大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备

大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天:1.将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C 下过夜培养2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml以备第二天摇瓶用3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天:4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基的1-2升挡板摇瓶中5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时8.细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天9.用灭菌的冰水重悬浮细胞。

先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升,然后加水稀释至离心管的2/3体积。

10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12.离心,弃上清液13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡中4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏(检查时间常数,应该在3以上6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。

其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。

2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。

通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。

常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。

2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。

这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。

2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。

常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。

通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。

3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。

3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。

这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。

3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。

在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。

4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。

通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。

大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。

2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。

3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。

4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。

5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。

6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。

8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。

9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。

10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。

2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。

2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。

收集菌体，弃上清。

3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。

4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。

5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。

用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。

质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤实验原理：利用瞬间高压造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，有利于DNA 等大分子进入。

因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。

109〜1010转化子M g DNA。

,-电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1.前夜接种受体菌（DH5a或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37 C 摇床培养过夜；2.取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37 C摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6 （约2.5-3 小时）；3.将菌液迅速置于冰上。

以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5m l离心管中，在冰上冷却10分钟；5.4C下3000g冷冻离心5分钟；6.弃去上清，加入1500^ l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7.4C下3000g冷冻离心5分钟8.弃去上清，加入750^ l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9.4C下3000g冷冻离心5分钟10.加入20^ l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11 .立即使用或迅速置于-70 C超低温保存。

-质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤1.制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中加入250^ l Amp （100mg/ml） , 250 诉l X-gal （20mg/ml）, 25 l IPTG （200mg/ml）,混匀后倒入灭菌培养皿中；2.取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3.每管感受态细胞加入1^ l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；4.电转化仪选择1800V作为输出电压；5.将要转化的混合物加入预冷的 1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电击；6.立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞；7.将细胞转入合适的培养管中37C培养1小时；8.吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；9.37C培养过夜，观察结果。

大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。

大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。

在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。

因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。

感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。

2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。

•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。

3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。

电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。

2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。

3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。

以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。

感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。

研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。

大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。

用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

宿主细胞一般是限制?D修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。

若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。

从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。

本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。

将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。

转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。

二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。

2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。

3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。

电转化感受态细胞制备1．从新鲜培养基挑取一个大肠杆菌单菌落，接种与含50mlLB培养液的锥形瓶中，于37℃摇动（250rpm）培养过夜。

2．接种两份25ml的过夜培养物分别到盛有500ml预热LB培养基的2L锥形瓶中，37℃摇动（300rpm）培养，每隔20min测量一次OD600值。

3．当OD600值达到0.4时，迅速将培养物置于冰浴中15-30min不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。

离心管置于冰浴上预冷。

4．将细菌转移至冰冷的离心管中，4℃用SorvallGSA转头（或与之相当的转头）1000g（2500rpm）离心15min。

倒去培养基，用50ml冰冷的纯水重悬。

5．4℃用Sorvall GSA转头（或与之相当的转头）1000g（2500rpm）离心20min。

倒去培养液，用250ml冰冷的10%甘油重悬。

6．4℃用Sorvall GSA转头（或与之相当的转头）1000g（2500rpm）离心20min。

倒去培养液，用10ml冰冷的10%甘油重悬。

7．4℃用Sorvall GSA转头（或与之相当的转头）1000g（2500rpm）离心20min。

倒去上清，吸取管壁上的残留液体。

加1ml冰冷的GYT培养液重悬。

8．100倍稀释上述悬液后测OD600。

用冰冷的GYT培养液将其稀释至浓度为2×1010-3×1010个细胞/ml。

9．将40μl上述悬液转移到冰冷的电转化仪的电击杯中，检查电击时是否有短路现象。

如果有，那么剩下的细胞悬液用冰冷的GYT培养液洗一次，使细菌悬液的电导足够低。

10．将悬液分成40μl/管，封紧管口，液氮速冻，储存于-70℃。

GYT：10%（v/v）甘油，0.125%（m/v）酵母粉，0.25%（m/v）蛋白胨。

1第六节大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、基本知识核酸不能自己进入细菌,而是需要帮助,并对细菌经过处理,才能穿过细胞的内、外膜进入,在里边表达和复制。

☺感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Competent cells 。

☺转化(Transformation :是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

2二、大肠杆菌感受态细胞的制备常用CaCl 2成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA 产生5×106~2×l07个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒上进行的常规克隆的需要。

适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。

制备的感受态细胞可贮存于-70℃,数月至1年。

但保存时间过长会使转化效率受到影响。

新鲜细胞4 ℃保存可用5天。

用于电转化法的感受态细胞的制备使用低盐缓冲液或水洗细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。

(具体操作及参数,参考仪器说明3☺下列有3个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的:–转化缓冲液中试剂的纯度–细胞的生长状态–玻璃和塑料器皿的清洁度4例:Cacl 2法制备感受态细胞(化学法步骤:1从于37℃培养16~20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm ,转到一个含有100ml LB 或SOB 培养基的1L 烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养约3小时。

为得到有效转化,活细胞数不应超过108细胞/ml ,可每隔20~30分钟测量OD 600值来监测培养物的生长情况。

2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml 丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0℃。

3于4 ℃,离心10分钟,以回收细胞。

4倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。