分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解

分子克隆实验流程一、引物的稀释1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min；2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2µL ddH2O至100µM；3、稀释至10µM（5µL引物F+5µL引物R+40µL ddH2O）二、目的基因的扩增实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。

扩增体系：Reagent 25µL 50µL10xbuffer (含Mg2+) 2.5µL 5µLdNTP (10mM) 0.5µL 1µLrT aq酶0.25μL0.5μLprimer (10μM) 1.25μL 2.5μLTemplate DNA 2μL4μLddH2O 18.5µL 37µL反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）95℃预变性3min（95℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸45s）x3572℃后延伸7min4℃保持电泳：120V，加2µLloading buffer，上样5µL，1000bp marker 5µL小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE三、目的产物切胶回收（试剂盒）四、连接实验前准备：SolutionI在冰上融化连接体系：Reagent 10µL胶回收DNA(50ng/μL)4µLPDM-18T载体1µLSolution I 5µL反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/ 4℃过夜五、转化实验前准备：开启42℃水浴锅实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻；2、每管分装30 - 50μL感受态细胞（冰浴）；3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。

分子克隆的五个步骤1 选择载体：在分子克隆的过程中，首先需要选择一种合适的载体来实现这一过程。

载体是要被克隆的DNA片段，生物体中的某种大分子结构，可以为克隆提供容器。

一般来说，载体选择最好是含有可重复使用的重组信息，如使用多种重组酶克隆更为容易和可靠，能在实验室之间转移。

该步骤需要考虑选择对于试验类型最合理、在实验中表现最佳的载体，与之相符的必要条件是有可操作和稳定的复制介质，以及品质可靠、价格相对划算的供应商。

2 将载体与要克隆的DNA片段连接：接下来需要将载体与要克隆的DNA片段连接。

这样一来，DNA片段就会受到载体中的重组酶以及其余细菌特有的信息影响，从而生存，复制，得以分离，克隆出多个相同的DNA断片。

连接DNA片段和载体的技术有各种方法，最常见的方法为用复制酶切割载体的方法，这种技术利用重组酶将DNA片段片段插入载体结构中，实现载体与DNA片段的融合。

3 转化：经过第二步的操作，则可以将融合的载体片段转入细菌，进行转化，实现将载体片段覆盖到细菌细胞中，形成细菌外源DNA的转基因，从而使细菌体系内发生变化，从而开始转化过程。

4 筛选：经过第三步的转化，载体就可以移植到细菌体内，从而形成转基因细菌，这时候就可以采用测试细胞以及一些标记物质来进行筛选，将转基因细菌与其他细菌相区分开来，根据一些指定条件进行筛选，从而得到被克隆的特异性DNA片段，实现分子克隆的目的。

5 收集：经过第四步的筛选，就可以将特异性的DNA断片收集起来，被收集的DNA断裂片段就是分子克隆的结果，可以得到被克隆的特异性DNA 断片，将其用于进一步的研究。

最后，分子克隆是一种复杂的实验过程，需要经过以上5个步骤，才能实现分子克隆的目的，如正确选择载体、把该DNA片段片段插入载体结构、将融合的载体片段转入细菌、用测试细胞以及一些标记物质对转基因细菌进行筛选，从而得到被克隆DNA片段，最终收集被克隆的DNA断片，这样就可以实现分子克隆的目的，得出满意的实验结果。

分子克隆的步骤及原理分子克隆是利用重组DNA技术复制特定的DNA片段并将其插入到另一个DNA分子中的过程。

它是许多生物学和医学研究中常用的技术，例如用于研究基因结构和功能、制备重组蛋白以及研发基因治疗等。

第一步是选择并提取目标DNA片段。

一般情况下，需要从生物体中提取DNA，例如通过PCR扩增或酶切来获取所需片段。

PCR是一种酶链反应技术，通过引物引导DNA的聚合酶在一系列温度循环中合成DNA。

酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列来获得目标DNA片段。

第二步是将目标DNA片段插入载体DNA中。

载体DNA是一段能够自主在细胞中复制的DNA分子。

常用的载体包括质粒和噬菌体。

目标DNA片段需要与载体DNA进行连接，形成重组DNA。

连接主要通过DNA连接酶的作用，与连接酶反应的连接体包括连接酶本身、大肠杆菌DNA连接酶I（T4 DNA连接酶由细菌染色体T4噬菌体中提取的）、T4 ligation buffer （限制性内切酶的缓冲液通用成分+乙醇和内切酶）。

