基因工程-第6章-基因文库的构建与目的基因的获得

1 异硫氰酸胍----热苯酚法 1）将实验用的全部用品用0.1%的DEPC水浸 泡过夜，然后高压灭菌，玻璃器皿在180 ℃烘烤8h以上，塑料制品80℃烘干。 2）将0.1g组织样品在研钵中迅速研成粉末， 放入装有1ml GITC试剂的匀浆管中匀浆。 匀浆液取出放在1.5ml离心管中，吸打几次以 剪切染色质DNA，60℃温浴10min。 3）加入等体积60℃苯酚，混匀，抽提。 4）冰中冷却，10000rpm离心10min。取上清， 用热苯酚重复抽提一次。





性的确定；（2） cDNA 的合成和克 隆；（3）目的cDNA的鉴定等步骤。 (1) 总RNA的提取 (2) mRNA的分离 (3) mRNA的纯化 (4) cDNA第一条链的合成:①随机引物法； ②oligo-dT(12-18)引物法 (5) cDNA第二条链的合成 (6) cDNA的甲基化和接头的加入 (7) cDNA同载体的连接 (8) 噬菌体蛋白的体外包装 （9）噬菌斑原位杂交分离基因


EcoR I adapters的连接
在含有cDNA和EcoR I adapters的管中加入 10×Ligase buffer 1.0μl 10mM rATP 1.0μl T4 DNA ligase(4μg/μl) 1.0μl 4℃连接两天，将管放在 70℃水欲中 30 分钟， 以灭活连接酶。


迅速振荡管子以混匀，稍离心后，在16℃温育 2.5小时，然后取出放在冰上。 注意：在操作过程中必须保证温度不超过 16℃， 否则会引起发夹结构的形成，影响 cDNA 的克 隆。
cDNA第一链和cDNA第二链碱变 性琼脂糖凝胶电泳的同位素X光片
cDNA第一链和双链cDNA凝胶电 泳



目前主要应用化学合成法、目的基因的直接 分离法和逆转录法来分离、获得目的基因。 PCR技术的问世及其在基因工程中广泛 （transposon tagging）、mRNA 差异显示 法（mRNA differential disply）、RFLP 及 ESTs等技术也已经在分子克隆工作中展现出 广阔的前景。
Xho I消化 在 反 映 管 中 加 入 28.0μl Xho I buffer,3.0μlXho I,37℃消化2小时。 冷却至室温，加入5.0μl 10×STE buffer。这时的cDNA可以进行片段分离 了。



cDNA不同大小片段的分离
将Sepharose CL-2B和10×STE buffer从4℃冰箱中取 出，平衡至室温。 准备50ml的1×STE buffer。 将柱子固定在一个支架上，轻轻混匀 Sepharose CL2B，用1ml移液器将其加入柱子中。 加入10ml 1×STE buffer 平衡柱子。 当在树脂液面上剩大约50μl STE时，立即加入cDNA样。 一旦样品进入 Sepharose CL-2B ，用移液枪将连接管 加满1×STE buffer。 当染料达到柱子管壁刻度为 -.4ml时开始接收 cDNA， 每3滴接一管。 当染料达到柱子管壁刻度为 .3ml 时停止接收 cDNA
基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、 扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展 核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。 通常将那些已被或者准备要被分离、改造、 扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目 的基因。 要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小 的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第 一个难题。欲想获得某个目的基因，必须对 其有所了解，然后根据目的基因的性质制定 分离的方案。




RNA变性电泳 方法Ⅰ 在一灭菌微量离心管中混合下列液体，以制备 RNA样品。 RNA 9μl 10×TAE 4μl 甲醛 7μl 甲酰胺 20μl 总体积 40μl 混匀后，65℃温育15min，取出置冰上。 加入 RNA 上样缓冲液，用 1% 的琼脂糖凝胶电 泳，电泳buffer为1A library） 是指 将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶切后 （必要时对这些DNA片段进行密度梯度离心 或经制备型凝胶电泳进行分级分离，以选择 长度适合于插入载体的片段）所产生的基因 组片段随机地同相应的载体重组、克隆，所 产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序 列。
基因组DNA有着非常广泛的用途。如用 以分析、分离特定的基因片段；通过染色体 步行（chromasome walking）研究基因的组 织结构；用于基因表达调空研究；用于人类 染色体大分子DNA的提取和大片段 的制备；（2）载体DNA的制备；（3）载体 与外源大片


第二链的合成
在冰上按顺序往第一链反应液中加入以下试剂：



10×Second strand buffer Second strand dNTPs ddH2 6.0μl 108.2μl 2μl
稍混匀，离心后加入RNase H（0.9u/μl） 3.5μl DNA polymerase I(9.0u/μl) 11.1μl

