情况和用户的使用习惯,从而为项目提供了更多的参考和优化建议。
其次,在设计和开发阶段,我主要负责搭建项目的基本框架和架构,并编写核心代码。
在设计阶段,我参考了现有的类似解决方案,并根据项目的实际需求进行了一些微调和优化。
在开发阶段,我采用了敏捷开发的方法,通过迭代的方式,不断完善系统的功能和性能。
在这个阶段,我充分发挥了自己的编程能力和创造力,通过有效的代码重用和模块化设计,提高了开发效率和代码质量。
然后,在测试阶段,我负责编写测试用例,并进行系统测试和性能测试。
为了保证系统的稳定性和性能,我根据项目的需求和优化目标,选择了适当的测试手段和工具,进行了充分的测试。
通过测试,我发现了一些潜在的问题和性能瓶颈,并进行了针对性的调整和优化。
通过测试的持续执行,我确保了系统的质量和可靠性。
最后,在部署阶段,我负责将系统部署到生产环境,并进行了最后的功能验证和性能测试。
通过合理的分配和配置资源,我保证了系统的良好运行和稳定性。
在部署过程中,我还与运维人员进行了密切的合作,确保系统能够顺利地与其他依赖系统进行集成。
通过这次PCR项目的全程参与,我积累了丰富的经验和技能。
首先,我对项目管理和团队合作有了更深入的了解。
在项目的规划和执行过程中,我学会了如何与他人进行有效的沟通和协作,以及如何合理分配和管理项目资源。
其次,我提升了自己的技术能力和解决问题的能力。
通过不断学习和实践,我熟练掌握了PCR技术和相关工具的使用,并找到了一些解决问题的方法和技巧。
PCR年度考核表个人工作总结一、前言过去的一年,对我来说是充实而意义非凡的。
作为一名PCR实验室技术人员,我始终秉持着敬业、严谨、专业的工作态度,为医院提供准确、高效的核酸检测服务。
在此,我将对自己过去一年的工作进行总结和反思,以期在未来的工作中不断进步。
二、工作回顾1. 思想政治方面过去的一年,我始终坚持贯彻党的基本路线方针政策,认真学习国家卫生健康委员会和医院的相关政策法规,严守职业道德,廉洁自律。
在日常工作中,我严格遵守PCR实验室的操作规程,确保实验过程的准确性和可靠性。
2. 业务技能方面在业务技能方面,我通过参加培训、自学和交流,不断提高自己的理论水平和实践能力。
一方面,我熟练掌握了PCR技术的原理和方法,能够独立完成各种核酸检测任务。
另一方面,我积极参与科研项目,开展新技术和新方法的研究,为实验室的创新发展贡献力量。
3. 工作质量方面在保证工作质量方面,我始终坚持以病人为中心,以医疗质量为核心,严格按照国家标准和医院要求开展核酸检测工作。
在日常工作中,我认真对待每一个样本,确保检测结果的准确性和可靠性。
同时,我积极参加实验室的质量控制和内部培训,提高自己的业务水平。
4. 团队协作方面在团队协作方面,我始终保持团结友爱的态度,与同事之间相互支持、相互帮助。
在遇到困难时,我积极寻求同事和领导的帮助,共同解决问题。
同时,我积极参与实验室的各项活动,为实验室的和谐氛围贡献力量。
三、工作反思过去的一年,我在工作中取得了一定的成绩,但同时也暴露出了一些问题。
首先,我在业务知识方面还有待提高,需要进一步加强学习,充实自己的专业知识。
其次,我在时间管理方面还有待加强,需要更合理地安排工作和生活,提高工作效率。
最后,我在团队协作方面还有待提升,需要更加注重与同事的沟通与交流,共同提高实验室的整体实力。
四、展望未来展望未来,我将继续保持敬业精神,严谨态度,不断提升自己的业务能力和综合素质。
一方面,我将积极参加各类培训和学习,充实自己的专业知识,提高自己的学术水平。
pcr个人年终总结今年即将过去,回首过去的一年,我在工作中经历了许多挑战和成长。
通过不断努力和学习,我取得了一定的成绩并积累了宝贵的经验。
在这篇个人年终总结里,我将就过去一年的工作进行回顾和总结,分享我的收获和不足,并对未来进行展望和规划。
一、工作回顾与成果在过去的一年中,我作为PCR(职位)职业角色,主要负责以下几个方面的工作:(列举具体工作内容)。
在这些工作中,我将专业知识和技能应用到实际工作中,取得了以下成果:1.(举例)通过对数据的精准监测和分析,我成功提高了产品的质量,并降低了废品率,为公司节约了大量成本。
2.(举例)在项目管理方面,我积极与团队成员合作,组织了有效的沟通和协作,使得项目进展顺利,提前完成了目标。
3.(举例)通过定期与客户的沟通和反馈,我及时了解了客户需求并且提供了满意度高的解决方案,提升了客户体验。
二、个人成长与提升在过去的一年中,通过工作的实践和学习,我取得了一定的成长与提升。
具体包括:1.(举例)不断学习新的技术和知识,提高了自己的专业能力,能够更好地应对工作中的挑战。
2.(举例)参加培训和学习计划,提升自己的沟通能力和团队合作能力,能够更好地与同事合作完成工作。
