鸡贫血病毒全长感染性分子克隆的构建
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鸡传染性贫血病毒广西株全基因组的克隆与序列分析邓显文;谢芝勋;谢丽基;刘加波;谢志勤;庞耀珊【摘要】为了解鸡传染性贫血病毒(CIAV)广西分离株全基因变异情况,设计3对特异性引物,对CIAV广西分离株(GXC060821)的全基因进行PCR扩增、克隆和序列分析.结果显示,广西分离株的全基因为2 292个核苷酸,含有3个互相重叠的开放阅读框(ORF).序列分析表明,本CIAV分离株与国内外其他31个CIAV毒株比较核苷酸的同源性在96.1%~98.5%之间,推导氨基酸的同源性在89.8%~94.2%之间.全基因系统发育进化树分析显示,广西分离株和中国的TJBD40株、LF4株都处于一个分支,它们的亲缘关系较近,而与美国的98D06073分离株及中国的HA4分离株的亲缘关系较远.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2011(032)004【总页数】4页(P19-22)【关键词】鸡传染性贫血病毒;全基因组;克隆;序列分析【作者】邓显文;谢芝勋;谢丽基;刘加波;谢志勤;庞耀珊【作者单位】广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2;S858.31鸡传染性贫血(Chicken infectious anemia,CIA)是由鸡传染性贫血病毒(CIAV)引起的,可引起3周龄以内的鸡严重贫血、出血,骨髓和淋巴器官严重萎缩[1]。
随着鸡年龄增长对CIAV的抵抗力增强,成年鸡感染后不出现任何临床症状,但种鸡可将CIAV垂直传播给其子代,引起子代发生传染性贫血;临床上CIAV感染鸡群常伴发或继发其他疾病,甚至引起疫苗免疫失败等。
近几年的流行病学调查表明,CAIV在我国鸡群中的感染非常普遍,感染率高达40%~96%[2-3],导致了巨大经济损失。
鸡传染性贫血病毒VP1基因的克隆表达及抗原性分析杨勇;任玉红;梁宝怀;朱雅宁;梁智选【期刊名称】《中国兽医科学》【年(卷),期】2007(37)2【摘要】参考已发表的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP1基因序列,设计并合成了2对引物,经PCR扩增获得了2个基因片段。
将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体中,成功构建了克隆载体pGEM-CIAVVP1A和pGEM-CIAVVP1B。
将上述重组质粒和原核表达载体pMXB10分别用NdeⅠ+EcoRⅠ、NdeⅠ+XhoⅠ双酶切,并将纯化的2个基因亚克隆至pMXB10中,构建出原核表达载体pMXB10-VP1A和pMXB10-VP1B。
在0.3 mmol/L IPTG诱导下,目的基因在大肠杆菌ER2566中以分泌型得到了大量表达。
Western-blot分析发现,表达蛋白具有CIAV抗原性。
表达蛋白经纯化后作为包被抗原,用间接ELISA鉴定,与CIAV阳性血清均能发生特异性反应。
2组蛋白免疫SPF鸡后,用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性,表明2组蛋白均可诱发机体产生抗CIAV的抗体。
【总页数】5页(P140-144)【关键词】鸡传染性贫血病毒;VP1基因;原核表达;酶联免疫吸附试验【作者】杨勇;任玉红;梁宝怀;朱雅宁;梁智选【作者单位】山西农业大学动物科技学院;山西省大同市南郊区畜牧局;天津市禽病诊断培训中心【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2;Q786【相关文献】1.鸡传染性贫血病毒VP1基因的原核表达 [J], 冯昕;荣俊;匡红艳2.鸡传染性贫血病毒VP1和VP2基因共表达载体的构建 [J], 陈降华;周庆丰;刘忠华;李文平3.鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株VP1基因克隆、原核表达及抗原性分析 [J], 向毅勇;罗薇;靳艳玲;刘内生;刘群;龙虎4.鸡传染性贫血病毒vp1基因的克隆表达及抗原性分析 [J], 杨勇;任玉红;梁宝怀;朱雅宁;梁志选5.鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达 [J], 鄢明华;赵晓岩;刘长军;王笑梅;王端;李刚;秦运安;邓国华因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立王景儒;杨晓静【摘要】According to the sequence of chicken infectious anemia virus (CIAV) strain published in GenBank,two pairs of primers were designed and synthesized. The outer primers amplified a fragment of 485 bp in length, and the inner primers amplification fragment size was 297 bp in length. A nested PCR assay for rapid detection of ALV was established. A specific 297 bp fragment was amplified from DNA templates of CAV strain,but no bands were amplified with templates extracted respectively from avian influenza virus (AIV) subtype H9,Newcastle disease virus (NDV), infectious