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下呼吸道感染细菌学检验操作规范临床通常将正常人喉以上部位称之为上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌。
下呼吸道感染包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管扩张继发感染及肺实质感染（肺炎、肺脓肿）等。
病原体有细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体和原虫等。
社区获得性肺炎常见的病原菌有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、肺炎支原体和肺炎衣原体等。
医院获得性肺炎常见的病原有铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和假丝酵母菌等。
下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，可伴有胸痛、气急，肺部闻及湿罗音、白细胞总数及嗜中性粒细胞比例明显增高，X线检查提示肺部有炎症性浸润或胸腔积液等体症，严重时可导致感染性休克和呼吸衰竭，因此临床诊断一般不难；细菌学检验能明确感染病原及药敏结果，有助于疾病治疗、流行病学调查和医院感染的监测。
临床呼吸道标本中常见的分离细菌见表1。
表1呼吸道标本中常见分离菌革兰阳性菌革兰阴性菌草绿色链球菌、肺炎链球菌、韦荣球菌化脓性链球菌脑膜炎奈瑟菌、其他奈瑟菌表皮葡萄球菌、金黄色葡萄卡他莫拉菌球菌、其他葡萄球菌肺炎克雷伯菌及其他克雷伯菌微球菌、消化链球菌、消化沙雷菌、变形杆菌球菌、肠球菌大肠埃希菌及其他肠杆菌科细菌真杆菌、丙酸杆菌、乳酸杆菌百日咳鲍特菌、不动杆菌放线菌、奴卡菌、结核分枝杆菌铜绿假单胞菌及其他假单胞菌属白喉棒状杆菌、类白喉棒状杆菌细菌、嗜肺军团菌、气单胞菌、流假丝酵母菌感嗜血杆菌、付流杆嗜血杆菌、梭杆菌一、送检指征痰液标本是临床微生物学检验最常见的的标本，但不是下呼吸道感染的最佳标本。
1.咳嗽咳嗽咳痰是下呼吸道感染最常见的症状，咳嗽的性质与痰的性状如脓或铁锈样痰具有鉴别诊断意义。
2.咯血喉以下的呼吸道出血为咯血，包括泡沫血痰、鲜血和痰中带血等。
下呼吸道感染细菌学检验操作规范—、相关临床知识临床通常将正常人喉以上部位称之为上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌。
下呼吸道感染包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管扩张继发感染及肺实质感染（肺炎、肺脓肿）等。
病原体有细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体和原虫等。
下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，可伴有胸痛、气急，肺部闻及湿罗音、白细胞总数及嗜中性粒细胞比例明显增高，x线检查提示肺部有炎症性浸润或胸腔积液等体症，严重时可导致感染性休克和呼吸衰竭，因此临床诊断一般不难；细菌学检验能明确感染病原，并提供有关抗菌药物对分离菌的抗菌活性等信息，有助于疾病治疗、流行病学调查研究和医院感染的监测。
临床呼吸道标本中常见分离细菌见表1表1呼吸道标本中的常见分离细菌二、标本米集本室必须注意生物安全防护。
（一）采集方法1 •自然咳痰法以晨痰为佳，采集标本前应用清水、冷开水漱口或牙刷清洁口腔和牙齿，有假牙者应取下假牙。
尽可能在用抗菌药物之前采集标本。