连接后的重组DNA 可以通过转化作用导入到宿主细胞中。

第三步是将重组DNA导入宿主细胞。

转化是将外源的DNA片段导入到细胞中的过程。

常用的转化方法包括化学转化和电转化。

化学转化是通过改变细胞的物理状态和细菌细胞表面的荷电状态，使其能够非特异性地吸附DNA质粒。

电转化则是通过电场作用使DNA穿透细胞膜，进入细胞。

最后一步是筛选和分离重组的细胞。

由于重组细胞中带有插入的目标DNA片段，因此可以通过筛选技术来判断哪些细胞中含有目标DNA。

常用的筛选方法包括抗生素耐药筛选和荧光蛋白筛选。

在抗生素耐药筛选中，重组细胞会在含有特定抗生素的培养基中生长，而未转化的细胞则会被抑制。

在荧光蛋白筛选中，以荧光蛋白为报告基因，使转化的细胞能够呈现出荧光信号。

分子克隆的原理主要依赖于DNA的重组和复制。

DNA连接酶通过其黏末端连接酶活性，可以将目标DNA片段连接到载体DNA中形成重组DNA。

分子克隆技术的使用方法分子克隆技术是在分子生物学领域中最常用的一种实验方法，它可以帮助研究人员复制并分离出特定的DNA序列，用于进一步研究和应用。

分子克隆技术的使用方法主要包括DNA提取、限制性内切酶切割、连接反应、转化和筛选等步骤。

下面将对这些步骤逐一进行介绍。

首先，DNA提取是分子克隆技术的第一步，它的目的是从样品（例如细菌、植物或动物组织）中提取出目标DNA。

提取方法主要有酚/氯仿法、盐法和商用DNA提取试剂盒等。

在提取过程中，我们需要将样品细胞破裂，并通过使用蛋白酶分解蛋白质，最后通过乙酸盐、异丙醇等溶剂沉淀目标DNA。

其次，限制性内切酶是分子克隆技术中的关键工具，它能够识别并切割DNA 的特定序列。

在实验中，我们选择与目标DNA序列相匹配的限制性内切酶，将其与目标DNA一起反应，酶可以精确切割DNA链，产生特定的末端序列。

这样的切割可以生成需要的DNA片段用于后续的连接反应。

连接反应是分子克隆技术的核心步骤，通过该步骤可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来。

通常情况下，载体DNA是一种循环的DNA分子，如质粒或噬菌体。

在连接反应中，我们需要将目标DNA片段与已经经过限制性内切酶切割处理的载体DNA进行连接。

连接反应可以使用DNA连接酶和缓冲液，在适当的温度下进行反应。

连接反应的最终产物是重组载体，内含目标DNA的插入片段。

然后，转化是将重组载体导入到宿主细胞中的过程。

对于大多数分子克隆实验来说，大肠杆菌是最常见的宿主细胞。

在转化过程中，我们需要将重组载体与宿主细胞共同处理，使其能够进入细胞内。

转化方法主要有热激、电击和化学法等。

通过转化，重组载体可以复制并表达其携带的目标DNA片段。

最后，筛选是分子克隆技术中的关键步骤，它可以确定是否成功克隆了目标DNA片段。

筛选依赖于所克隆目标的特性和选择的标记方法。

常用的筛选方法包括酶切鉴定、PCR扩增、限制性酶切图谱分析以及DNA序列分析等。

这些方法可以帮助我们鉴定和验证克隆的目标DNA片段是否符合预期。

分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。

其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。

以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。

PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。

PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。

PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。

-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。

-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。

-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。

扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。

多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。

限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。

内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。

通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。

连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。

连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。

连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。

转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。

转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。

转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。

筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。

通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。

技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。

分子克隆技术实验操作手册《分子克隆技术》实验操作手册李香花吴昌银邢永忠华中农业大学生命科学技术学院课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。

