蛋白质工程复习思考题汪世华2012

第4课时蛋白质工程的崛起[目标导读] 1.举例说出蛋白质工程崛起的缘由。

2.结合教材P27图1－29，简述蛋白质工程的基本原理。

3.概述蛋白质工程的应用。

[重难点击] 蛋白质工程的原理。

1．基因工程的基本操作程序目的基因的获取↓基因表达载体的构建↓将目的基因导入受体细胞↓目的基因的检测与鉴定2．基因工程的实质将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本来不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。

3．中心法则告诉我们遗传信息的流动方向如下：蛋白质具有复杂的空间结构，不同种类的蛋白质具有不同的结构和功能。

蛋白质结构的多样性是由构成蛋白质的氨基酸种类、数目、排列顺序和空间结构来决定的，而其结构多样性的根本原因则是由于控制蛋白质合成的基因的多样性。

[课堂导入]基因工程只能生产自然界中已经存在的蛋白质，不一定完全符合人们生活需要。

于是，人们开始设计蛋白质工程。

探究点一蛋白质工程崛起的缘由和基本原理1．基因工程的不足在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。

天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。

2．对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？答案应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造，主要原因如下：(1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。

如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，但被改造过的蛋白质分子也是无法遗传的。

(2)对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。

3．蛋白质工程的基本原理(1)概念①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。

②手段：通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。

③目的：获得满足人类的生产和生活需求的蛋白质。

(2)原理：由预期的蛋白质找到相对应的基因。

即中心法则的逆推。

(3)流程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列(基因)→合成DNA→表达出蛋白质。

一、蛋白质化学部分复习思考题一、判断题1、（A ）具有四级结构的蛋白质都是寡聚蛋白质。

2、（x ）溶液的pH值等于7吋，蛋口质不带电荷。

3、（ a ）蛋口质的三级结构主要是由它的氨基酸顺序决定的。

4、（ X ）各种氨基酸的等电点（pl）是它们所有可解离基团的算术平均值。

5、（X ）蛋白质的变性是蛋白质立体结构的破坏，因此常涉及到肽键的断裂。

6、（x ）蛋白质的四级结构指的是如何由多条肽链通过共价键连接成一个完整分子。

7、（X ）凡有相同氨基酸组成的蛋片质即有相同的空间结构。

8、（ A ）由于所有的a-氨基酸都能与即三酮反应，因此即三酮常用來作为氨基酸的显色剂。

二、单项选择题1、（b）组成蛋白质的元素主要有A.C、H、O、N、PB. C、H、O、N、S C・ C、H、0、P、S D.以上都不对2、（A ）下列氨基酸屮有乙醛酸反应的是______ oA. Trp B・ Arg C. Lys D・ His3、（C ）对蛋白质三级结构的形成影响最人。

A.氢键B.二硫键C.疏水键D.盐键4、（C ）苛三酮b辅氨酸反应时，在滤纸层析谱上呈现色。

A.蓝紫B.红C.黄D.绿5、（B ）下列氨基酸中有坂口反应的是oA. TrpB. ArgC. LysD. His6、（B ）蛋白质所形成的胶体颗粒，在下列哪种条件不下稳定_______ oA.溶液pH大于PIB.溶液pH等于PIC.溶液pH小于PID.溶液pH等于7.4（）7、（D ）蛋口质变性是由于_______ oA. 一级结构的改变B.辅基的脱落C.蛋口质分解D.空间结构的改变8、（B ）维持蛋白质分子a ■螺旋结构的化学键是______ oA.肽键B.肽链原了间的氢键C.侧链间的氢键盘D.二硫键和盐键A9、血清蛋白（PI=4.7）在下列哪种pH溶液中带正电荷？A. pH4.0B. pH5.0C. pH 6.0D. pH 8.0alO、盐析法沉淀蛋口质的原理是______ oA.中和电荷B.与蛋白质结合成不溶性蛋白盐C.降低蛋白质溶液的介电常数D.使蛋白质溶液成为P1C11、变性蛋白质的主耍特征是________ oA.不易被蛋口酶水解B.溶解度增加C.丧失原有生物活性D.颜色反应减弱B12、变性蛋口质最主要特征是原有牛•物活性的丧失，这是由于____ oA.蛋白质一级结构改变B.蛋白质空间结构改变C.蛋白质亚基的解聚D.蛋白质水解为氨基酸D13、将蛋白质溶液的PH值调到等电点时_____ oA.能使蛋口质的稳定性增加B.能使蛋口质表而的静电荷不变C.能使蛋口质表面的静电荷增加D.能时蛋口质稳定性降低，易于沉淀析出B14、可用于蛋白质多肽链N■末端分析的方法是____ oA.即三酣法B.二硝基氟苯法C.双缩尿法D.紫外吸收法D15、关于蛋白质三级结构的叙述，正确的是________ oA.稳定蛋口质三级结构最主要的键是氮键B.貝有三级结构的多肽链都有牛:物学活性C.具有三级结构的多肽链都无生物学活性D.指整条多肽链屮全部原子的空间排布E.每条具有三级结构的多肽链在多聚体蛋白质小称为亚基，所有亚基内均含有结构域A16、有关变性的错误描述为____________________ 。

