・基础论著・ 两种黑色素瘤B16细胞肺转移小鼠模型的构建和比较李佳悦朱欣凯王萍钮利喜【摘要】 目的 采用尾静脉接种法建立C57BL/6小鼠和KM小鼠两种黑色素瘤B16细胞肺转移动物模型，观察小鼠肺部成瘤过程，并对两种模型进行比较。
制作肿瘤切片，通过HE染色分析两种肿瘤模型的组织病理学特征。
方法培养B16黑色素瘤细胞至对数生长期时收集细胞，用生理盐水调整浓度为5×106/ml备用。
将备好的B16细胞通过尾静脉接种小鼠，每只注射0.2 ml。
接种后，两种小鼠每隔一定时间随机各取一只小鼠处死，解剖取肺，观察成瘤情况，计数肺表面的瘤结节数，测量瘤结节大小。
以出现瘤结节开始计时，记录小鼠荷瘤时间。
形成稳定的肿瘤模型后，制作肿瘤组织切片，HE染色进行病理学观察分析。
结果B16细胞尾静脉接种C57BL/6小鼠和KM小鼠，均能形成肺转移模型，但两种小鼠成瘤情况差异较大。
KM小鼠的荷瘤时间比C57BL/6小鼠荷瘤时间长。
HE染色结果显示黑色素瘤B16细胞在两种小鼠的肺组织中均形成巢团状的转移瘤，且两种模型肺转移瘤均多分布在支气管周围。
结论通过对C57BL/6小鼠和KM小鼠两种黑色素瘤B16细胞肺转移小鼠模型的成瘤特点的分析比较，可以看出KM小鼠更适合用于研究新的肺肿瘤治疗药物，为研究黑色素瘤的发生发展提供依据。
【关键词】 B16细胞；肺转移小鼠模型；尾静脉Establishment and comparison of two kinds of lung metastasis mouse models Li Jiayue, Zhu Xinkai,Wang Ping, Niu Lixi. Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, ChinaCorresponding author: Niu Lixi, Email: nlx@【Abstract】 Objective To observe the tumorigenic process, two pulmonary metastatic modelsof melanoma B16 cells were established and compared using C57BL/6 and KM mice, respectively.Methods Tail intravenous injection of 1×106 melanoma B16 cells/mouse resulted in macroscopic diseaseby 4-9 days and a randomly selected mouse was sacrificed in a certain interval to survey the morphologiccharacteristics of melanoma. The number of tumor nodules in the lung surface was counted and the size oftumor nodules was measured. The tumor-burdened time of mice was recorded and the tumor sections weremade for pathological observation and analysis. Results HE staining showed that each mouse in the B16cell injection groups had nest-shape metastatic foci distributed around the bronchi in the lung, but thetumor-burdened time was significantly different which was longer in KM mice than in C57BL/6 mice.Conclusion By comparing the characteristics of two pulmonary metastatic models of C57BL/6 mice andKM mice, we can concluded that the B16 melanoma models in KM mice were ideal tumor models whichwere suitable for researching the new drugs in lung cancer treatment. Our research would provide evidencefor the occurrence and development of melanoma.【Key words】 B16 cells; Pulmonary metastatic mouse model; Tail vein肺肿瘤又叫支气管肺癌（lung carcinoma）是常见的恶性肿瘤之一，近年来肺癌的发病率和死亡DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2015.19.022基金项目：山西省青年基金资助项目（2011021035-5）作者单位：030006 太原，山西大学生物技术研究所通讯作者：钮利喜，Email: nlx@ 率都有明显增高的趋势，已成为人类因癌症死亡的主要原因[1-2]。