3.(举例)通过参加行业研讨会和交流活动,了解行业最新动态和趋势,拓宽了自己的视野,为工作提供了更多的思路和想法。
三、不足与改进在工作中,我也存在一些不足之处,需要进一步改进和提升。
具体包括:1.(举例)在项目管理中,有时在时间安排和任务分配上不够合理,需要更好地平衡资源和进度,提高工作效率。
2.(举例)在与团队成员的沟通中,有时存在表达不清和理解不准确的情况,需要进一步提高沟通和协作能力。
3.(举例)对于新的工作挑战,有时候会感到畏难或迟疑,需要更积极主动地面对和解决问题。
四、未来展望与规划针对过去一年的工作总结和反思,我对未来有以下展望和规划:1.(举例)进一步提高专业知识和技能,不断学习和更新自己,保持与行业的同步。
RT-PCR实验方法总结大全第一篇:RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。
要求:1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。
2.RT按要求做,一般不会出太大问题。
3.PCR,按常规。
但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1)RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和c:特异的下游引物。
如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上),还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?请高手指教!解答:1.RT-PCR有两种做法:条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。
(promega)。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。
3.RACE 我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico),但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法),而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。
实验室个人工作总结pcr在实验室进行PCR实验是一个常见的实验操作。
本人在过去的一段时间内在实验室里从事了PCR实验,并进行了一些个人工作总结。
首先,进行PCR实验前,我认真阅读了PCR实验的操作手册,了解了PCR实验的原理、步骤和注意事项。
在实验操作过程中,我十分注重实验操作的规范性和准确性,严格按照操作规程进行。
在实验仪器和设备的使用上,我也进行了充分的练习和熟悉,保证了实验操作的顺利进行。
其次,我在实验中积极参与了实验数据的采集和记录工作,及时整理和归档实验数据。
在实验数据分析上,我也做了一定的探索和总结,提出了一些实验数据的规律和特点,为实验结果的解释和讨论提供了有力的支持。
另外,我还在实验过程中发现了一些实验操作上的错误和问题,并及时记录和报告,以及时纠正错误,提高了实验的准确性和可靠性。
在实验结果的解释和呈现上,我也积极与实验室的其他成员进行交流和讨论,充分吸收并借鉴他们的意见和建议。
总的来说,通过这段时间的PCR实验工作,我深刻地体会到了实验操作的重要性和规范性,也提高了自己的实验技能和实验数据分析能力。
我将不断努力,积极参与实验室的实验工作,为科研工作的开展做出更大的贡献。
在进行PCR实验的过程中,我深刻认识到了实验室工作的重要性以及严谨性。
首先,我学会了严格遵守实验操作规程,严谨认真地准备试剂和实验仪器,确保实验操作的准确性和可靠性。
在配制PCR反应体系时,我严格按照配方比例和步骤进行,避免了试剂配制上的误差。
其次,我在PCR实验的温度控制和反应时间把握方面进行了反复的实践和调整,最终找到了适当的PCR条件,确保了PCR反应的高效进行。
在PCR产物的检测和分析上,我熟练掌握了琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR等技术,准确地检测和分析了PCR产物,并保留了准确的记录和分析结果。
另外,我也积极参与了实验室的讨论和交流活动,充分借鉴和学习了其他实验员的经验和技巧。
通过与他们的交流,我不断积累了实验操作的技巧和经验,提高了自己的实验操作水平。
pcr检验工作个人年终总结范文PCR检验工作个人年终总结一、总述回顾过去一年的PCR检验工作,我深感学到了很多知识和技能,也取得了不少成绩。
在这篇年终总结中,我将结合具体工作内容,分享我的收获和经验。