名解蛋白质工程：蛋白质工程是以蛋白质的结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。

蛋白质超二级结构：相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成规则排列的组合体，以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合体称为超二级结构，或结构模体。

结构域：指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。

结构域是蛋白质折叠中的一个结构层次，介于超二级结构和三级结构之间，是蛋白质三级结构的基本单位，也是蛋白质功能的基本单位。

分子伴侣：是一类相互之间有关系的蛋白分子，能识别正在合成的多肽或部分折叠的多肽并与多肽的一定部位相结合，帮助这些多肽转运、折叠或组装，但其本身并不参与最终产物的形成。

定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤-突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。

这种策略只针对特定蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。

第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着对应关系，人们称之为第二遗传密码或折叠密码。

蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质一级结构发生改变的过程统称为蛋白质的化学修饰。

基因突变的概念：基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化。

蛋白质组学：蛋白质组学定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为(如疾病过程和药物效应)，以及基因表达调控的机制的学科。

双向电泳：是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

蛋白质芯片：也叫蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。

2011-2012学年第一学期《蛋白质工程和酶工程》复习题1.易错PCR和DNA搅乱重组原理。

易错PCR 是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

DNA搅乱重组是指在PCR过程中利用某些因不具有3′-5′校读功能的DNA 聚合酶（如Taq 酶）导致产生很低概率的随机碱基错配的缺陷建立的一项蛋白质分子体外快速进化新技术，称为DNA Shufflin又译为DNA搅乱重排和DNA“洗牌”。

首先利用DNA 聚合酶的错配进行错误导向PCR 产生随机突变子库,然后打断、搅乱和重组以获得带有多点突变的全长基因(这一步可以反复进行多次) ,下一步是扩增和克隆带有多点突变的基因,最后是筛选期望的重组子。

2.X射线和圆二色谱测定蛋白质三维结构的原理。

（题目改过，删除原来第三题）X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象，而X射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。

当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。

衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。

圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸光率的不同来分析蛋白质的结构。

生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子，通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在溶液状态下的二级结构。

圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。

3.表达载体的基本构成元件有哪些？启动子、终止子、核糖体结合位点、翻译起始密码子、终止密码子。

4.测定蛋白质空间结构的主要方法有哪些？X-射线晶体衍射法、核磁共振波谱法（NMR）、电镜三维重构法、各种光谱技术（如圆二色谱法）、显微技术和计算机模拟。

一. 名词解释1．生物酶工程又称高级酶工程它是酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。

2．蛋白质工程蛋白质工程就是运用蛋白质结构功能和分子遗传学知识，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质。

3.多核糖体把细胞放在极其温和的条件下处理，就能得到几个到几十个核糖体在一条mRNA上结合起来的形态4.固定化酶水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。

在催化反应中以固相状态作用于底物5.酶反应器以酶或固定化酶为催化剂进行酶促反应的装置。

6．酶工程又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术7.生物传感器对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。

8. motif (模体)指的是蛋白质分子结构中介于二级结构与三级结构之间的一个结构层次，又称超二级结构9. domain功能域生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域,特别指蛋白质中这样的区域10.PDB蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）是一个生物大分子，11. DNA shuffling体外同源重组技术。

通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。

12.生物催化剂是指生物反指应过程中起催化作用的游离或固定化细胞各游离或固定化酶的总称13.必需基团有的基团既在结合中起作用，又在催化中起作用，所以常将活性部位的功能基团统称为必需基团(essential group)14.活性中心。

