医用分子生物学讨论课基因组DNA提取琼脂糖凝胶电泳RNA提取ppt课件

铺胶
凝胶凝固后取出梳子
加缓冲液
准备样品
点样
电泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照相
对琼脂糖凝胶电泳分离DNA 片段的有效性 的再认识
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DNA 为多元酸，在中性或弱碱性缓冲 液中带负电荷而向阳极泳动 由于不同 DNA 分子在同一凝胶中迁移速率不一样， 电泳一段时间后可将其分开。
紫外灯下观察照相凝胶冷却至凝胶冷却至5050cc加加ebeb至终浓度至终浓度05gml05gml20对琼脂糖凝胶电泳分离对琼脂糖凝胶电泳分离dnadna片段的有效性片段的有效性的再认识的再认识21dnadna为多元酸为多元酸在中性或弱碱性缓冲在中性或弱碱性缓冲液中带负电荷而向阳极泳动液中带负电荷而向阳极泳动由于不同由于不同dnadna分子在同一凝胶中迁移速率不一样分子在同一凝胶中迁移速率不一样电泳一段时间后可将其分开电泳一段时间后可将其分开
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结果
电泳后在日光下(LIGHTBLUE Dye 染色)或在紫外 灯下(溴化乙锭染色)切取含“ 单一” 目的DNA 分 子的胶条并称重，用小量胶回收试剂盒回DNA。
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谢谢观看
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电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相
溶胶
准备胶槽
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
状DNA>开环DNA
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（%） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

5. 56℃孵育10分钟，其间颠倒混匀数次 6.加入200 μl无水乙醇，颠倒混匀10次，剧烈震荡。短暂离心，使管壁和壁盖上 的液体集中到管底。 7.将步骤5所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，一次不能加完溶液，可分 多次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中。
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xiongdehui@
0731-8480 5449
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第七节
结果分析
M 1 2 3 4 5
LIF E
21226 bp
M: λDNA/HindIII+EcoRI DNA Marker； 1-5: 基因组DNA 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果图
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本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并 从DNA上解离下来，再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组 DNA。
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第一节
实验原理
高盐，低pH值： 选择性结合 DNA
漂洗
低盐，高pH值： DNA从硅基质 膜上洗脱
离心吸附柱内的硅基质膜在高盐，低pH值状态下选择性地结合溶液中的DNA，再通过漂洗
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第五节
7.向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中 的
操作步骤
废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8.向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱重新放回收集管中。 9.10,000 rpm离心2分钟，倒收集管中的废液。吸附柱置室温2分钟，以彻底晾干。

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人类基因组DNA提取
实验结果
experimental result
•无水乙醇沉淀时可见白色絮状物 •0.8%琼脂糖凝聚电泳可见一基因组DNA条带
•OD值测定
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人类基因组DNA提取
注意事项
matters needing attention
•饱和酚吸取时记得吸取下层的有机相
•乙醇沉淀时，要沿离心管壁向DNA溶液中加入无水乙醇 ，轻轻摇动离心管混合至体系完全均一，见白色絮状
DNA
•收集细胞的多少是实验成功与否的关键
•沉淀中加入1mlSTE后，打散细胞团便于充分消化细胞
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限制性核酸内切酶切割的原理、方法
定义
限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷 酸序列，并在每条链中特定部位 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 进行切割的一类酶，简称限制酶。
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限制性核酸内切酶切割的原理、方法
限制性核酸内切酶分类
根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式， 可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ 型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催 化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只 催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同 时具有修饰及认知切割的作用
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限制性核酸内切酶切割的原理、方法
•Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于 ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA， 而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。

琼脂糖与琼脂的区别
琼脂是由琼脂糖（agarose）和琼脂果胶 （agaropectin）组成的。琼脂糖的结构单元是 D半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖；琼脂果胶是由许多 更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似， 但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。 在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除， 否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取 代电离基团，就会造成电内渗，电内渗对质点的 移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比 较低，通常在0.2%以下，电内渗比较小，通常在 0.13%以下。 简言之，琼脂糖是从琼脂中精细提取的，有自身 独特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。
SUCCESS
THANK YOU
2019/5/5
琼脂糖凝胶载样缓冲液
溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰 FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无 关； 在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率 约与长约300bp的线性双链DNA相同，而二甲 苯氰FF约与长4kb的DNA相同。在0.5%-1.4% 浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。
电泳技术的分类
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电 泳（有支持体）两大类。
自由电泳包括 Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等 电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。
区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层 电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝 胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素 粉，玻璃粉，硅胶等)、凝胶支持体区带电泳（琼 脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。
分子生物学实验技术 专题
分子生物学实验技术专题
凝胶电泳技术
• 琼脂糖凝胶电泳 • 聚丙烯酰胺凝胶电泳
分子杂交技术
• Southern blot • Northern blot