用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本量应》lml。
标本应尽快送检，不能及时送检的标本，室温保存w 2h o2•支气管镜采集法、防污染毛刷采集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法均由临床医生按相应操作规程采集，但必须注意采集标本时尽可能避免咽喉部正常菌群的污染。
3 •小儿取痰法用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。
幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。
（二）标本验收遇有不合格标本，应及时与临床联系，报告不合格标本拒收的具体理由。
下呼吸道标本验收与拒收见表2o三、实验室检查（一）肉眼观察 观察痰液的颜色、粘度、有无血丝和是否呈脓性，如见有颗粒存在，则应注意可能 与放线菌属及奴卡菌属感染有关。
痰标本临床通常将正常人喉以上部位称之为上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌或仅有少量细菌侵入。
在呼吸道标本细菌学检验中，上呼吸道标本（咽拭子）由于有正常菌群的存在，不易判断出何为与疾病有关的细菌，进行普通培养无特别意义《插入表上呼吸道存在的正常菌群》。
下呼吸道感染是最常见的呼吸道感染症，临床常取痰液标本进行细菌学检验，以明确感染病原及其药敏结果，有助于疾病治疗、流行病学调查和医院感染的监测。
痰标本须经上呼吸道排出，常受该处正常菌群的污染，因此，判断下呼吸道分泌物中是否有病原菌存在，须对上呼吸道的正常菌群有所了解。
上呼吸道的正常菌群有α、γ链球菌、微球菌、拟杆菌、梭杆菌、厌氧球菌、表皮葡萄球菌、奈瑟菌、嗜血杆菌、棒状杆菌。
标本的验收遇有不合格标本，应及时与临床联系，报告不合格标本拒收的具体理由。
拒收标准：a.肉眼观察痰标本呈水样或唾液样。
b.标本涂片白细胞数＜10/低倍镜和鳞状上皮细胞数＞25/低倍镜，表示该标本已污染正常菌群，建议重送标本。
c.容器错误标本容器必须符合规定，溢漏、无盖者拒收。
分离培养1．痰标本培养前处理（均质化）2．分离培养（1）一般细菌培养应同时划区接种（痰半定量原则）痰半定量方法：用接种坏将痰液在血平板和巧克力平板上作三区划线接种标本，进行培养。
痰半定量培养的临床意义三区划线法：首先用无菌棉签挑取痰液的脓或血性部分（或将接种坏通过火焰灭菌，冷却后挑取标本少许，尽量取有脓或血部分）然后将其涂布在平板第一区，并作数次划线，再在二、三区依次用接种环划线，每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。
1）血平板（5%CO2环境）适用于分离肺炎链球菌和其他细菌。
2）巧克力平板（5%CO2环境）适用于分离嗜血杆菌。
3）麦康凯/中国蓝平板（需氧环境）适用于分离革兰阴性杆菌。
（2）分离培养血平板和巧克力平板置5%CO2环境，麦康凯平板/中国兰平板置普通孵箱，35℃孵育。
呼吸道标本细菌学检验操作规程（一）目的：规范呼吸道标本细菌学检验,确保检验结果准确可靠。
（二）适用范围及操作人员：呼吸道标本培养和涂片检检查；检验科工作人员。
（三）支持性文件：《WST805-2022临床微生物检验基本技术标准》、《下呼吸道感染细菌培养操作指南》、《全国临床检验操作规程》。
（四）标本类型：痰、咽拭、支气管肺泡灌洗吸出液、支气管冲洗液或刷子、肺穿刺液等。
（五）标本采集时间：尽量在抗生素使用前采集。
（六）标本采集方法:1、咳痰：适用于肺部感染患者,特别是重病监护室(ICU)及住院的社区获得性肺炎(CAP)、慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)、肺脓肿(咳痰非最适标本)、可疑细菌性病原体引起的肺部感染患者。