酶的活性中心是酶与底物结合并发挥其催化作用的部位。

15.有性PCR dna改组16.DNA改组通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。

17.免疫传感器偶联抗原/抗体分子的生物敏感膜与信号转换器组成的，基于抗原抗体特异性免疫反应的一种生物传感器。

18.易错PCR是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。

蛋白质组学与分析技术复习思考题名词解释1. 蛋白质组学：是研究与基因对应的蛋白质组的学科。

指一种基因组所表达的全套蛋白质，即包括一个基因组、一种细胞或组织，乃至一种生物所表达的全部蛋白质。

对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质；其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。

2.双向电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离（等点聚焦（IEF），在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离（SDS凝胶电泳（SDS-PAGE））二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。

3.三步纯化策略：①粗提：分离、浓缩和稳定样品；把蛋白质从原来的组织和细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然活性。

②中度纯化：取出大部分杂质；一般使用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离和超滤等。

③精细纯化：进一步纯化、达到最高纯度。

一般使用凝胶过滤、离子交换层析等层析技术。

4. 高效液相色谱：是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

在蛋白组学的研究中可以从复杂混合物中分离某种蛋白质组分5. 吸附色谱：又叫液固色谱，流动相是液体，吸附剂是固相；当混合物随着流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离。

这是一种早期的色谱分离技术，主要适用于分子量不大的物质的分离。

6. PCR扩增：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。

蛋白质的分子设计：亲和标记：透析：蛋白质工程：双向电泳亲和层析抗体库技术:蛋白质组学：抗体酶：第二遗传密码：蛋白质芯片：等电聚焦：单克隆抗体：蛋白质打靶技术噬菌体表面展示技术:蛋白质超二级结构结构域基因突变蛋白质的化学修饰激光捕获显微切割技术1.（）的优点是操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，可反复使用。

A 吸附法B偶联法（共价结合法）C交联法D包埋法2.不属于强烈倾向于形成α螺旋的氨基酸（）A AlaB GluC ProD Met“分子病”是由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起的疾病。

下列不属于分子病的是（）A 地中海镰刀状红血球贫血症B 血友病C 苯丙酮尿症D 老年性痴呆症3.可以方便地在溶液中研究分子结构并且可以使试样不经受任何破坏的蛋白质结构分析方法是（）A 核磁共振B X-射线晶体衍射法C 现代光谱技术D 三维电镜重构法蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法不包括下列哪一种（）A SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法B等电聚焦电泳法C超速离心沉降分析法D亲和层析法4.蛋白质微阵列( Protein micro-array) ，将大量蛋白质有规则的固定在某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间相互作用检测分析蛋白质的技术称为（）A 蛋白质芯片技术B 蛋白质分子印迹技术C表面等离子体共振技术D酶联免疫吸附剂测定5.下列哪项不是初步鉴定蛋白质晶体的方法( )A.刮擦法B.脱水法C.偏振光法D.浓度差法6.蛋白质分子引起280nm光吸收的最主要成分是（）A.肽键B.半胱氨酸的-SH基C.苯丙氨酸的苯环D.色氨酸的吲哚环7. TNBS（2，4，6-三硝基苯磺酸）是（）的化学修饰常用试剂。

A 巯基B氨基C羧基D二硫键8. 蛋白质工程的基本流程正确的是( )①蛋白质分子结构设计②DNA合成③预期蛋白质功能④据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列A．①②③④B．④②①③C．③①④②D．③④①②9. 下列不属于蛋白质结构测定的技术是（）A X射线晶体衍射技术B 核磁共振波谱技术C 生物信息学预测蛋白质结构D 缺失突变技术10. 通过增加内氢键数目可以改善蛋白质设计的哪项目标（）A 热稳定性B对氧化的稳定性C对重金属的稳定性 D pH稳定性11. 蛋白质分子设计的关键是（）A 建立所研究蛋白质的结构模型B 找出对所要求的性质有重要影响的位置C 预测突变体的结构D 定性或定量计算优化所得到的突变体结构是否具有所要求的性质12. 下列不属于蛋白质结晶技术的是（）A 悬滴法B 坐滴法C 微量扩散小室法D 插入突变法13. 增加蛋白质分子的热稳定性的常用方法是（）A 提高脯氨酸的含量B 在蛋白质分子中引入二硫键C 增加蛋白质分子的α螺旋D 增加β折叠14 蛋白质工程的基本原理是（）A 中心法则B 热力学第二定律C 中心法则的逆推D 模型对比下列氨基酸中，人体不能自身合成的有：（ ) A、丙氨酸 B、组氨酸 C、赖氨酸 D、酪氨酸15. 关于 alpha-螺旋错误的是：（）A、螺旋中每 3.6 个氨基酸残基为一周B、为右手螺旋C、一个氢键闭合的环包含12个原子D、氨基酸侧链 R 基团分布在螺旋外侧1. 从DNA到蛋白质，按照中心法则，体外表达要分为( ) ，和( )两个步骤。

