第八章分子标记及其应用第八章分子标记及其应用1) 分子标记的种类与特点1. 遗传标记的种类与特点遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。
Minisatellites：小卫星序列遗传标记的种类与特点1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。
2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。
3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。
4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。
2. DNA分子标记DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。
2.1 分子标记的优点1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限；2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制;3）多态性高，自然存在，无须专门创造；4）表现为“中性”，即不影响性状的表达；5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。
2.2 分子标记的类型分三大类:1) 基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragmentlength polymorphism ），限制性片段长度多态性2) 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、 SCAR、STS等3) 基于DNA测序:第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等第三节分子标记的应用1. RFLP标记RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。
基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。
关键因素：限制酶：用一种酶切产生的多态性有限，常用6~8种酶来筛选多态性。
探针：常用单拷贝或低拷贝gDNA或cDNA克隆，否则条带模糊（smear），不易观察。
RFLP标记的优缺点优点：1）共显性；2）存在于整个基因组，位点数不受限制，常可检测到1~4个基因座；缺点：1）筛选多态性探针较困难，需一系列探针；2）DNA样本量要求大，操作较繁杂，耗时费资，同位素污染，现已发展地高辛等标记。
2. RAPD 标记RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：随机扩增多态性DNA。
1990年提出。
基本原理: 单引物PCR标记；不同基因组DNA在随机引物Arbitaryprimer （8~10bp）结合位点以及2个结合位点之间的距离可能不同，导致扩增片段数目和长度不同，经电泳分离显示出来，反映基因组相应区域DNA的多态性。
步骤：退火温度36℃左右，其余同普通PCR。
RAPD 标记的优缺点优点：1）简单快速，模板用量少，无需同位素；2）无需基因组序列信息，引物通用；3）成本低。
缺点：1）显性标记，不能鉴别杂合子与纯合子；2）稳定性和重复性较差；受很多因素影响：退火延伸温度，模板浓度，Mg2+浓度，试剂污染，应舍重复3）序列不同但长度相同的片段共迁移，使多态性检测受限制.只能分开片段长度不同的dna片段，对于长度相同但碱基组成不同的就分不出来3. AFLP标记AFLP (Amplified fragment length polymorphism)：扩增片段长度多态性，1992 年提出，RFLP与PCR相结合的产物。
基本原理: 基因组DNA限制酶切（1种为常见6碱基切点，另1种为4碱基稀有识别位点，常为EcoRI（6）/MseI（4）），酶切后DNA片段连接双链人工接头（14~18bp，核心顺序+限制酶识别序列，随机设计），以接头和相邻的限制酶位点作为引物结合位点，进行双引物PCR扩增，产物用高分辨力测序胶分离。
此多态性主要来自引物3`端选择性核苷酸的变化。
AFLP关键技术：引物的设计与组合。
引物由三部分组成:1) 5`端与人工接头互补;2) 中间部分与限制酶识别位点互补;3) 3`端为1~3个选择性核苷酸。
AFLP 图谱常用2~3个选择性碱基，每个泳道50~100条带AFLP标记的优缺点优点：1）兼具PCR的高效性与RFLP的准确性；2）常扩增50~100条带，多态性高，信息量大；3）通过设计不同接头就可得到不同的引物，无需基因组序列信息。
缺点:1）步骤多，流程长，重复性不够好；2）需放射性同位素或荧光素等标记引物，但目前已发展银染技术；3）显性标记。
4. SSR标记SSR（simple sequence repeat）：简单序列重复，也称微卫星(microsatelite) DNA，真核基因组中普遍存在，随机分布，主要位于非编码区；重复单元2~5 bp，串联重复10~60次，多态性主要来自串联重复次数的不同。
SSR标记的原理: 不同基因型某一特定位点的SSR长度不同, 但其侧翼序列往往是保守的单一序列，据此侧翼序列设计双引物，经PCR 扩增即可得到长度不同的SSR片段，产物经PAGE或高浓度琼脂糖凝胶电泳，即可显示不同基因型在此位点的多态性。