咳痰前,患者用无菌生理盐水漱口;指导患者咳出深部痰,勿留取唾液和鼻咽腔分泌物。
2、气管吸出物：仅当气管插管的患者出现肺炎症状时(如发热或浸润),可采集气管吸出物标本。
从气管中吸痰，用无菌容器留取送检。
3、支气管肺泡灌洗液：利用纤维支气管镜向小支气管和肺泡中注入无菌生理盐水灌洗,在40mL～80mL回收的灌洗液中包含约1mL支气管末梢和肺泡中的分泌物;弃去前段可能污染的部分,收集其余部分后立即送检。
4、保护毛刷标本：将纤维支气管镜插入亚段支气管可疑感染部位,经支气管镜刷检孔推出双层套管中的毛刷(远端填塞聚乙二醇),刷取脓性分泌物,采样后将毛刷回收入双层套管并退出纤维支气管镜,用无菌剪刀剪断毛刷,置于含lmL生理盐水的无菌容器中(仅供需氧培养),快速送检。
5、气管穿刺法在环甲膜下穿刺抽取痰液，收集标本，适用于厌氧菌培养。
6、棉拭采集法用无菌棉拭子轻轻擦拭病人鼻咽部黏膜，留取标本，置无菌试管内送检。
（七）标本拒收标准：1、申请单姓名、科别、床号与标本的标签不符。
2、痰标本呈水样或唾液样。
3、痰涂片白细胞<10／低倍视野，上皮细胞>25／低倍视野。
4、标本容器溢漏，无瓶盖。
5、痰标本留取放置时间太长，超过2小时。
下呼吸道感染细菌学检验操作规范(1)下呼吸道感染细菌学检验操作规范近年来，下呼吸道感染病例不断增加，给医疗卫生事业带来了严峻的挑战。
为了确保下呼吸道感染病例的快速、准确、可靠的检测和诊断，制定下呼吸道感染细菌学检验操作规范，将有助于提高检验水平和工作效率，本文将针对细菌学检验操作规范进行详细介绍。
一、检验前准备1. 确定样本种类：本次检验需使用的下呼吸道标本种类有：痰、咽拭子或喉拭子等。
2. 样本采集：根据患者的情况进行样本采集，采集时要求患者咳嗽并咳出深部痰液，若患者不配合，则可采用吸痰管等工具进行痰液采集。
同时也可以采用喉拭子或者咽拭子进行标本采集。
3. 样本处理：对采集的样本，应及时送到检验室进行处理，加工前需要做出相应的标签，记录样本采集时间、采集标本证号、病人基本信息等。
二、操作流程1. 样本处理(a) 痰液标本处理方法：对于痰液标本，先进行分液处理，即分离痰液中的黏液、脓液、红细胞和有机杂质等。
然后以0.9%氯化钠溶液洗涤一次，摇匀后进行离心（5000r/min，10min）。
(b) 咽拭子或喉拭子标本处理：将采集的咽拭子或喉拭子样本转移到含有0.9%氯化钠溶液的离心管中，然后离心（5000r/min，5min），离心后取上清液进行下一步检验。
2. 检测**(a) 涂片制备：将上述处理后的纯化液采用无菌钢丝圈或无菌载玻片刷取标本并均匀涂在两张干净的干燥擅菌片上，干燥后送至乙醇固定。
(b) 染色：采用Gram染色方法进行染色，首先用碘酒凝固后，将菌片在床头火上迅速脱色，用80%乙酸洗去多余的碘酒和颜料，再冲洗水清洗，细心观察染色质量，必要时要反复染色。
(c) 细菌形态观察：观察染色后菌的形态。
非典型革兰氏染色细胞如需观察需通过进一步检验的手段，如选择恰当的培养基及培养条件等。
(d) 培养：将涂片标本在含有相应营养物质的培养基上培养，观察菌落的形态及生理生化特性，以进行分类鉴定。
常用的培养基及相应的菌种分类可参见《常用细菌分类鉴定表》。
呼吸道标本细菌学检验标准操作程序
1.检验目的
规范呼吸道标本细菌学检验操作规程，确保检验结果准确可靠。
2.适用范围
呼吸道标本培养和涂片检查。
3.标本采集与运送
3.1 采集时间以晨痰为好。
3.2 采集方法
3.2.1 自然咳痰法用清水反复漱口后从气管深部咳出痰，吐入无菌容器内。
3.2.2 气管镜下采集法在病灶附近用导管吸或用支气管刷直接取得标本。
