植物细胞融合(实验) PPT课件

根据实验需要，准备适当 的化学试剂和酶溶液，如 细胞壁酶、离散剂、缓冲 液等。
准备仪器
准备适当的显微镜、离心 机、摇床、培养皿等实验 仪器。
分离原生质体
表面消毒
将实验材料表面消毒，以避免污染。
酶解
用适当的酶溶液处理实验材料，使细胞壁分解，释放 出原生质体。
分离
将酶解后的组织用离心机或过滤法分离出生质体。鉴定通过形态学观察、分子生 物学技术或免疫学技术等 方法对融合细胞进行鉴定。
培养与繁殖
将筛选和鉴定合格的融合 细胞进行培养和繁殖，以 备后续实验或应用。
03
植物细胞融合实验结果分 析
融合细胞的筛选结果
1 2
筛选方法
采用抗性筛选和荧光激活细胞分选（FACS）等 方法，从融合细胞群体中筛选出具有稳定融合特 征的细胞。
筛选和培育融合细胞
在融合后的细胞中筛选具有双亲遗传 特征的融合细胞，并进行进一步的培 育和筛选。
克隆和繁殖
对筛选出的融合细胞进行克隆和繁殖， 获得具有特定性状的植物个体。
02
植物细胞融合实验步骤
准备实验材料
01
02
03
选择实验材料
选择健康、无病虫害的植 物组织作为实验材料，如 根、茎、叶等。
准备试剂
植物细胞融合(实验)
目录
• 植物细胞融合实验简介 • 植物细胞融合实验步骤 • 植物细胞融合实验结果分析 • 植物细胞融合实验的应用与展望 • 结论
01
植物细胞融合实验简介
植物细胞融合的定义
01
植物细胞融合是指将来自不同植 物的细胞通过物理或化学方法诱 导融合，形成一个具有双亲遗传 特征的融合细胞的过程。
植物细胞融合技术可以用于新品种的培育和遗传改良，未来可以开展 相关研究，为育种工作提供新的工具和方法。

第四章－1
细胞融合
Cell Fusion
1
细胞融合
细胞融合概念 融合方法 融合过程 融合的影响因素
2
一、 细胞融合的概念
细胞融合（cell fusion）：又称somatic hybridization or cell hybridization ，指在自然 条件下或人工方法使两个或两个以上的细胞通过无性 方式融合形成一个杂合细胞的过程。 它能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息，是研究 细胞间遗传信息传递、基因在染色体定位、改良动物 遗传特性及创造新的符合人类需要的新的细胞系极为 有效的手段。
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软琼脂培养法
在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的 琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的 0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管 吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。
35
第四节 杂种细胞在细胞生物学研究中的应用
1）基因定位
不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞 的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被 选择性留下，即染色体分离的现象。由此，可根 据表型和与表型特征相对应的基因在特定染色体 上。 例如 ：HGPRT－人细胞与TK－的小鼠细胞融合后， 可用HAT培养基分离得到一种仅含一条人E组染色 体的杂种细胞，具有TK活性，由此得到人的TK基 因是在E组染色体上的。
2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度 和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。
21
融合参数：主要包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电 场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。
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优点：
融合率高，达70％－80％，甚至100％ 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对 照组多核细胞的核数/对照组的全部细 胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞

边观目察镜边上移？动玻片，如果脏东西也跟着移动，则脏
东西在玻片上；边观察边转动目镜，如果脏东西也 跟着移动，则脏东西在目镜上；如果以上都试了， 脏东西未跟着转动，则脏东西在物镜上。
• 4、挤压水果可以得到果汁，这些汁液主要 来自细胞结构的哪一部分？
主要来自液泡中的细胞液。
人教版2.1.2《植物细胞》课件（25张 ppt）
生物图的画法与注意事项：
1、工具：白纸、铅笔（3H或2H）。
2、位置：白纸的中央，稍偏左上方。
3、画图：左眼看显微镜，右眼看白纸，画图。
4、勾画细胞轮廓：线条要均匀、粗细一致、线 条交叉处不要出现分叉。
5、打点：图中较暗的地方用铅笔点上细点表示。 （不能用阴影）
6、标注：图中各部分名称标在右侧，用平行直 线引导。
• 7、清洗青菜时，冷水没有变成青菜汤，而 把青菜放入沸水中煮一下，就变成了青菜 汤，这是因为活细胞中的某种结构阻止了 物质外流，则这种结构是（B）
A细胞核B细胞膜C细胞壁D细胞质
人教版2.1.2《植物细胞》课件（25张 ppt）
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1、说出图中各结构的名称。
7、名称：图的名称标注在图的下方。（一般还
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要注明放大倍数）
人教版2.1.2《植物细胞》课件（25张 ppt）
课后练习:
• 1、制作临时装片时，染色会对细胞产生什么影响？在 什么情况下应该使用不经过染色的临时装片？
染色可以使细胞的结构显示得更清楚。但是对活细胞的生 物活性会有很大影响，有时甚至是致死的。因此，在观察 活的细胞及其生物活性时，应该使用不经染色的临时装片。
物
进行生命活动的重要场所。 细胞质流动，说明细胞是活的，

B. 高Ca2+和高pH值融合
• Ca2+浓度 0.05 mol/L
具体做法(以烟草为例)
• 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的 比例混合;
• 加入2.2H2O和甘露醇; • 再用甘氨酸钠缓冲pH值到，成为融合液，同
时在37℃下保温0.5h; • 用甘露醇洗净高CaCl2和高pH值； • 两种原生质体的融合率达到10%。
3. 平行多电极融合装置法：经过1兆赫如150V/cm交流电场发生双向 电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生 质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度的直流电脉冲
(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，质膜发生被击穿，进一步形成融合体
细胞电融合过程
原生质体的融合过程包括3个主要阶段： 1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；
最后用原生质体培养液离心一次
分离、洗涤、纯化原生质体的试剂
与分离试剂相同 与分离试剂相同
试剂
KH2PO4
KNO3
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O KI CuSO4.5H2 甘露醇
纤维素酶
果胶酶
蔗糖
分离 27.2 mg 101 mg
1480 mg
240 mg 0.16 mg
13% 4%
0.4%
– 原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分 布于薄层固体培养基中
– 此法优点有利于对单个原生质体的胞壁 再生和对细胞团形成的全过程进行定点观 察
• 双层培养法 – 在固体培养基上，加入适宜原生质体胞 壁再生和细胞分裂的液体培养基
• 细胞壁再生：
– 体积膨大，叶绿体重新排列，新 的细胞壁开始合成，细胞由球形 变成椭圆形。
4、原生质体的纯化

单细胞的制备
• 用胰蛋白酶、机械法或二者兼用来分离细 胞，对其进行单层或悬浮培养，获得单个分 散的细胞。
5.3 细胞融合的方法
•自发融合 NaNO3 高pH-高Ca离子
仙台病毒
•诱发融合
PEG
电场
……
5.3.1 生物融合法-----仙台病毒法
• 病毒类是研究得最早的促融剂 • 疱疹病毒、天花病毒、副流感型 病毒、副黏液病毒等致癌、致病 病毒，都能诱导细胞融合
不对称杂种：亲本双方原生质体发生部分融
合，或发生了融合，但融合体在分裂过程中一
方的部分核或质被排斥，因而其体细胞染色体
数目达不到双亲之和。其外部形态呈双亲的中
间型或偏一方形态，一般表现为雄性器官退化，
正常花粉粒极少，育性低。
胞质杂种：携带一个亲本的核和两个亲本的
细胞质。
细胞融合的意义
• 实现远缘遗传重组 植 物
P1
融合液
P2
混合静止1min. P1 P2 加入PEG
选 择
融 合 加入稀释液
稀 释 加入培养基
培 养
洗 涤
洋葱根尖原生质体 （40×）
烟草叶肉原生质体 （40×）
烟草叶肉细胞和洋葱根 尖细胞原生质体融合
烟草叶肉和洋葱根尖细 胞原生质体的异源融合
原生质体的 诱导频率；同时 群体密度 与pH 值相关。
德国生理学家 Johannes Müller 1801-1858
• 毒性大，应用受到限制
• 1958 年 ， 日 本 学 者 冈 田 善 雄 （Okada）发现了HVJ病毒可促
进细胞融合。
• 仙台病毒（HVJ）毒力低，对人
的危害小
日本学者Okada
• 易被紫外线或 β －丙炔内酯所灭 活