注：一般检测的是单一位点的复等位基因，农作物中多数SSR位点的复等位基因数多达十几甚至几十个，多态性高。
SSR侧翼序列的获得：（作为设计引物的模板）一般程序：1）建立基因组DNA的质粒文库；2）根据预得到的SSR类型设计并合成探针，如预获得(AT)n/(TA)n，则合成(AT)n探针；3）用探针筛库，获得阳性克隆；4）对阳性克隆DNA插入序列进行测序。
SSR标记的优缺点优点：1) 序列短，多数小于200bp，易扩增；2) 有高度多态性，信息量大；3) 共显性。
缺点：须获得侧翼序列设计引物，步骤多、费用高；引物具有物种特异性。
5. SNP标记SNP (single nucleotide polymorphism)：单核苷酸多态性，指不同基因组DNA中某一特定位置上单个核苷酸的差异，包括单碱基的转换、颠换、插入和缺失等，而且其在群体中出现的频率大于1%（如低于1%，则视为点突变，不可能作为标记）。
SNP的分布与遗传效应1）分布于编码区：即cSNP，功能性变异，可能会影响蛋白产物的氨基酸序列和功能。
2）分布于非编码区：即调节区/基因周边SNPs，可能影响基因的表达水平。
SNP是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素，有些疾病和性状与SNP有关，如人镰刀型细胞贫血症。
SNP的检测方法：有近百种，包括杂交法、熔解法、电泳法、酶学法、化学法、物理法、测序法（最直接）以及它们的组合方法，综合利用纳米材料技术、多重PCR技术、各种荧光探针设计技术和各种荧光标记技术等。
DNA芯片技术在高通量检测SNP方面显示出独特的优势，最理想、最具有发展潜力，但仍存在成本高、重复性不够好等问题。
SNP标记的优缺点优点：是覆盖全基因组、标记数量最大，多态性最高的标记，缺点：SNP技术主要建立在基因组测序基础之上，尚难在未测序生物上应用。
6. ISSRISSR：（inter-simple sequence repeat, ISSR）：区间-简单重复序列。
以加锚SSR寡聚核苷酸作引物，对位于反向排列的SSR之间的DNA序列进行扩增，而不是扩增SSR本身，反映SSR区间多态性。
ISSR引物设计：简单，无需知道DNA序列，长度16~18bp，由1~4bp组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，用以扩增两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列，只有与锚定碱基互补的位点才被靶定，提高了扩增的转一性。
单引物PCR标记。
7. SCARSCAR（sequence characterized amplification region）：特异序列扩增区域标记。
在对基因组DNA做了RAPD分析后，将目标RAPD片段克隆并进行末端测序；再根据2端序列设计特异引物，即前10个碱基应包括原来的RAPD 引物；用此引物对基因组DNA再扩增，即可将与原来RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。
8. STSSTS（sequence-tagged sites）：序列标签位点/序标位，是对以特异引物序列进行PCR扩增的一类分子标记的总称，用来扩增、分析基因组中特定区域的多态性第三节分子标记的应用1. 分子遗传图谱的构建经典遗传图谱：通过遗传重组分析，将基因或形态、生理和生化等常规标记在染色体上线性排列；标记数量少，图距大，饱和度低，应用价值有限。
分子标记遗传图谱：构建原理同上，利用DNA分子标记作图，高密度图谱。
已构建拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆等高密度分子遗传图谱，极大地促进了基因定位与克隆、物理图谱的构建和分子标记辅助选择育种等。
2. 基因定位与克隆2.1 基因定位质量性状基因定位：常用近等基因系(NIL，near isogenic lines )分析法和分离集团混合分析法 (BSA，Bulked segregation anlysis)。
近等基因系：是指两个或多个形态上相似，，遗传背景相同或相近，只在个别染色体区段上存在差异的遗传材料，通过杂交和回交获得。
数量性状基因座（QTL，quantitative trait loci ）定位：实质上是确定数量性状位点基因与分子标记间的连锁关系，QTL作图。
定位方法：1）单一标记定位法（single marker analysis）：利用某个标记与某个QTL的连锁关系，杂交后代出现两者之间的同分离现象，标记的不同基因型在数量性状的分布、均值和方差上存在差异，检验差异确定是否与QTL连锁2）区间定位法（interval mapping ，IM）：利用染色体上一个QTL两侧的一对标记，建立个体数量性状测量值对双侧标记基因型指示变量的线性回归关系，根据回归关系是否显著确定QTL的存在，位置和效应。
通过上述方法，筛选与目标基因紧密连锁的分子标记，进行快速基因定位。
2. 2基因图位克隆首先鉴定与目的基因紧密连锁的分子标记（通常要求在1cM之内），然后由这些标记去筛选大片段DNA文库(YACs或BACs)，鉴定出与标记有关的克隆，继之以亚克隆和染色体步查等获得含目的基因的克隆，再辅之以转化和互补测验加以确证。
（见前面第7章内容）图位克隆的基本流程：1）构建遗传图谱：目的基因初步定位→分子标记；2）构建物理图谱：局部区域的精细作图，目的基因精细定位(kb/cM)；3）构建基因组文库：BAC、YAC、Cosmid等；4）染色体步行或登陆：获得候选克隆→ 探针；5）筛选基因文库：获得目的克隆；6）鉴定目的基因。