二、工作内容及成绩1. 实验技术能力提升通过不断学习和实践,我掌握了PCR检验的基本理论和实验步骤,熟悉了常见的实验室仪器设备操作,如PCR仪、离心机等。
我还研究了新的PCR技术和方法,如实时荧光定量PCR和多重PCR,提高了实验的准确性和效率。
2. 样本处理和质量控制在样本处理和质量控制方面,我积累了丰富的经验。
我严格按照实验室标准操作,保证了样本的准确性和可靠性。
我学会了正确制备PCR反应液,优化了反应条件,提高了PCR检验的灵敏度和特异性。
3. 数据分析和结果解读PCR检验不仅仅是实验操作,更重要的是数据的分析和结果的解读。
我学会了使用相关软件进行数据处理和分析,如SPSS和GraphPadPrism等。
我能够准确地解读PCR结果,并撰写科学报告,将实验结果与研究目的紧密结合,为研究提供有力的依据。
4. 与团队合作作为PCR检验工作的一员,与团队合作是非常重要的。
我与同事建立了良好的沟通和协作关系,相互之间互相配合,共同完成了多个项目。
团队合作使我们的工作更加高效和有成效,也提升了团队的凝聚力和专业水平。
三、经验与收获1. 学习的重要性PCR检验是一个不断发展的领域,我意识到学习是持续提升的关键。
我会继续学习新的实验技术和方法,积极参加相关培训和学术交流,不断提升自己的专业水平。
2. 规范操作的重要性PCR检验是一项精密的实验技术,任何一环的失误都可能导致结果错误或不准确。
因此,我更加注重规范操作,严格遵循实验室操作规程,确保实验过程的可重复性和结果的可靠性。
3. 团队合作的重要性PCR检验工作需要团队合作,每个人都发挥着重要的作用。
通过与团队的合作,我学会了倾听和尊重他人的意见,学会了协调和合作,也提高了自己的沟通能力和团队意识。
RT-PCR实验心得■提取RNA(我做细胞的)1.取中号培养瓶(100ml培养瓶注:此时细胞汇合度≥80%),用PBS洗细胞两次,弃尽PBS后加2mlTRIzo l(量大无防!),细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至2个1.5EP管中.2.颠倒摇晃10下,室温5分钟.3.在2个EP管中各加入0.2 ml氯仿。
盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。
4.在2—8°C下用不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。
离心后混合物分成三层:下层红色的苯酚-氯仿层,中间层,上层无色的水样层。
5.用移液枪分别转上层水相(约500-600μl)于另二个1.5mlEP管中,加等体积异丙醇(约500-600μl),混匀室温10分钟来沉淀RN A→在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。
注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
6.舍弃上清,用75%的乙醇(用DEPC水处理的,临时十分钟配,预冷保存于4°C或-20°C) 1 ml来洗涤RNA沉淀→在2—8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。
;离心前注意放管的方向,注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙醇中,2-8℃至少可保存一周,-20℃至少可保存一年!7 弃上清,置于卫生纸上,自然晾干(不能完全干燥),用20-50μl DEPC水溶解。
(建议装于0.6的EP管中.)8紫外光度检测注:该步后,可保存于-70℃超低温冰箱,或算好计量建立体系立即用于逆转录.■ RT反应体系注意事项1.RT试剂盒中试剂解冻后,摇晃试管使其均匀,在稍离心,放于冰盒上.反应也在冰上操作.2 PCR仪预热到50°C,在放PCR管于PCR仪上(之前在冰上!)开始逆转录.3反应体系准备:比原体系大10%;建立25ul的反应体系;先按总反应体系混合总体体系反应物,在分装于PCR管中(分装前宜离心!),再分别加 RNA和引物/内参;4 RNA的量宜大2ug/reaction!5 要有要有逆转录(50℃,30min)和初始热活化(95℃, 15 min);反应体系要搞清!//(-)5'-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3'扩增片段长度为407bpGAPDH条件为预变性94℃ 3 min,94℃ 40 s、59度40 s、72度1 min 7个循环,94℃ 40 s、56度40 s、72度1 min 25个循环,72℃延伸5 min。