分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。

实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆、分子杂交和表达检测三部分分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。

本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。

分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting 等。

Southern blotting是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。

DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素或DIG)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经显影或显色显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。

本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。

系列一分子克隆技术实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。

质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。

质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。

本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。

实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

分子克隆操作程序操作程序1 实验试剂及仪器1.1 试剂：质粒DNA小量试剂盒DNA 凝胶回收试剂盒DNA 产物回收试剂盒DNA 产物回收试剂盒Pfu，DNA marker，感受态DH5αBamHI酶，XhoI酶，EcoRI酶，T4 DNA ligase 1.2 实验仪器：PCR仪离心机凝胶成像系统：Tanon 2500，天能公司1.3 耗材：实验中所用到的PCR管，枪头2 试验步骤2.1 引物的稀释2.1.1引物一般以干粉形式保存于-20℃，临用前稀释。

12.1.2 由于引物呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前请先离心10,000rpm,1min,然后再慢慢打开管盖。

然后在装有引物的管内根据引物说明书加入双蒸水稀释至10uM，盖上管盖，充分上下振荡30秒，再次离心，小离心机30秒(管上标注好引物名称、浓度、稀释时间)2.2 PCR扩增反应体系在0.2ml离心管中加入以下成分：（做多管的时候可以把除引物模板以外的组分混合后分装）轻弹混匀，离心收集管壁上的液滴至管底, 在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如下（不同基因的退火温度以及延伸时间略有差异,退火温度为引物Tm 上下5℃）94℃ 3 min94℃30sec58℃40sec72℃(1kb/min)2372℃ 8min4℃ ∞反应结束后，取2ulPCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并以DNA Marker 6ul 做对照。

120V 恒压条件下电泳20min 后，于凝胶成像系统下观察并将电泳图贴到记录本中（扩增产物大约30ng/μl ）2.3 PCR 产物的回收2.3.1 如果扩增产物条带单一用 Axygen AP-PCR-250纯化PCR 产物，具体操作按试剂盒说明书进行（回收产物用35ul ddH 2O 洗脱两遍）2.3.2 如果出现非特异性扩增， 目的产物用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收（AP-GX-250），具体操作按试剂盒说明书进行 （回收产物用35ul ddH 2O 洗脱两遍） 2.4目的产物及载体酶切目的产物酶切（在1.5ML 离心管中加入以下成分, 以BamHI 和XhoI 为例）振荡混匀，短暂离心； 载体酶切（载体使用中抽质粒试剂盒）37℃温育过夜；80℃水浴20min 终止反应2.5 酶切产物回收酶切产物用DNA 产物回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行（目的产物酶切用35ul ddH2O 洗脱两遍，载体酶切用50ul ddH2O 洗脱两遍），将电泳图贴到记录本中。

一、实验目的1. 掌握分子亚克隆的基本原理和方法；2. 学会利用PCR技术扩增目的基因片段；3. 熟悉DNA凝胶电泳、DNA连接、转化等分子克隆技术；4. 提高实验操作技能和数据分析能力。

二、实验原理分子亚克隆是指将目的基因片段插入到载体中，从而构建基因表达载体。

实验原理主要包括以下步骤：1. PCR扩增：利用PCR技术扩增目的基因片段；2. 凝胶电泳：分离PCR产物，确定目的基因片段大小；3. DNA连接：将目的基因片段与载体连接；4. 转化：将连接产物转化到宿主细胞中；5. 阳性克隆筛选：通过PCR、测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。

三、实验材料1. 试剂：PCR试剂盒、DNA连接酶、限制性内切酶、DNA标记物、质粒等；2. 仪器：PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、离心机、移液器等；3. 细胞：大肠杆菌DH5α等。

四、实验步骤1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计引物，确保引物长度在18-25bp之间，G+C 含量在40-60%之间。