但其发病机制目前尚未完全阐明，目前治疗方法以化疗和放疗为主，治疗带来的不良反应给患者造成极大的痛苦，治疗效果亦不尽人意。
新的有效的肺肿瘤治疗的方法一直在探索中。
肿瘤模型是研究恶性肿瘤病因、发展过程和探索肿瘤治疗方法，进行各种体内实验研究的基础[3]。
所以建立合适的肿瘤模型是探索新的有效的肺肿瘤治疗方法的前提[4]。
在各类动物中，由于小鼠已有明确定型的各种遗传品系，对肿瘤有易感性以及成本较低，因而在肿瘤研究方面较为常用。
本实验通过尾静脉注射小鼠黑色素瘤细胞B16，构建C57BL/6小鼠和KM小鼠两种B16细胞肺转移动物模型。
B16细胞是来源于C57BL/6小鼠皮肤的自发性肿瘤[5]，此瘤株主要发生肺转移[6]。
B16细胞在小鼠体内的生长及转移特性与人黑色素瘤非常相似，为理想的黑色素瘤动物模型，已广泛地用于研究黑色素瘤发生发展、转移和药物筛选等研究[7]。
有关各种小鼠的B16细胞肺转移动物模型的建立已有文献报道，但这些文献中每次取肺记录肿瘤生长情况的间隔时间较长，或者接种后7～8 d才开始记录肿瘤生长情况。
详细记录某种小鼠B16细胞肺转移动物模型成瘤过程的报道很少，本文记录了C57BL/6小鼠和KM小鼠两种黑色素瘤B16细胞肺转移小鼠模型的成瘤过程，为研究黑色素瘤发生发展提供依据，为研究新的肿瘤治疗药物实验，选择恰当的药物处理时间点提供一定的参考。
另外本文分析比较了两种小鼠模型的成瘤特点，为肺肿瘤模型的选择提供实验依据。
材料和方法一、实验材料1. 实验动物：6～7周龄C57BL/6小鼠16只，雌雄各半；6～7周龄KM小鼠16只，雌雄各半，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2007-0001。
室温（22±2）℃，光照12 h循环1次，进食和饮水自由进行[8]。
2. 细胞：小鼠B16细胞购自上海细胞库。
细胞复苏后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，加青链霉素（青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml），置于37 ℃、5% CO2及饱和水蒸气的混合气体孵箱中培养[9]，每1～2 d换液，每3 d传代一次，传代用0.25%胰酶消化。
台盼蓝拒染法确定活细胞数，每次实验细胞活力在95%以上。
3. 实验仪器：超净工作台（苏州市创洁净化设备有限公司）；HF240 CO2培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）。
二、实验方法1. 动物模型的建立：取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化后，培养基重悬收集细胞，用无菌生理盐水清洗一次，离心，再用适量生理盐水悬起，用计数板计数，调整细胞密度为5×106/ml备用。
C57BL/6小鼠6只，KM小鼠6只，雌雄各半。
用75%乙醇消毒小鼠尾部皮肤，取上述B16细胞悬液接种于小鼠尾静脉，每只各接种0.2 ml[10-12]，即每只小鼠接种1×106个B16细胞。
接种后每隔一定时间两组小鼠各随机取一只，用脊椎断裂法处死，观察其肺部成瘤情况。
2. 观察指标：观察接种B16细胞后两种小鼠体重及生活习性的改变等情况。
观察解剖后小鼠肺的颜色、形态。
记录瘤结节出现时间，瘤结节的数目，测量瘤结节的大小。
3. 两种小鼠荷瘤生存时间比较：C57BL/6和KM小鼠各10只，用上述方法接种B16细胞。
饲养小鼠直至其自然死亡。
以出现瘤结节开始计时，记录小鼠荷瘤时间。
4. 取材、固定、HE染色：切取形成稳定肿瘤模型后的肺组织，10%中性甲醛固定，石蜡组织包埋、切片和HE染色。
进行病理学观察分析及拍片。
结 果一、肺转移肿瘤模型的建立1. C57BL/6小鼠肺转移模型：接种B16细胞后，C7BL/6小鼠体重无明显变化，生活习性未见改变。
接种第2天引颈处死1只，解剖后小鼠肺表面光滑呈粉红色，未见黑色素瘤出现。
接种第4天，小鼠肺表面出现轻微的皱缩，颜色略泛黄，肺各叶有淡黑色瘤结节出现，瘤结节直径在0.2～0.4 mm。
左叶靠上处出现约2.5 mm的线状黑色素瘤。
接种第7天，肺部整体颜色泛白，肺组织发干，肺左叶出现轻微的裂痕，肺各叶淡黑色的瘤结节数目增多。
接种第10天，肺部颜色泛白略带黑色，肺部出现皱缩，肺表面褶皱成块状，肺左叶上部的边缘开始向内卷曲。
但瘤结节数目几乎没有增加。
瘤结节的大小也没有明显的增加。
瘤结节颜色依然呈淡黑色。
接种第13天，瘤结节呈黑色，清晰可见，瘤结节数目及瘤结节的直径显著增加。
接种第16天，肺体积膨大，肺边缘向内卷曲，瘤结节数目增多，直径显著增加，各瘤结节大小差异较大，直径约0.3～3 mm，肺的颜色近乎黑色（图1 A）。
2. KM小鼠肺转移模型：接种B16细胞后，KM 雄鼠体重无明显变化，生活习性未见改变。
KM雌鼠在接种B16细胞后的体重开始下降，活动减少，第4天时体型明显比雄鼠消瘦。
从第5天开始逐渐好转，到第12天时恢复正常。
接种第3天引颈处死1只，解剖后小鼠肺部表面光滑呈粉红色，未见黑色瘤结节出现。
左叶和心后叶各有数个约1.2 mm的小红点。
接种第6天，小鼠肺部表面出现皱缩，颜色泛黄，左叶和右上叶各出现一个直径约1.5 mm的小红点，未见有黑色瘤结节出现。