pcr个人工作总结本人已于2020年7月至2021年8月参与PCR实验室的工作,期间主要负责PCR试剂盒的研发与优化,并从中获得了一定的经验与收获。
通过这一年的工作,我对PCR技术的理解更加深入,对实验操作也更加熟练。
以下是我的个人工作总结:一、研发与优化PCR试剂盒作为PCR试剂盒的研发人员,我首先需要对PCR技术的原理、反应体系和常见问题有深入的理解。
我通过学习文献、参与内部研讨会和与同事交流,不断提高自己对PCR技术的掌握程度。
在PCR试剂盒的研发中,我参与了引物和探针的设计、酶的筛选与优化以及反应体系的优化等工作。
在引物和探针的设计方面,我通过分析目标基因的序列和各种引物设计软件,设计出了多个具有较高特异性和灵敏度的引物和探针。
在酶的筛选与优化方面,我使用了不同的酶并进行了比较实验,最终确定了适合我们实验室的最优酶。
在反应体系的优化方面,我对PCR反应液的组成进行了调整,优化了PCR反应的条件和效果。
二、质量管理与控制在PCR试剂盒的研发阶段,我注重对实验过程的质量管理与控制。
我对实验所用的试剂进行了充分的质量评估,并确保试剂的质量符合要求。
在实验操作过程中,我注重反应管的清洗和消毒,严格按照操作规程进行操作,并对实验环境进行了合理的控制。
我还学习了PCR试剂盒的质量管理知识,参与了内部质量控制和质量评估工作,确保PCR试剂盒的稳定性和可靠性。
三、数据分析与结果解读作为PCR试剂盒的研发人员,我负责对实验结果进行数据分析和结果解读。
我掌握了PCR结果的判断标准和数据分析方法,并通过统计学软件对实验数据进行了分析。
在结果解读方面,我需要综合考虑实验的可重复性、特异性和敏感性等因素,以及潜在的干扰因素,做出合理的结果解读,并撰写实验报告和技术总结。
四、团队合作与交流在PCR实验室工作的过程中,我与实验室的其他同事保持良好的沟通和合作。
我们定期开展研讨会和讨论会,分享实验经验和技术进展,并相互交流解决实验中遇到的问题。
RT- PCR相关知识及操作的总结
RT-PCR(Realtime Polymerase Chain Reaction)即实时定量PCR。
实时监测,由于PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以称为定量的依据。
与常规PCR相比,RT-PCR的优点:实时监测(在对数扩增时期)而不是终点检测;敏感度高;需要样品少;特异性高;精确定量。
一、RT-PCR的反应条件
1.反应液
(1)模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。
DNA模板一般100ng /100μL。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
(2)引物浓度
0.1-0.5 μmol/L。
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
(引物设计:a序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列;b引物长度以15-40 bp为宜;c碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%;d引物内部避免形成二级结构;e两引物间避免有互补序列;f引物3’端为关键碱基;5’端无严格限制。
)
(3)Taq DNA聚合酶
0.5-2.5 U/50 l。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
(4)dNTP(10mM or 2.5mM )
含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP ;dNTP浓度取决于扩增片段的长度;浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量;dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA 聚合酶的活性。
(5) Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
浓度为0.5-2.5mmol/L。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降; Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
目前,市场上有各种试剂盒,可按其protocol进行添加。
2.循环参数
(1)变性