蛋白质工程与酶工程复习思考题（08基地班整理，答案仅供参考）第一部分蛋白质工程1.怎样理解蛋白质工程？以蛋白质的结构和功能为基础，通过基因修饰或基因合成而改造现存蛋白质或组建新型蛋白质的现代生物技术。

蛋白质工程正在形成以改造现有蛋白质和制造新型蛋白质为中心的第二代遗传工程。

2.肽键是什么？氨基酸之间脱水后形成的键为肽键，也为酰胺键3.一级结构与空间构象、功能之间的关系？蛋白质的一级结构(primary structure)指它的蛋白质分子中各个氨基酸残基的排列顺序。

蛋白质的一级结构决定了空间构象，空间构象决定了蛋白质的生物学功能，参与功能部位的残基或处于特定构象关键部位的残基对蛋白质的生物学功能往往起定性作用；一级结构相似的蛋白质，其折叠后的空间构象以及功能往往相似，一级结构的变化引起功能的变化。

4.天然蛋白质中主要的二级结构的类型有哪些？蛋白质的二级结构：指蛋白质多肽链本身的折叠与盘绕方式,。

类型包括：α—螺旋、β—折叠、β—转角、自由回转等。

5.常见氨基酸的结构通式，20种常见氨基酸中有无不符合此通式的氨基酸？除脯氨酸外，脯氨酸(Pro)的侧链R-基与主链N原子共价结合，形成一个环状的亚氨基酸，其他均具有如下结构通式。

R|H2N－C－C00H|H6.什么是变性、复性？变性：天然蛋白质因受到物理和化学的因素影响，使蛋白质严格的空间结构受到破坏，（但不包括肽键的裂解），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，这种现象称为蛋白质变性作用。

复性：变性的蛋白质恢复其天然活性的现象称为复性7.常见的氢键发生在哪些基团间？氢键: 由同一条肽链内每个氨基酸残基的两个肽键衍生而来，即每个氨基酸残基的N－H 与前面每隔3个氨基酸残基的C=O形成的。

8.常见氨基酸的旋光性如何？除甘氨酸外，都具有旋光性。

从蛋白质水解得到的α--氨基酸均为L--型氨基酸9.分子伴侣定义及其功能？分子伴侣：是进化上十分保守的蛋白质家族，广泛存在于多种生物体内，其主要作用是与新生肽或部分折叠的蛋白质的疏水表面结合，加速其折叠或组装成天然构象的进程，并防止其相互聚集和错误折叠。

蛋白质工程复习题名词解释构造域：生物大分子中具有特异构造和独立功能的区域，特别指蛋白质中这样的区域基因突变：基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象融合蛋白：将两个或多个开放阅读框按肯定序列挨次连接，融合阅读框表达出一杂合蛋白。

蛋白的表达模式:蛋白质的分子设计：构型：是一个分子中原子的特定空间排布。

构型转变必需有共价键的断裂和重形成。

最根本的分子构型为L-型和D-型，这种异构体在化学上可以分别。

构象：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。

构象转变,无共价键的断裂和重形成，化学上难于区分和分别α-氨基酸：原核表达：是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达蛋白质的二级构造：在一段连续的肽单位中具有同一相对取向，可以用一样的构象角来表征，构成一种特征的多肽链线性组合。

构造域：二级构造和构造模体以特定的方式组合连接，在蛋白质分子中形成2 个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为构造域。

蛋白质的三级构造：构造域在三维空间中以专一的方式组合排布,或者二级构造、构造模体及其与之相关联的各种环肽链在空间中的进一步协同盘曲、折叠，形成包括主链、侧链在内的专一排布。

蛋白质分子的四级构造：指蛋白质分子的亚基构造〔subunit〕，亚基的数目、类型、空间排布方式和亚基间相互作用的性质，构成四级构造的根本内容。

亚基：很多蛋白质作为完整的活性分子，是由两条以上的多肽链组成，它们各自以独特的一级、二级、三级构造相互以非共价作用联结，共同构成完整的蛋白质分子，这些肽链单位称为亚基。