总RNA的提取 凡与RNA操作有关的玻璃器皿经常规洗净后， 用 0.1% 的焦碳酸二乙酯（ DEPC ）浸泡处理 （ 37℃， 2 小时），再用灭菌双蒸水漂洗几次。 高压消毒去除 DEPC，然后250℃烘烤4小时以 上或 180℃ 8 小时以上。塑料器材最好使用灭 菌的一次性使用的塑料用品， Eppendorf 管、 微量加样吸头最好是新的，使用前进行高压灭 菌。所有溶液应加DEPC至终浓度0.05%-0.1%， 室温 处 理过 夜 ，然 后 高压 处 理 。 DEPC 易与 Tris 反 应 ， 配 制 Tris 溶 液 的 水 应 先 用 0.1%DEPC处理，高压消毒，配好后再高压消 毒。






mRNA的分离和纯化 具体操作按Oligotex mRNA Mini Kit说明进行。 500μg总RNA于1.5ml离心管中用DEPC处理过 的水调至500μl。 加OBB 500μl 和Oligotex Suspension 45μl,充 分混匀。 70℃30分钟 取出反应，室温放置10分钟。 12000rpm离心2分钟，沉淀。 用 OW2 400μl 重悬沉淀，然后移到一小离心 柱中，12000rpm,离心１分钟。



2 用TRIZOL试剂盒提取总RNA 1) 匀浆 在 1ml 的 TRIZOL 试剂中加 50-100mg 组织，样 本体积不应超过 TRIZOL 的 10% 。用匀浆机高 速匀浆2分钟。 2)（可选） 要分离蛋白、脂肪、多糖或细胞外物质如肌肉、 脂肪组织，在匀浆后2-8℃ 12000g离心10分钟。 将上清匀转移至一新的Eppendof管。 3) 分相 15-30℃温育5分钟，完全解离核蛋白复合体。 加0.2ml氯仿，用力摇动15秒，15-30℃放置23分钟。小于12000g 2-8℃离心15分钟。




cDNA末端的补平 在反应管中加入Bluting dNTP mix 23μl pfu DNA polymerase (2.5u/μl) 2.0μl 混匀后，72℃温育30 分钟，注意：不能超过30分钟。 取出反应管，加200μl苯酚：氯仿（1：1）抽提。 12000rpm 室温离心 2 分钟，取上清，用等体积氯仿再 抽提1次。 取上清，加入20μl 3M NaAc(PH5.2)，400μl无水乙醇， -20℃过夜沉淀。 12000rpm，4℃，离心60分钟。 70%乙醇洗沉淀，吸出乙醇后，干燥沉淀。 将沉淀溶于9.0μl的EcoR I adapters溶液中。4℃放置 至少30分钟，使cDNA完全溶解。



振荡混匀，然后加入 5μl （ 5μg ） mRNA, 混匀。 室温放置10分钟，以便模板和引物退火。 加入 3.5μlMMLV-RT(20u/μl), 终体积 50μl ，混 匀，稍离心。 取出5ｕL放于含有0.5ｕL α-32P dATP的离心 管做对照反应。 37℃温育1小时同时准备16℃水浴。 将第一链反应液取出，放置在冰上





4) RNA的沉淀 转移水相于一新管。加 0.5ml 异丙醇，混匀， 室温放置 10 分钟。 4-8℃ 12000g 离心 10 分钟 （离心前RNA通常不可见，在管壁或管底形成 胶样沉淀）。 5）RNA沉淀的洗涤 弃上清，每1ml TRIZOL至少加1ml 75%的乙醇 洗涤RNA一次。2-8℃小于7500g离心5分钟。 6）RNA的重溶 倒掉乙醇，空气中干燥或真空干燥5-10分钟。 加适当的DEPC处理水，吸打几次， 放于55-60℃溶解 10分钟。-70℃保存。



第一链的合成 在1.5ml离心管中，按顺序加入以下试剂： 10×first strand buffer 5.0μl First strand Methyl Nucleotide mixture 5.0μl Linker-primer(1.4μg/μl) 2.0μl DEPC water 30.5μl RNase Block Ribonuclease Inhibitor(40u/μl) 1.0μl


6.2 c 基因的分离 cDNA的克隆对于特定基因的分离类型中已经被转 录成m同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特 定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各 自的 mRNA的种类就不同，由此而产生独特的 cDNA。
EcoR I 末端的激活 在反应管中加入 10×Ligase buffer 10mM rATP 灭菌水
T4 polynucleotide kinase10μg/μl)
1.0μl 2.0μl 6.0μl
1.0μl

37℃温育30分钟。 70℃ 温 育 30 分 钟 以 灭 活 T4 polynucleotide kinase1，稍离心。