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原生质体培养
融合细胞发生第一次分裂后加入400μl 2/2培养基，置于弱光照下培养，以后每隔 3d加400μl 2/2培养基，直到小细胞团形成。 将小细胞团转入1/3固体培养基，在弱光照 下培养5d后，抽掉固体培养基表面的浮液， 进行常温正常光照培养。愈伤组织约5mm 大小转入4/1培养基进行不定芽诱导。20～ 30d后，将不定芽转入MS基本培养基附加 0.02mg·L-1α-萘乙酸（NAA）促进植株生根。
4
概念（补充2）
体细胞杂交：Somatic hybridization 细胞融合：Cell fusion 原生质体融合：Protoplast fusion 无性杂交：asexual hybridization 超性杂交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 细胞操作：Cell manipulation 细胞工程（Cell engineering）
• 三白草产河北、山东、河南和长江流域及以南各省区 • 鱼腥草分布于甘肃、陕西以南，东至台湾，西南至云南、
西藏，湖南全省广布;
8
2、试剂及试液
• 2.1 CPW溶液 • 2.2 混合酶液的组成 • 2.3 融合液的组成 • 2.4 原生质体培养基
9
CPW溶液
• 该溶液用于配制酶溶液，或分离原生质体以后纯化原生质 体时作为清洗液用，其常用配方如下:
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杂种鉴定
• 再生植株形态学鉴定
当再生植株长到3-4片真叶时开始进行形态鉴 定。仔细观察植株的叶片形态，叶片颜色和植株 形态，通过与供受体植株形态进行比较，从形态 上鉴定杂种植株。
• 再生植株同工酶鉴定
利用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳技术，参照郑晓鹰的方 法进行过氧化物酶(POX)酶谱分析。实验步骤如下：

弃去上清加入弃去上清加入gkngkn液少许混匀取少量悬浮于液少许混匀取少量悬浮于载玻片上加入詹纳斯绿染液用牙签混匀载玻片上加入詹纳斯绿染液用牙签混匀3min3min盖上盖玻片观察细胞融合情况
实验原理
两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细 胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。
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实验操作
1. 在公鸡翼下静脉抽取2ml鸡血，加入盛有8ml的 Alsever液中，使血液与Alsever液的的比例达 1∶4，混匀后可在冰箱中存放一周；
2. 取此储存鸡血0.2ml加入0.8ml的0.85％生理盐 水，充分混匀，1500r/min离心5min，弃去上 清，加入1ml的0.85％生理盐水，重复上述条件 离心两次。最后弃去上清，加GKN液0.8ml， 离心；
• GKN溶液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·2H2O 1.77g， NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于 1000ml水中。
• 50％PEG溶液：称取一定量的PEG（WM＝4000）放入烧杯中， 沸水浴加热，使之熔化，待冷却至50℃时，加入等体积预热至 50℃的GKN溶液，混匀，置37备用。
8. 1500r/min离心5min，弃去上清，加GKN溶液 再离心1次；
9. 弃去上清，加入GKN液少许，混匀，取少量悬浮 于载玻片上，加入詹纳斯绿染液，用牙签混匀， 3min盖上盖玻片，观察细胞程
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相关实验溶液的配制
• Alsever溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g， 溶于100ml双蒸水中。
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实验操作
5. 取以上细胞悬液0.2ml放入1ml的EP管中，然后 放入37℃水浴中预热，同时将50％PEG液一并预 热20min；