（2）PCR反应：按照PCR试剂盒说明书进行PCR反应，包括变性、退火、延伸等步骤。

2. 凝胶电泳（1）配制琼脂糖凝胶：按照实验要求配制琼脂糖凝胶。

（2）加样：将PCR产物加入琼脂糖凝胶孔中。

（3）电泳：设置合适的电压和时间进行电泳。

（4）观察结果：通过凝胶成像系统观察电泳结果，确定目的基因片段大小。

3. DNA连接（1）酶切：将载体和PCR产物分别进行限制性内切酶酶切。

（2）连接：按照DNA连接酶说明书进行DNA连接反应。

4. 转化（1）制备感受态细胞：按照大肠杆菌DH5α感受态细胞制备方法进行。

（2）转化：将连接产物与感受态细胞混合，进行热冲击转化。

（3）涂布：将转化后的细胞涂布在含有抗生素的琼脂糖平板上。

5. 阳性克隆筛选（1）PCR检测：对涂布后的平板进行PCR检测，筛选出含有目的基因的克隆。

（2）测序：对阳性克隆进行测序，验证目的基因序列的正确性。

分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。

下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。

这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。

2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。

此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。

3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。

例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。

4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。

这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。

5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。

这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。

转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。

6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。

这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。

只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。

7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。

这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。

8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。

这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。

9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。

这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。

分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。

虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。

分子克隆详细步骤分子克隆是通过重组DNA分子来产生大量完全相同的DNA序列的技术。

在分子克隆工作中，我们主要进行克隆载体的构建、目标DNA的扩增、将目标DNA插入克隆载体中、转化和筛选等步骤。

下面将详细介绍这些步骤：1.克隆载体的构建：克隆载体是用于插入目标DNA的DNA分子。

常用的克隆载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。

在构建克隆载体时，我们首先需要选择适合的载体，并提取载体的DNA。

然后，利用酶切酶对载体进行酶切，生成线性的载体DNA。

接下来，将目标DNA插入克隆载体的相应位点上，形成重组的载体。

2.目标DNA的扩增：目标DNA可以通过PCR（聚合酶链反应）来扩增。

首先，设计引物，使其与目标DNA的两端末端相互互补。

然后，在PCR反应中，通过DNA聚合酶的扩增作用，使目标DNA得以扩增。

PCR反应通常包括模板DNA、引物、核苷酸和聚合酶等成分。

3.目标DNA的插入：将扩增后的目标DNA与酶切后的载体进行连接，利用DNA连接酶催化目标DNA与载体之间的连接反应，生成重组的克隆载体。

连接后的载体含有目标DNA的序列。

4.转化：将克隆载体引入宿主细胞中进行复制。

这一步骤通常称为转化。

转化可以通过电击、热激、化学方法等方式进行。

宿主细胞通常是大肠杆菌等细菌。

5.筛选：利用筛选方法来选择包含目标DNA的克隆。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、报告基因筛选和限制性内切酶酶切筛选等。

