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现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。
工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。
（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13Eco R IH Ham H IBacillus amyloliquefaciensHaemophilus influenzae Rd Hin d III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。
若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。
1．分别说出5种以上RNA的功能？转运RNA tRNA 转运氨基酸核蛋白体RNA rRNA 核蛋白体组成成信使RNA mRNA 蛋白质合成模板不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前体小核RNA snRNA 参与hnRNA的剪接小胞浆RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分反义RNA anRNA/micRNA 对基因的表达起调节作用核酶Ribozyme RNA 有酶活性的RN2．原核生物与真核生物启动子的主要差别？原核生物TTGACA --- TA TAA T------起始位点-35 -10真核生物增强子---GC ---CAA T----TA TAA—5mGpp—起始位点-110 -70 -253.对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。
b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。
c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。
d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。
e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件4、利用双脱氧末端终止法（Sanger法）测定DNA一级结构的原理与方法？原理是采用核苷酸链终止剂—2，，3，-双脱氧核苷酸终止DNA的延长。
由于它缺少形成3/5/磷酸二脂键所需要的3-OH，一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。
根据碱基配对原则，每当DNA聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP。
根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段。
方法是分成四组分别为ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反应后，聚丙烯酰胺凝胶电泳按泳带可读出DNA序列5、激活蛋白（CAP）对转录的正调控作用？环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMPactivated protein ）。
名词解释：3．DNA聚合酶(DNApolymerase)：指以脱氧核苷三磷酸为底物，按5’→3’方向合成DNA的一类酶，反应条件：4种脱氧核苷三磷酸、Mg+、模板、引物。
DNA 聚合酶是多功能酶，除具有聚合作用外，还具有其它功能，不同DNA聚合酶所具有的功能不同。
4．解旋酶(helicase)：是一类通过水解ATP提供能量，使DNA双螺旋两条链分开的酶，每解开一对碱基，水解2分子ATP。
5．拓扑异构酶(topoisomerase)：是一类引起DNA拓扑异构反应的酶，分为两类：类型I的酶能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，类型Ⅱ的酶能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时，需要由ATP 供给能量。
6．单链DNA结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：是一类特异性和单链区DNA结合的蛋白质。
它的功能在于稳定DNA解开的单链，阻止复性和保护单链部分不被核酸酶降解。
7．DNA连接酶(DNAligase)：是专门催化双链DNA中缺口共价连接的酶，不能催化两条游离的单链DNA链间形成磷酸二酯键。
反应需要能量。
10．前导链(1eadingstrand)：在DNA复制过程中，以亲代链(3’→5’为模板时，子代链的合成(5’→3’)是连续的．这条能连续合成的链称前导链。
11．冈崎片段(Okazakifragment)、后随链(1aggingstrand)：在DNA复制过程中，以亲代链(5’→3’)为模板时，子代链的合成不能以3’→5’方向进行，而是按5’→3’方向合成出许多小片段，因为是冈崎等人研究发现，因此称冈崎片段。
由许多冈崎片段连接而成的子代链称为后随链。
12．半不连续复制(Semidiscontinuousreplication)：在DNA复制过程中，一条链的合成是连续的，另一条链的合成是不连续的，所以叫做半不连续复制。
14．修复(repair)：除去DNA上的损伤，恢复DNA的正常结构和功能是生物机体的一种保护功能。
名词解释：1.Leading strand & Lagging strandLeading strand（前导链）：在一个复制叉上进行的DNA合成是半不连续的。
其中一股新生链的合成方向与其模板的解链方向一致，所以解链与合成可以同时进行，合成是连续的，这股新生链被称为前导链。