其聚合整体称为寡聚体蛋白质的分子设计：从蛋白质分子水平上通过数据库等大量试验数据，结合现代的理论方法通过计算机设计的分子。

分子伴侣：一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的构造完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分别，不构成这些蛋白质构造执行功能时的组份启动子：由核苷酸组成，本身并不掌握基因活动而是通过与转录因子的这种蛋白质结合而掌握基因活动的增加子：能强化转录起始的一段DNA序列为增加子或强化子乳糖操纵子：是参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。

第三章蛋白质工程习题1、名词解释：蛋白质工程：是基于对蛋白质结构和功能关系的认识，进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白质的理论及实践,是基因工程基础上的延伸,是第二代基因工程。

蛋白质分子设计：是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，即在知道了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后，通过理论的方法，提出蛋白质改造的设计方案.嵌合抗体:用DNA重组技术将鼠源单抗的可变区(V区)基因与人免疫球蛋白（Ig)的恒定区(C区 )基因相连接,构建成嵌合基因,导入宿主细胞进行表达，制成嵌合抗体。

目前国内外已制备了数十种嵌合抗体。

PDB:蛋白质结构数据库。

2、请列表总结基因工程和蛋白质工程的相同点、不同之处（从结果、实质、流程等方面）及其联系。

3、蛋白质工程的基本目标、基本途径是什么？答：基本目标：对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。

基本途径：基因修饰或基因合成：借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术4、目前有哪些蛋白质工程分子改造的常用方法？答：⒈基因定点突变技术（小改）：即通过在DNA水平上进行碱基的取代、插入或缺失,达到改变基因，从而改变编码的蛋白质的结构的技术，包括核苷酸引物诱变，盒式诱变，PCR诱变，随机诱变。

⒉基因剪切和融合（中改)：原理：将编码某蛋白的部分基因移植到另种蛋白基因上，经克隆、表达，产生新的融合蛋白。

可达到使蛋白易于表达、纯化、细胞定位等，或使蛋白性质改变。

⒊基因全合成(大改)：合成DNA，然后表达出相应蛋白。

可以全部由人工控制，便于设计和改造,还适用于同时实现多处突变。

5、蛋白质工程中增加蛋白质稳定性的基本途径有哪些？答：蛋白质结构与功能研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的,人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。

试析《蛋白质工程》教学体会蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。

为了使学生将所学习过的生物化学、分子生物学、酶工程、生物信息学等专业课程的理论知识融会贯通，培养从事蛋白质方面研究及生产的专业技术人才，河南科技大学为生物工程专业本科四年级学生开设了《蛋白质工程》这门专业课程。

使用的教材是汪世华教授主编的《蛋白质工程》，该教材知识覆盖面较广、内容难度适中，比较适合于本科生教学使用[1]。

在如何激发学生的学习兴趣、提升课堂教学质量；如何既能够理论联系实际又能够把握学科的前沿发展动向、培养出适应社会需求和学科发展要求的专业人才方面，笔者根据自身的教学体会以及学生的课堂反馈从以下四个方面进行了一些有益的尝试。

1合理安排教学内容教学内容的合理安排是提高教学质量的关键。

作为一门综合性学科，蛋白质工程所涉及到的内容较多、覆盖面广，因而在有限的学时内很难做到面面俱到，一些同学在课下也反映希望教师能够结合毕业班的实际情况有针对性的讲解一些和毕业后从事相关领域的工作有一定联系的内容。

针对这种情况，笔者对教学内容和教学方式进行了一些调整，即首先把该堂课程的教学内容以大纲的形式进行讲解，争取在5～10min内给学生一个整体印象；然后针对某一个知识点进行重点讲解（包括背景、原理、方法、实例以及研究进展等），每节课只讲授一个或两个知识点，争取做到以点带面，盘活课堂。

对于重点讲解的知识点，需要结合一些辅助教材和专业文献事先对教材内容进行梳理和重新整合，注意兼顾相关学科的研究动态和发展方向；同时笔者还结合一些自己的科研工作进行实例教学，如将在博士期间所参与完成的硫氧化还原酶（SOR）基因的克隆、定点突变、异源表达、纯化以及晶体结构模拟、解析等科研工作进行实例讲解。