抗生素筛选是将带有选择性抗生素耐受基因的克隆引入含有相应抗生素的培养基中，只有带有目标DNA的克隆才能生长。

报告基因筛选是通过将报告基因插入克隆载体中，使之与目标DNA一起被转录和翻译，从而表达报告基因的蛋白质，以此来筛选包含目标DNA的克隆。

限制性内切酶酶切筛选是通过限制性内切酶对重组载体和目标DNA进行酶切，并通过凝胶电泳的方法来分离并检测含有目标DNA的克隆。

以上就是分子克隆的详细步骤。

通过这些步骤，我们可以获得大量完全相同的DNA序列，并用于各类分子生物学研究和应用中。

分子克隆步骤：一、贴壁细胞总RNA提取：1、吸掉培养液，用PBS洗一遍?2、往培养皿中加入1ml,TRIzol,吹打几次(每10cm2面积,即3.5cm直径的培养板加1ml)3、移至1.5mlEP管，静置5分钟4、加入200ul三氯甲烷，震荡混匀，室温静置5分钟5、4度12000r/min，离心15分钟，取上清，约600ul6、加入500ul异丙醇，混匀后，静置30分钟？7、4度12000r/min，离心15分钟，弃上清8、加入1ml70%预冷酒精洗涤沉淀物9、4度7500r/min，离心5分钟10、弃上清，自然晾干11、加入50ulDEPC水溶解，测OD值＊鼠尾基因组DNA粗提取：1、100ul lysis buffer for each tail,and 2ul 10mg/ml PK,55℃,overnight.2、Then,100℃ for 10min to denature the PK, use 0.5~1ul lysate as template to do PCR.Lysis buffer:(store at 4℃)KCl 0.5MTris 0.1MNP-40 1%Tween-20 1%二、RT-PCR：1、预变性体系12ul：Total RNA 2ulOligo（dT18）primer 1ulDH water 9ul65℃ 5min 速置冰上2、RT体系：20ul：预变性体系12ul5×buffer 4ulRNAase inhibiter 1ul10m dNTP 2ulMMLV 1ul42℃ 60min70℃ 5min12℃ forever3、PCR体系20ul：10×buffer 2ul10m dNTP 0.5ulPrimer(F+R) 1ul （0.5ul+0.5ul）稀释后cDNA（50ul）1ulPfu 0.2uldd water 15.3ul95℃3min、（95℃30s，55℃30s，72℃35s）×29cycle、72℃10min、12℃forever三、跑胶鉴定PCR产物：四、醇沉PCR产物：1、将PCR产物转移至1.5mlEP管中2、加入0.1倍体积预冷NaAC，3倍体积70%预冷乙醇，混匀3、—80℃静置30min4、4度14000r/min，10min离心弃上清，加1ml70%预冷乙醇洗涤沉淀5、4度14000r/min，10min离心弃上清，自然晾干6、加入25-20ul dd water 吹匀静置10-20min待溶解五、原始质粒/PCR醇沉产物双酶切体系50ul：Enzyme1 1ulEnzyme2 1ul10×Buffer 5ul （在体系中被稀释成1×）10×BSA 5ul （看需要）Template 1ugADD dd water to 50ul酶切过夜？六、单独鉴定质粒酶切产物：1、采用20ul体系：酶各0.5ul、buffer2ul、bsa0.5ul、template2ul）酶切2h2、跑胶鉴定七、电泳，切胶回收与纯化：使用DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）PCR酶切产物纯化：1.将PCR产物于需要的电压和电流下跑电泳2. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。

分子克隆实验指南分子克隆技术是一种常用的实验手段，常用于生物学和医学领域的研究中。

这种方法可以通过将DNA分子插入到载体DNA中来制备重组DNA分子，从而达到扩增特定的DNA序列或者表达生物活性分子的目的。

分子克隆技术的原理基于DNA的重组，重组的过程通常需要以下几个步骤：1、DNA的裂解和切割：要将DNA进行克隆，首先需要将待操作的DNA裂解并用酶切成适量的小片段。

2、载体的制备：载体是与待操作的DNA进行克隆的中介物，这种载体通常采用环状DNA分子质粒，也可以采用噬菌体等其它病毒。

3、DNA的连接：将切割后的DNA与载体对应的DNA片段通过酶的帮助连接起来，形成重组的DNA分子。

4、转化：将重组的DNA分子转化到细胞中。

5、筛选：对表达成功的细胞进行筛选，得到所需要的DNA片段。

下面是一份分子克隆实验指南，供研究人员参考：1、准备实验室条件：保持实验室的清洁和安全，坚持使用一次性的实验用品，保证环境的无菌。

2、准备所需材料：重组酶、DNA、载体、培养基、试剂、菌种等。

3、DNA的制备：使用DNA分离试剂盒将所需的DNA样本从细胞中提取出来，并通过酶的作用将其切割成适当的长度。

4、制备载体：将载体放入匀质的培养基中，通过质粒扩增技术制备大量的载体。

5、连接重组：使用重组酶将切割后的DNA与载体片段连接起来。

6、转化实验：将重组的DNA分子转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，青霉素或氨苄青霉素选择性筛选能力。