Lagging strand（后随链）：而另一股新生链的合成方向与其模板的解链方向相反，只能先解开一段模板，再合成一股新生链，合成是不连续的，这股新生链被称为后随链。
2.Coding strand & Template strand分子中的核苷酸序列是同DNA双链中一条脱氧核苷酸链的序列相互补，转录RNA分子的这条DNA链称为DNA的模板链，另一条链称为该基因的编码链。
Template strand（编码链）：指导正链DNA合成的DNA是负链DNA，通常称为编码链Coding strand（模板链）：指导负链DNA合成的DNA是正链DNA，通常称为模板链3.选择性剪接&编辑选择性剪接：通过加工除去初级转录产物中的内含子，连接外显子，成为成熟RNA分子，这一过程成为剪接。
选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
编辑：编辑是指在转录后加工时改变RNA的编码序列，结果使遗传信息在转录水平时发生改变，使一个基因可以编码多种蛋白质。
4.SD序列&Kozak 序列SD序列：存在于原核生物起始密码子AUG上游7~12个核苷酸处的一种4~7个核苷酸的保守序列，它与16SrRNA3’端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译。
Kozak 序列：存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用，核糖体能够识别mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。
5.操纵子&多顺反子mRNA操纵子：操纵子是原核生物绝大多数基因的表达单位，由操纵基因和受操纵基因调控的一组结构基因组成。
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
第二章DNA复制复习题与答案一、名词解释1．中心法则2．半保留复制3．DNA聚合酶4．解旋酶5．拓扑异构酶6. 单链DNA结合蛋白7. DNA连接酶8. 引物酶及引发体9．复制叉10. 复制眼11. 前导链12. 冈崎片段13．半不连续复制14．切除修复15．重组修复16. 诱导修复和应急反应二、问答题1．试述Meselson和Stahl关于DNA半保留复制的证明实验。
2．描述大肠杆菌DNA聚合酶I在DNA生物合成过程中的作用。
3．试述DNA复制过程，总结DNA复制的基本规律。
4．DNA的损伤原因是什么?三、填空题1．Meselson-Stahl的DNA半保留复制证实试验中，区别不同DNA用_______方法。
分离不同DNA用_______方法，测定DNA含量用_______方法，2．DNA聚合酶I(E．coli)的生物功能有_______、_______和_______作用。
用蛋白水解酶作用DNA聚合酶I，可将其分为大、小两个片段，其中_______片段叫Klenow 片段，具有_______和_______作用，另外一个片段具有_______活性。
3．在E．coli中，使DNA链延长的主要聚合酶是_______，它由_______亚基组成。
DNA 聚合酶Ⅱ主要负责DNA的_______作用。
4．真核生物DNA聚合酶有_______，_______，_______，_______。
其中在DNA复制中起主要作用的是_______和_______。
5．解旋酶的作用是_______，反应需要提供能量，结合在后随链模板上的解旋酶，移动方向_______，结合在前导链的rep蛋白，移动方向_______。
6．在DNA复制过程中，改变DNA螺旋程度的酶叫_______。
7．SSB的中文名称_______，功能特点是_______。
8．DNA连接酶只能催化_______链DNA中的缺口形成3’,5’- 磷酸二酯键，不能催化两条链间形成3’,5’- 磷酸二酯键，真核生物DNA连接酶以_______作为能源，大肠杆菌则以作为能源，DNA连接酶在DNA______、________、_______中起作用。
基因工程的核心技术是( )技术基因工程的核心技术是（DNA的重组）技术DNA重组技术一般知第一节工具酶基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（ligase）；要结合基因或其中的一个片段，需要DNA酶（DNa polymerase）等。
因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所要用的酶统称为工具酶。
一、DNA限制性内切酶Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了噬菌体λ的限制作用，即用一种λ噬菌体在一种宿主细胞生长良好，但在另一种宿主细胞中生长很差，其原因在于它的DNA受到后一种宿主的“限制”。
由此发现了限制-修饰系统。
各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。
这些酶切割DNA的双链，因为它们的功能就是切割DNA，限制外源性DNA存在于自身细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。
合成限制酶的细胞自身的DNA可以不受这种酶的作用，因为细胞还合成了一种修饰酶，它改变了限制酶识别的DNA顺序的结构，使限制酶不能起作用。
限制-修饰系统是细胞的一种防卫手段。
如果用噬菌体去感染限制-修饰系统有活性的细菌，噬菌体DNA 没有先经修饰，它与先经修饰的噬菌体相比，感染效率要低几个数量级。
未经修饰的噬菌体DNA进入细胞后被限制酶切成片段，片段的数目与DNA分子中限制酶的识别点数目成正比，这些片段进一步被细胞的核酸外切酶降解，就会开始裂解感染，由此产生的子代噬菌体全部带有修饰过的DNA，因此能以很高的效率去感染另一些具有相同限制-修饰系统的细菌。
目前，从各种生物中分离出的限制性内切酶已超过175种，其中80多种是切割DNA双链。
（一）命名原则限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。