这些内容不仅涵盖了蛋白质的分子设计、蛋白质的修饰和表达、蛋白质的分离纯化与鉴定和蛋白质的结构解析等章节的内容，而且通过这些讲授要使学生了解为什么要采用这样的方法步骤以及今后遇到类似的问题如何去解决，从而使得课程的内容密切联系实际，既增加了课程的生动性和实用性，也提升了学生的学习热情。

1.X射线和圆二色谱测定蛋白质结构的原理。

2.表达载体的基本构成元件有哪些？3.测定蛋白质空间结构的主要方法有哪些？4.测定蛋白质三维结构的原理是什么？5.常见的氢键发生在哪些基团间？6.常用的蛋白质表达系统及优缺点。

7.带苯环的芳香族氨基酸有哪些？8.蛋白质的变性与复性。

9.蛋白质的常用染色方法有哪些，各自优缺点？10.蛋白质分子设计的分类？11.蛋白质分子设计的一般程序。

12.蛋白质免疫印迹。

13.蛋白质提取的粗分级和细分级方法各有哪些。

14.蛋白质芯片的概念。

15.蛋白质组学研究的现代技术主要有哪些。

16.蛋白质组与蛋白质组学的概念。

17.第二遗传密码。

18.多肽链。

19.二硫键的主要作用。

20.分子伴侣定义及其功能？21.何谓蛋白工程。

22.何谓蛋白质的结构域。

23.何谓定点突变与定向进化，各有哪些常用方法。

24.何谓内含肽，有何应用价值。

25.核磁共振的原理、特点有哪些。

26.肌红蛋白的结构与功能。

27.简述进行相似序列的数据库比对搜索的意义。

28.酵母双杂交系统的原理。

29.进行蛋白质分子的修饰经常选用哪些氨基酸侧链基团。

30.进行蛋白质分子设计时，需要选择哪种类型的氨基酸用作核心？31.抗体工程和抗体的定义。

32.抗体酶的设计和制备方法主要有哪些？33.离子交换层析分离纯化蛋白质的原理？34.启动子主要作用是什么。

35.亲和标记定义。

36.亲和层析的原理是什么？37.溶液pH值与蛋白质等电点的关系？38.设计的蛋白质二级结构如果是连续β折叠时，要注意什么？39.什么是报告分子，常见的报告分子有哪些？40.什么是蛋白质的折叠。

41.什么是三维电镜重构技术？42.双向电泳蛋白质样品制备过程中离液剂的作用？双向电泳的第一向、第二向各是什么，分别根据什么原理？43.肽键的结构组成。

44.天然蛋白质中主要的二级结构的类型有哪些？维持蛋白质二级结构的主要作用力是什么？45.现在通常根据抗体的制备方法和技术，将抗体分为哪三大类？46.盐析与透析的定义。

蛋白质组学思考题答案1.蛋白质组学概念？蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，从蛋白质整体水平上来认识生命活动规律的科学。

2.蛋白质分离纯化的基本原则？（1）获得尽可能多的样品蛋白（2）不同的制备方法配合使用（3）制备的方法与后续研究相结合3.细胞破碎的方法有哪些？（1）温和裂解方法：冻融，渗透，去污剂，酶消化法，匀浆法（2）强烈裂解方法：超声波，玻璃珠，研磨法4.蛋白质裂解液使用还原剂、去污剂及变性剂的作用分别是什么，熟悉经常用到的试剂？（1）去污剂：有助于溶解膜蛋白质，并有助于膜蛋白质与脂类的分离。

常用的有离子型去污剂（SDS），非离子型去污剂（TritonX-100），两性离子去污剂(CHAPS)。

（2）变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。

常用的有尿素和硫脲。

（3）还原剂：用于还原二硫键或防止蛋白质氧化，增加蛋白质的溶解性。

常用的有具游离巯基的β－巯基乙醇（β－ME），二硫苏糖醇（DTT）和不带电荷的三丁基膦（TBP）。

5.蛋白质裂解液中加入两性电解质的作用是什么？（1）起载体作用（2）捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性6.影响样品制备的干扰物质有哪些？（1）盐（NaCl）（2）离子去污剂（SDS）（3）核酸、脂类及多聚糖（4）酚类复合物（5）不溶物质7.实验时去除植物材料中酚类物质的方法是什么？（1）还原状态：通过氢键与蛋白结合；处理方法：添加PVPP，形成多酚物（2）氧化状态（醌）：发生共价结合；处理方法：添加还原剂 (DTT, 抗坏血酸, 亚硫酸盐)8.凝胶的分子筛效应？凝胶分离不同分子量大小的分子的特性称为分子筛效应。