7、筛选：将所需的表达目标转移到含有感光荧光素物质的培养基中，观察感光荧光，达到筛选的目的。

8、挑选合适的细胞：将所得的高荧光表达细胞进行挑选，进行康复培养。

9、提取所需重组蛋白：采取适当的提取方法对获得的细胞进行处理，得到所需的重组蛋白。

总之，分子克隆技术是一种非常重要的实验手段，该技术的应用范围很广，能够扩大DNA等分子，开启了生物医学研究的大门，为生命科学研究做出了重要的贡献。

分子克隆的步骤及原理基本原理克隆开始前至少需要两个重要的DNA分子。

首先，您需要要克隆的DNA片段，也称为插入片段。

它可以来自原核，真核，灭绝的生物，也可以在实验室中人工创造。

通过使用分子克隆，我们可以更多地了解特定基因的功能。

其次，你需要一个矢量。

载体是用作分子生物学工具的质粒DNA，用于制备更多拷贝或从某种基因产生蛋白质。

质粒是载体的一个例子，是由细菌复制的圆形，染色体外的DNA。

质粒通常具有多克隆位点或MCS，该区域含有不同限制性内切核酸酶的识别位点，也称为限制酶。

可以通过称为连接的技术将不同的插入物掺入质粒中。

载体质粒还含有复制起点，使其可以在细菌中复制。

另外，质粒具有抗生素基因。

如果细菌整合了质粒，它将在含有抗生素的培养基中存活。

这允许选择已经成功转化的细菌。

将插入物和载体克隆到宿主细胞的生物体中，最常用于分子克隆的是大肠杆菌。

大肠杆菌生长迅速，可广泛获得并且具有许多可商购的不同克隆载体。

真核生物，如酵母，也可用作载体生物。

一般分子克隆方法的第一步是获得所需的插入物，其可以来自任何细胞类型的DNA或mRNA。

然后根据插入物的类型选择最佳载体及其宿主生物，最终将用它完成。

聚合酶链式反应或基于PCR的方法通常用于复制插入物。

然后，使用一系列酶促反应，将消化插入物连接在一起并引入宿主生物体中以进行大量复制。

从细菌中纯化重复的载体，并在限制性消化后，在凝胶上分析。

然后将在凝胶上纯化的片段送去测序以验证该奖章是所需的DNA片段。

操作过程(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA 片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。