3.2.3 气管穿刺法在环甲膜下穿刺抽取痰液，收集标本，适用于厌氧菌培养。
3.2.4 呼吸机采集法使用呼吸机的病人，可利用呼吸机吸取深部痰入专用采集器内送检。
3.2.5 为了明确扁桃体炎、会厌炎、鼻咽部化脓性感染的病原体，可以采集拭子送检。
首先拭子用无菌生理盐水沾湿，然后用力在感染部位擦拭，采集标本与无菌管送检。
3.3 标本运送
3.3.1 采集标本后立即送到实验室，放置时间不应超过2h。
3.3.2 延迟送检或待处理标本应置于4℃冰箱保存（疑为肺炎双球菌、流感嗜血杆菌等苛氧菌感染除外），以免杂菌生长，但必须在24h内处理。
3.3.3 对可疑烈性呼吸道传染病的患者检验标本，在采集、运送及保存过程中必须注意生物安全防护。
4.检验步骤
4.1接种：用无菌拭子蘸取脓性部分，接种于血平板和巧克力平板第一区，再用一次性接种
环分区划线接种。
4.2 涂片在接种的同时进行涂片。
用铅笔在磨砂部位编号，每片只涂一份标本。
4.3 培养：血平板、巧克力平板置35℃二氧化碳培养箱培养18-48h。
4.4 涂片染色镜检：涂片革兰染色，自然干燥后镜检。
先用低倍镜浏览整片，计数平均每个低倍视野WBC、上皮细胞的数量。
标本合格与否参考表1，合格标本再用油镜观察，主要观察片中主要细菌类型、WBC内吞噬什么细菌等，以作为看板时决定什么细菌要做的依据。
表1 痰液标本分级
4.5 培养结果观察
4.5.1 口咽部正常寄生的需氧菌主要是腐生的奈瑟菌、草绿色链球菌，
4.5.2 有明确意义的病原菌： A群溶血性链球菌(咽炎)、流感嗜血杆菌（b型5y以下儿童急性会厌炎、急性支气管炎）、肺炎链球菌（急性支气管炎常继发于病毒感染、大叶性肺炎）、百日咳鲍特菌（咳嗽、支气管扩张）、金黄色葡萄球菌（肺炎）、军团菌（肺炎）、白喉棒状杆菌。
4.5.3 机会致病菌：肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肠杆菌属细菌、铜绿假单胞菌、洋葱博克霍尔德菌、星型诺卡菌、衣氏放线菌、卡他莫拉菌等。
机会致病性真菌：球孢子菌（明确的致病性真菌）、曲霉菌、毛霉菌、卡式肺囊虫、酵母样真菌。
4.5.4 结合痰涂片，对于合格的痰，做如下处理：
4.5.4.1 镜下未见明显优势菌的，血平板正常菌群生长、巧克力上无嗜血杆菌生长，可延长培养至48h，或做DNA酶筛选卡他莫拉菌。
如DNA酶阴性，48h培养板无有明确意义病原菌生长，报告“正常菌群生长”。
4.5.4.2 镜下见WBC内有吞噬菌的，分离相应的细菌鉴定药敏。
4.5.4.3 镜下见革兰阳性球菌，矛头状，注意观察血平板有无肺炎链球菌，分纯可疑菌落，并在一区贴OPTORCHIN纸片。
4.5.4.4 镜下可见革兰阴性小杆菌，多形性，巧克力平板可见较多的透明、湿润革兰阴性杆菌，做卫星试验。
血平板卫星+，MH卫星-，报告“流感嗜血杆菌”；血平板卫星+，MH卫星+，报告“副流感嗜血杆菌”。
4.5.4.5 血平板上机会致病菌生长，超过2+，分离相应的细菌鉴定药敏。
4.5.4.6 镜下见较多酵母孢子和假菌丝，血平板有3+的真菌生长，分离真菌显色鉴定，与临床医生联系商量要不要进一步做药敏。
4.5.4.7 镜下可见有隔菌丝和/或曲霉头部结构，血平板有较多曲霉生长，联系临床医生要不要进一步鉴定。
4.6 特别提示
4.6.1 社区获得性肺炎的非典型病原体如肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌常规培养不出，需要特殊培养基。
4.6.2 百日咳鲍特菌生长慢，需鲍金培养基培养，偶可在新鲜配制的巧克力平板生长。
4.6.3 结核分枝杆菌普通培养不能生长，需特殊培养。
4.6.4 痰培养不做厌氧培养。