使双链DNA解链为单链; 94℃, 30-60秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。
(3)延伸
70-75℃,一般为72℃。
延伸时间由扩增片段长度决定。
PCR 延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。
3~4kb的靶序列需3~
4min;扩增10Kb需延伸至15min。
(4)循环次数
主要取决于模版DNA的浓度;
一般为25-35次;
次数过多:扩增效率降低,错误掺入率增加。
(5)熔解曲线
A 理解做“溶解曲线”的意义:PCR产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论。
PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
普通PCR的扩增产物通过电泳跑胶的方式来区分目的产物和非目的产物或者对扩增产物进行序列分析或者用Southern印迹杂交后者斑点杂交(引物二聚体、非特异性扩增产物)。
荧光染料是DNA双链小沟结合物,本身不具有选择性,能和所有的DNA双链结合。
在荧光PCR染料法里,我们单单通过PCR荧光扩增曲线来“判断”结果是不合适的。
因为,非特异性扩增产物也能与染料结合,S型的荧光扩增曲线中可能有局部or全部的荧光
来自非特异扩增的“贡献”。
鉴定并区分目的产物与非特异产物显然,需要通过溶解曲线。
双链DNA都有自己的Tm值。
可以通过Tm 值的不同,将不同的产物分开。
在荧光PCR中,大多扩增100bp左右的产物(最好不超过200bp),退火和延伸时间较短。
非特异的产物基本上都比目的扩增片段小。
所以,在做溶解曲线分析时,目的片段的Tm值较大,而非特异的Tm值较小。
B 降温速率
普通荧光PCR仪的降温速度默认是:1℃/cycle,能做HRM的仪器,降温速度可设置为<1℃/cycle。
一般来说,不做HRM,就设置1℃/cycle即可满足需要。
C 温度区间
理论上来说,能包含住产物Tm值和非特异产物Tm值即可。
所以,一般设置在50℃-95℃区间内均可。
D 荧光采集时间
若出于节省时间的考虑,用5s都可以有比较不错的结果。
二、RT-PCR的方法选择
1.SYBR Green I染料法
2.Taqman探针法
3.分子信标
4.各种方法的应用比较
三、荧光RT-PCR技术的应用
1.绝对定量
2.相对定量
四、RT-PCR反应性的确认
五、Ct值
六、引物二聚体
1.引物二聚体的产生原因比较多,其中很重要的一个就是引物自身的原因,也就是设计的引物特异性不好,不能有效的和模板进行结合,而出现引物自身配对结合的情况导致二聚提的出现;其次还可能是PCR体系及反应条件的问题,如果PCR体系中引物、镁离子以及酶浓度过高等,都容易产生二聚体,这时要适当降低浓度,比如20uLPCR体系中,一般10pmol/ul的引物,加0.2ul就可以
了;还有可能是退火温度的问题,可以做个梯度PCR或降落PCR,来摸索一个合适的退火温度,也可有效地减少二聚提的出现。
2、杂带的出现在很大程度上来源于两个方面:一是引物的特异性问题,包括引物的长度和与模板的匹配度等。
二就是退火温度的问题,一般适当提高退火温度可有效地减少非特异性扩增,从而减少杂带的出现。
3.一般来说减少杂带的方法有:热启动PCR(加热启动酶或先把PCR仪预热)、提高退火温度、做降落PCR(每个循环降低0.5度)、降低底物浓度、降低镁离子浓度、减少循环次数等;其次,有些共溶剂(甲酰胺,DMSO)和添加剂(氯化四甲铵,谷氨酸钾,硫酸铵)能够降低高水平的错误引导与提高富含G+C模板的扩增效率。
另外还需要注意一些细节问题,如PCR反应体系的最好在冰上配制,Taq酶最后加,PCR结束后产物勿放置在室温下过长时间等。
4. RT中非特异性条带的产生和解决:a. 从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法;b. 可能模板有问题(可能cDNA有降解,这里我考虑你用的2步法);c. 模板浓度过小,适当加大模板量;d. 降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些);e. 若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在
20-25mmol/l没有区别,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。
七、关于RT-PCR中逆转录步骤
七、试剂盒的具体操作步骤
每个品牌都有自己的protocol,按上面的进行操作即可。
品牌中,takara效果好,然而太贵,我用的promegga,效果也可以。