生物化学实验

生 物 化 学 实 验 讲义

1 实验一、甲醛滴定法测定氨基氮

一、 实验目的：

初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。

二、 实验原理

氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：

对溶液氨基酸含量的测定主要依据平衡中电离H+的浓度来确定。因此，反应平衡应向右进行。

平衡向右的促进方式：1）增加底物的浓度——A、增加AA的浓度（本实验目的是测定氨基酸的含量，必须保证固定的氨基酸浓度；B、加碱，让H+电离。但—NH3+ 是弱酸，完全解离时pH为11~12或更高，若用碱滴定—NH3+所释放的H+ 不测量氨基酸，一般指示剂色域小于10，很难准确指示终点。因此，直接用碱滴定是不可行的。 2）降低产物的浓度——在本实验中用加入过量甲醛的方式：常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使平衡右移，促使—NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，同时也使滴定终点从强碱区域（pH11~12）移至弱碱区域（pH9.0左右）。而这一区域正好是酚酞的敏感变色区域(pH8~10)。因此，可用酚酞用指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定（刚好微红）。

由滴定所用的NaOH量就可计算出溶液中氨基酸的含量，这就称氨基酸的甲醛滴定法。如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。

当然，如样品是蛋白质水解液，（实际上是多种氨基酸的混合物），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但是，基本规律如下：当蛋白质水解时，放出游离的氨基，随着水解程度的增加，滴定值也增加。当滴定值不再增加，表示水解作用已完全。相反，蛋白质合成时游离氨基减少。因此，可以用此法测定溶液中的氨基量，就能大体判断出蛋白质水解或合成的进度。 NaOH中和

羟甲基氨基酸

二羟甲基氨基酸 生 物 化 学 实 验 讲义

2 三、 实验器材

1、25ml锥形瓶 2、微量滴定管 3、吸管 4、移液管

四、 实验试剂

1、0.1mol/L标准甘氨酸溶液 300ml

准确称取750mg甘氨酸，溶解后定容至100ml。

2、0.1mol/L 标准氢氧化钠溶液 500ml

3、酚酞指示剂 20ml

0.5%酚酞的50%乙醇溶液

4、中性醛溶液 400ml

在50ml 36%~37% 分析纯甲醛溶液中加入 1mL 0.1% 酚酞乙醇水溶液，用 0.1mol/L的NaOH溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前需重新中和。

五、 实验操作

1、 取3个25ml的锥形瓶，编号。向第2、3号瓶内各加入 2ml 0.1mol/L的标准甘氨酸溶液和 5mL 水，混匀。向1号瓶内加入 7mL水。然后向3个瓶中各加入 5滴酚酞指示剂，混匀后各加2mL甲醛溶液，再混们，分别用0.1mol/L标准氢氧化钠滴定至溶液显微红色。

重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的mL数。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。

编号

试剂 1

(Control) 2

(Standard Gly) 3

(Standard Gly) 4

(Sample) 5

(Sample)

甘氨酸（mL） 0 0.1mol/L Gly 2ml 0.1mol/L Gly 2ml 未知浓度 2ml 未知浓度 2ml

H2O (ml) 7 5 5 5 5

酚酞（滴） 5 5 5 5 5

甲醛（ml） 2 2 2 2 2

0.1mol/L NaOH

计算氨基氮

2、取未知浓度的甘氨酸溶液2mL，依上述方法进行测定，平行做两份（4、5号），取平均值。计算每mL甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg数。

六、 实验结果

1、氨基氮的回收率

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公式中实际测得量为滴定（2、3号）瓶消耗用的标准氢氧化钠溶液mL数的平均值与第1号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液mL数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008。

2mL乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘以14.008。即为加入理论量的mg数。

2、氨基氮的含量

式中：为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。为滴定对照液（2、3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。mol/LNaOH为标准氢氧化钠溶液的真实摩尔浓度。

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4 实验二、蛋白质的性质实验（一） 蛋白质及氨基酸的呈色反应

一、 实验目的：

1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。

3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

二、 实验原理（呈色反应）

蛋白质分子结构中某种化学键或氨基酸残基中的某些化学基团能与特定的化学试剂产生特定的有色物质，称为蛋白质的呈色反应。

各种蛋白质分子中氨基酸残基不完全相同，因此产生的颜色也不完全一样。当然呈色反应并不一定是蛋白质的专一反应，某些非蛋白质类物质也能产生类似折颜色。因此，不能仅仅根据呈色反应的结果来判断被测物质是否为蛋白质。

（一）双缩脲反应（Birut reaction）

1、原理

尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子有肽键。其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

注意：双缩脲反应不仅含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个—CS—NH2，— CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH，或—CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺（O=C（NH2）—C（NH2）=O等物质有此反应。 NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu(NH3)42+，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

2、 试剂

1）尿素 10g 3）2%硫酸铜溶液 60mL

2)10%氢氧化钠溶液 250mL 5）0.5 %Glu溶液

4）2%卵清蛋白溶液 (1:6) 80mL 加热 硫酸铜 生 物 化 学 实 验 讲义

5 鸡蛋清用蒸馏水稀释6倍，通过2~3层纱布滤去不溶物即得。

3、 操作

取少量尿素结晶（火柴头大小），放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨基酸，形成双缩脲。冷却备用，为1号。

再取两支：分别加入卵清蛋白溶液和Glu溶液，为2号和3号。

编 号 1 2 3

双缩脲（少许） 卵清蛋白（1ml） Glu(1ml)

10% NaOH （滴） 5 5

5

2% CuSO4 (滴) 1 1 1

现 象

在上述三支试管中分别进行如下操作：加10%氢氧化钠溶液约1mL（5滴），振荡混匀，再加2%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。摇匀，再加2%硫酸铜溶液1滴，随加随振荡。观察紫玫瑰色的出现。

（二）茚三酮反应

1、原理

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。

β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。

茚三酮反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个水合基本分子和氨缩合生成有色物质。反应机理如下：

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此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过在时甚至不显色。

2、试剂

1）蛋白质溶液 100mL 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1：6）

2）0.3% Glu溶液 80mL 3）0.1% 茚三酮水溶液 50mL

3、操作

取2支试管分别加入蛋白质溶液和Glu氨酸溶液1mL，再各加2~3滴0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉红色变紫红色再变蓝。

1（卵清蛋白） 2（Glu）

3 (Tyr)

体积（ml） 1 1 1

茚三酮（滴） 3 3 3

（三） 黄色反应

1、原理

含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下：

多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

2、试剂 生 物 化 学 实 验 讲义

7 1）鸡蛋清溶液 100mL 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。

2）头发 3）指甲

4）0.3%色氨酸溶液 10mL 5）0.3% 酪氨酸溶液 10mL

6）0.5%苯酚溶液 50mL 7）浓硝酸 200mL

8）40%氢氧化钠溶液 100mL

3、操作

向六个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置，或用微火加热。等各管出现黄色后，于室温下逐滴加入40%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。

管 号 1 2 3 4 5 6

材 料

（滴） 0.5%苯酚

4 鸡蛋清

4 指 甲

少 许 头 发

少 许 0.5%色氨酸

4 0.3%酪氨酸

4

浓硝酸/（滴） 4 2 8~10 8~10 4 4

显色时间

加氢氧化钠

现 象