结合转基因技术
转基因植物的体细胞杂交育种是将转 基因技术与植物体细胞杂交技术相结 合，通过导入外源基因来改良植物性 状。
案例二：转基因植物的体细胞杂交育种
增强抗逆性
通过转基因技术，可以增强植物的抗逆性，如抗虫、抗病、 抗旱等，提高植物的适应性和产量。
案例二：转基因植物的体细胞杂交育种
安全性评估
在转基因植物的体细胞杂交育种过程 中，需要进行严格的安全性评估，确 保转基因食品的安全性。
案例二：转基因植物的体细胞杂交育种
法规监管
VS
由于转基因技术的复杂性和争议性， 相关的法规监管也是转基因植物体细 胞杂交育种的重要考虑因素。
案例三：濒危植物的体细胞杂交保护
保护濒危植物
濒危植物的体细胞杂交保护是通过植物体细 胞杂交技术来保护濒危植物物种，防止其灭
绝。
案例三：濒危植物的体细胞杂交保护
1 2
基因转移
植物体细胞杂交技术可以用于将外源基因导入到 植物细胞中，实现基因转移和遗传改良。
基因编辑
通过植物体细胞杂交技术，可以对植物基因进行 编辑和修饰，以实现定向改良和创造新品种。
3
基因表达调控
利用植物体细胞杂交技术，可以对植物基因的表 达进行调控，以实现特定性状的表达和优化。
在生物多样性保护中的应用
《植物体细胞杂交》 ppt课件
REPORTING
• 植物体细胞杂交概述 • 植物体细胞杂交的基本原理 • 植物体细胞杂交的实验技术 • 植物体细胞杂交的应用与前景 • 植物体细胞杂交的案例分析
目录
PART 01
植物体细胞杂交概述
REPORTING
定义与特点
定义
植物体细胞杂交是指将不同植物的细 胞通过细胞融合技术，再经过培养诱 导，实现细胞分裂、生长、发育为完 整植株的过程。

1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。
1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。
1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定 单克隆抗体的杂交瘤细胞。
20世纪80年代出现了电融合技术。
2021
叶——叶 叶——根 愈伤组织——叶 叶——花瓣 种子——种子 叶——悬浮细胞 叶——花瓣 叶——悬浮细胞 叶——悬浮细胞 悬浮细胞——悬浮细胞 叶——根 悬浮细胞——叶 原生质体——血红细胞 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 腹水癌细胞——原生质体 叶——根尖 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞
2021
成功年代
液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。 （6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。
2021
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2021
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三、电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的 诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘 合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整 的膜，形成融合体。
2021
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聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程
2021
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•PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊
设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限
制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒
害。
•PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子
具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团
2021
6
三、动植物细胞的融合过程
植物细胞融合过程
人造小鼠培育过程示意图
2021
7

《植物细胞融合实验》ppt课件
目录
• 植物细胞融合实验概述 • 植物细胞融合实验材料与方法 • 植物细胞融合实验结果与分析 • 植物细胞融合实验结论与展望
01
植物细胞融合实验概胞融合是指将不同植物的 细胞通过物理或化学方法诱导融 合，形成一个具有双亲遗传特征 的融合细胞的过程。
02
植物细胞融合技术是植物生物技 术领域中的一项重要技术，为植 物遗传改良和育种提供了新的途 径。
植物细胞融合的实验目的
创造具有优良性状的转基因植物。 实现植物种质资源的保存和利用。
改良植物的抗逆性、抗病性和抗虫性等。 促进植物基因工程和细胞工程的发展。
植物细胞融合的应用前景
在农业上，植物细胞融合技术可以用于培育抗逆、抗病、 抗虫、优质、高产的转基因植物，提高农作物的产量和品 质，满足人类不断增长的食物需求。
的改良提供了有力支持。
实验结果表明，融合后的植物 细胞表现出更强的分裂和分化 能力，进而形成完整的融合植 株。
植物细胞融合技术在克服远缘 杂种不育、创造新种质资源方 面具有巨大潜力。
研究展望
01
深入研究融合细胞和融合植株的遗传、生理和生化特性，提高融合技 术的效率和成功率。
02
拓展植物细胞融合技术在农业、林业和其他领域的应用，为解决全球 资源短缺和环境问题提供更多解决方案。
培养基
用于培养融合后的细胞。
实验设备与试剂
显微镜
观察细胞融合过程。
离心机
分离和洗涤细胞。
恒温培养箱
培养融合后的细胞。
实验方法与步骤
准备实验材料
选择适当的植物细胞、酶和培养 基。
酶解处理
将植物细胞放入含有酶的溶液中 ，使其细胞壁分解。