9.双向电泳第一向进行胶条水化时的两种方式是什么？各有什么特点？（1）主动水化：低电压可以让高分子量的蛋白更好地进入胶条（2）被动水化：蛋白自然地进入胶条；用于高盐浓度的蛋白样品；水化后, 在电极处使用滤纸片除盐，如果在水化前使用滤纸片会导致蛋白被吸附在滤纸片上10.双向凝胶电泳的基本原理？2D-SDS-PAGE是两种分离方法的结合（1）根据等电点用IEF分离蛋白质（2）在聚丙烯酰胺凝胶上电泳进一步分离聚焦的蛋白质根据等电点的不同，第二向电泳根据分子质量的不同分离蛋白质11.双向凝胶电泳的基本流程？(1)等电聚焦：标记胶条→样品上样及水化→置于聚焦盘内→设定IEF电泳程序→加矿物油覆盖胶面(2)胶条平衡：先在含有SDS、还原剂DTT但不含碘乙酰胺的平衡液中平衡，再在含碘乙酰胺的平衡液中平衡(3)SDS-PAGE：制胶→样品制备→加缓冲液→连接电源→电泳(4)染色：染色液及脱色液的配制→染色→脱色12.双向电泳中第一向到第二向进行平衡过程的机理？平衡buffer 1：还原(将S–S键转化为SH)，DTT平衡buffer 2：烷基化物 (使每个SH均烷基化以防止S–S键的重新形成),碘乙酰胺13.蛋白凝胶染色的方法有哪些？各有哪些优缺点？（1）考马斯亮蓝法优点：选择性地对蛋白质进行染色，大大地降低了化学噪音，提高了灵敏度（2）胶体考染法优点：考马斯亮蓝定量地与蛋白质结合，可以准确定量蛋白质；缺点：蛋白质谷氨酸羧基侧链不可逆的酯基化（酸催化下），使得肽谱数据失真（3）银染法优点：大大提高了灵敏度；扩展了动态线性范围兼容质谱（去除戊二醛后）；快速，方便缺点：银离子可与半胱氨酸残基结合；银染试剂戊二醛和甲醛都会对蛋白质的α-和ε-氨基烷基化，妨碍后续分析（4）SYPRO染料优点：快速，灵敏，终点式染色易操作；动态线性范围广，染色覆盖范围广；不干扰后续分析。

2012高三生物总复习教案第47讲蛋白质工程教学案【考纲要求】【考点分析】【考点预测】从近几年的高考试题看，考点主要集中在考查基因工程的基本工具、操作程序、DNA分子的提取与鉴定上。

基因工程的工具和步骤仍是本专题的重点内答，今年高考命题可能会从以下几个方面展开：1．基因工程的基本工具。

2．基本操作程序的四个步骤。

3．基因工程的应用等知识点。

本专题内容侧重考查学生现代科学技术方面的知识应用能力，主要要是以填空题的形式呈现。

【知识梳理】一、蛋白质工程的崛起二、D AN的粗提取和鉴定【重点解析】考点一 蛋白质工程 1．基本原理(1)目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。

(2)基本途径：蛋白质工程的基本途径：预期的蛋白质功能一设计预期的蛋白质结构一推测应有的氨基酸序列一找出相对应的脱氧核苷酸序列。

天然蛋白质合成的过程(按照中心法则进行)：基因一表达(转录和翻译)一形成氨基酸序列的多肽链一形成具有高级结构的蛋白质一行使生物功能。

2.蛋白质工程与基因工程的区别例1.胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，要经过较长的时间才能进人血液，而进入血液的胰岛素又容易分解，因此，治疗效果受到影响。

如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题：(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是。

(2)通过DNA合成形成的新基因应与结合后转移到中才能得到准确表达。

(3)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需用到的生物工程有、和发酵工程。

(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么?解析：(1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计，因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是预期胰岛素即速效胰岛素的功能。

(2)合成的目的基因应与载体构建成基因表达载体后导入受体细胞中才能得以表达。

(3)利用蛋白质工程生产自然界原本不存在的新的胰岛素，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，再人工合成新的胰岛素基因，形成目的基因。