(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。

在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。

分子克隆实验流程分子克隆是将DNA分子从一个生物体中复制并插入另一个生物体中的过程。

这种技术广泛应用于生物学研究和生物工程领域。

下面将详细介绍分子克隆的实验流程。

1.提取DNA首先，需要从源生物体中提取所需的DNA。

这可以通过不同的方法来完成，例如琼脂糖凝胶电泳、菌落PCR和基因组DNA提取试剂盒等。

提取的DNA需要是目标基因的完整、纯净的样本。

2.回收DNA片段将提取的DNA片段和载体（例如质粒）切割，以回收想要克隆的DNA 片段。

常用的酶剪切酶包括限制性内切酶和退火酶。

将酶切割后的DNA片段与载体的切割端黏合，形成重组DNA。

3.转化纯化将重组DNA转化到宿主细胞中。

通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。

这可以通过脉冲电击、热激转化或化学转化来实现。

这一步的目的是将重组DNA导入到宿主细胞中，以便宿主细胞可以复制和表达克隆的DNA。

4.鉴定克隆细胞通常，我们通过选择性培养、荧光染色、PCR检测等方法来鉴定具有克隆DNA的细胞。

在选择性培养基上生长可以表明细胞成功地接受了重组DNA。

此外，如果重组DNA带有可观察的荧光标记，可以使用荧光显微镜进行观察。

PCR检测可以验证目标基因的存在。

5.扩增克隆细胞选取鉴定出的克隆细胞进行扩增。

这可以通过将克隆细胞培养在含有选择性抗生素的培养基上来实现。

只有带有插入DNA的细胞可以在这种培养条件下生存。

选择性培养的目的是增加克隆细胞的数量，以便后续的实验。

6.提取插入DNA从扩增的克隆细胞中提取含有插入DNA的重组质粒。

通常使用薄膜过滤法将细菌细胞去除，然后使用DNA提取试剂盒从细菌残渣中提取质粒。

提取的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行纯化和鉴定。

7.鉴定插入DNA使用不同的试验方法来鉴定插入DNA的准确性和完整性。

这可能包括核酸测序、酶切鉴定、PCR扩增等。

通过这些方法可以验证克隆的DNA是否与目标基因的序列完全一致。

8.进一步应用得到插入DNA后，可以进行进一步的应用，例如重组蛋白表达、基因改良、产生转基因生物等。

分子克隆实验指南分子克隆是现代生物学领域的一项核心技术，也是基因研究、药物研发和农业开发过程中必不可少的手段之一。

在这篇指南中，我将会简要介绍如何进行分子克隆实验，以帮助初学者更好地理解、掌握这项技术。

同时，我也建议实验者在进行实验前，详细阅读当地的安全操作规程，并在合适的实验室环境中进行操作。

一、材料准备在进行分子克隆实验前，我们需要准备以下材料和试剂：1. DNA的扩增产物和载体DNA2. 限制性内切酶3. T4 DNA连接酶4. 细菌菌种5. 热激酶6. 磷酸缓冲液7. 离心管、PCR管、琼脂糖凝胶和电泳槽等相关实验器材。

二、实验步骤1. PCR扩增将目标DNA扩增出来，制备扩增产物。

同时，也需要提纯产物，将其溶于蒸馏水中，以备后续操作。

2. DNA限制性内切酶切割选择两种限制酶，将目标DNA和载体DNA分别切割。

切割产品应该能够被T4 DNA连接酶形成连接。

在T4 DNA连接酶形成连接的基础上，我们需要将其转化到大肠杆菌等细菌中进行培养。

3. DNA连接将切割后的DNA和载体DNA混合，加入T4DNA连接酶，进行DNA连接。

连接成功后，进行质粒的转化操作。

4. 质粒转化将DNA与转化者（例如大肠杆菌）一起培养几个小时，使其在培养基中繁殖生长。

之后，分离转化菌落，进行鉴定。

5. 鉴定正式的及相关标签元素为了确保成功的分子克隆，在选取符合需要的转化菌落后，除了进行相关的鉴定，还需要使用相关的标签元素。

这些标签元素可以用于识别有效的重组表达载体，并进行大规模的表达。

三、实验注意事项1. 选取嵌合体目标和载体的选择应按照相关配对的要求进行。

在酶切反应中，应注意酶的用量。

同时，也需要注意处理过程中不要将酶污染。

2. 进行DNA限制性内切酶切割时，应注意温度和反应时间。

3. 在进行DNA连接后，将混合物放置于水浴中，沸腾数分钟，以便DNA连接的更加稳定。

在连接DNAs之前，应该对酶进行热灭活。

4. 质粒转化后，为了鉴定高效的表达，需要进行多次筛选和鉴定。

分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介二、分子克隆实验材料与设备三、分子克隆实验步骤1.设计引物2.合成目的基因3.构建表达载体4.转化受体细胞5.筛选转化子6.鉴定目的基因四、分子克隆实验注意事项五、实验结果分析与应用正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，通过复制特定DNA序列，将目的基因在受体细胞中稳定表达。

该技术在基因工程、生物科学等领域具有广泛应用，有助于研究基因功能、蛋白质表达及药物筛选等。

二、分子克隆实验材料与设备1.实验材料：DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液等。

2.实验设备：PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。

三、分子克隆实验步骤1.设计引物根据目的基因序列，设计一对互补的引物。

引物应具备一定的特异性，避免非特异性扩增。

2.合成目的基因利用PCR技术，以DNA模板为基础，通过引物扩增目的基因。

反应条件需根据所使用DNA聚合酶的要求进行优化。

3.构建表达载体将目的基因与载体DNA连接，形成表达载体。

常用的载体有质粒、噬菌体等。

4.转化受体细胞将构建好的表达载体转化到受体细胞中，如大肠杆菌、酵母等。

转化方法有化学法、电转化法等。

5.筛选转化子转化后的受体细胞在含相应抗生素的培养基上生长，筛选出含有目的基因的转化子。

6.鉴定目的基因对筛选出的转化子进行进一步鉴定，如DNA测序、基因表达分析等。

四、分子克隆实验注意事项1.实验过程中要保持无菌操作，避免污染。

2.选择合适的引物长度和退火温度，以提高扩增特异性。

3.转化受体细胞时，注意操作力度，避免细胞损伤。

4.筛选转化子时，严格控制抗生素浓度，避免过度筛选。

五、实验结果分析与应用1.分析PCR产物，判断目的基因是否成功克隆。

2.鉴定目的基因的表达水平，评估实验效果。

3.将成功克隆的目的基因应用于基因敲除、基因表达等研究。

通过以上步骤，您可以顺利完成分子克隆实验。

实验过程中需严格操作，确保实验结果的准确性。

一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。

种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。

二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。

取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。

目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。

重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。

（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。

插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。

2、跑胶：单位厘米/5-10v。

所以大槽25cm，150v即可。

小槽100v即可。

3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。

分子克隆实验标准步骤一、常规分子克隆实验流程：?确定目的片段的基因序列以及需要插入的载体?引物设计软件或网站设计引物?PCR扩增目的基因片段?PCR产物的回收?载体的酶切?插入片段的酶切（重组不需要酶切）引物设计PCR扩增酶切连接或重组?载体与目的片段的连接或重组?连接或重组产物转化大肠杆菌感受态?涂布平板?平板菌落的鉴定?阳性克隆送测序?测序结果的分析转化鉴定序列比对二、分子克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR扩增目的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo（TOYOBO）为例体系（50ul）：10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ulMg2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ulddH2O up to 50ul程序：95℃2min 98℃10s58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞2. PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。

胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。

在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。

③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。

④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。

制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。

3. 试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3）以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

分子克隆技术步骤第一步：选取目标DNA在开始分子克隆之前，需要从一个生物体中选择一个含有所需DNA序列的样本。

这可以是任何生物体的DNA，例如人类、动物、植物或微生物。

第二步：DNA提取从所选生物体提取DNA。

这可以通过使用一系列化学和物理方法来完成，例如细胞裂解、蛋白酶处理、DNA沉淀和洗涤等。

第三步：选择一个合适的载体载体是一种DNA分子，可以容纳目标DNA序列并将其复制。

在分子克隆中最常使用的载体是质粒。

质粒是圆形的双链DNA分子，存在于许多细菌和酵母种类中，并被广泛用于分子生物学研究。

第四步：限制性内切酶切割将目标DNA和载体同时使用限制性内切酶（Restriction Enzymes）酶切。

限制性内切酶是一种可以识别和切割特定DNA序列的酶。

通过在目标DNA和载体的特定位置上切割，可以为将两者连接提供互补的末端。

第五步：DNA连接将目标DNA和载体连接在一起。

将目标DNA和载体的DNA片段混合，并在其末端形成互补碱基，然后使用DNA连接酶将两者连接在一起。

连接后的DNA分子被称为重组质粒。

第六步：转化将重组质粒引入细菌或酵母等微生物细胞中，这个过程称为转化。

这可以通过将细菌细胞暴露在低温高压胁迫下来实现，使得细胞膜变得更加渗透性，可以将质粒引入细胞内。

第七步：筛选和鉴定筛选出含有重组质粒的细菌或酵母细胞。

一种常用的筛选方法是将细菌培养在含有抗生素的培养基上，只有携带重组质粒的细菌才能在含有抗生素的环境下存活。

此外，还可以使用标记基因和特定染色剂等方法来鉴定重组质粒。

第八步：扩增和纯化用培养液扩增含有重组质粒的细菌或酵母细胞。

随着细菌或酵母细胞的生长，它们会复制重组质粒并将其传递给后代细胞。

然后使用一系列纯化步骤，如离心、洗涤和电泳等手段，将其中的重组质粒提取纯化。

总结：分子克隆技术的主要步骤包括选取目标DNA、DNA提取、选择合适的载体、限制性内切酶切割、DNA连接、转化、筛选和鉴定，以及扩增和纯化。