bursal disease virus (IBDV),egg drop syndrome virus (EDSV), reticuloendotheliosis (REV), avian reovirus (ARV) and Marek's disease virus (MDV). Sensitivity of the 1st and 2nd amplifications by the nested PCR assay were 100 pg and 1 fg,respectively. The sensitiv-ite of the 2nd amplifications increased by 105 times. The results showed that the nested PCR was specific,sensitive,rapid,and accurate,and could be used as a routine assay for the detection of CAV. This method had good reproducibility, specificity and sensitivity, and might detect low content CAV accurately and rapidly. This method could be used as a method for the diagnosis and detection of clinical cases,and molecular epidemiological investigation of CAV.%本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测.结果显示,该方法能扩增到297 bp 的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性.该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10 5倍.本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)004【总页数】4页(P55-58)【关键词】禽传染性贫血病病毒;套式PCR;检测【作者】王景儒;杨晓静【作者单位】辽宁朝阳工程技术学校,辽宁朝阳 122000;辽宁朝阳工程技术学校,辽宁朝阳 122000【正文语种】中文【中图分类】S858.31鸡传染性贫血(chicken infectious ane mia,CIA)是由鸡传染性贫血病毒(chicken inf ectious ane mia virus,CIAV或CAV)引起,以雏鸡再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血及高死亡率的一种免疫抑制性疫病(Schat,2009)。
鸡贫血病毒哈尔滨分离株全基因克隆和序列分析何成强;丁乃峥;李景鹏;李云龙【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2002(042)004【摘要】通过PCR方法克隆了从哈尔滨分离的一株鸡贫血病毒(CAV)的全基因,并对其进行了测序,该病毒基因组为环状,全长2298bp,含有三个互相重叠的开放读码框和一个调控区.将克隆的基因与GenBank收录的CAV基因比较,同源性至少为97%,未发现与本次克隆的CAV基因完全一致的分离株.与德国分离株Cux-la、26p4和马来西亚分离株分别有42、42和72个核苷酸不同,同源性分别为98.2%、98.2%和96.9%.与德国分离株Cux 1b相比,除在调控区内少一个类似增强子的重复序列外,尚有39处核苷酸不同.它与分离于欧洲的几株CAV的亲源性要比来自亚洲的马来西亚株近.对CAV哈尔滨分离株、26p4、Cux-1b、Cux-1a和马来西亚株的VP1、VP2和VP3蛋白比较,VP2的保守性最高.【总页数】6页(P436-441)【作者】何成强;丁乃峥;李景鹏;李云龙【作者单位】山东师范大学生物系,济南,250014;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;山东师范大学生物系,济南,250014【正文语种】中文【中图分类】Q785;S852.65【相关文献】1.浙江省9株猪链球菌2型分离株Cps2J全基因克隆与序列分析 [J], 姚苹苹;王复甦n;朱函坪;梅玲玲;叶菊连;罗进;张政;姚晨辉2.PRRSV 广西分离株 GXYL-1403全基因克隆与序列分析 [J], 林思远;洪绍锋;黄加滨;韦莹;陈樱;黄伟坚;韦祖樟3.鸡贫血病毒哈尔滨分离株VP2基因克隆测序和比较 [J], 何成强;丁乃峥;李景鹏;李云龙4.鸡贫血病毒山东分离株全基因克隆 [J], 陈奖励;辛九庆5.广西三黄鸡鸡贫血病毒分离株GXC060821的全基因组序列分析 [J], Xie Z;谢冰因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
鸡贫血病毒VP2基因的克隆、序列分析及表达杨雨辉;陈奖励【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2000(016)004【摘要】目的:为探讨鸡贫血病毒的分子生物学特征.方法:采用PCR方法获得鸡贫血病毒的VP2基因,采用平端连接将其克隆到PUC119载体上进行测序,采用粘端连接将其亚克隆到PET载体上并进行原核表达.结果:发现CAV-SJ1株的VP2基因共有651个碱基,同国外TK5803、26P4、Cux-1、82-2毒株的VP2基因相比分别有6、7、8、7个碱基的差别,其中3个是SJ1株特有的碱基变化.由基因序列推导出的CAV-SJ1株VP2蛋白的氨基酸序列同这些毒株相比都有4个氨基酸的差别,同国外这些毒株共有7个氨基酸的差别.原核表达的融合蛋白分子量为34Kd,占菌体蛋白含量的10.5%.结论:CAV的分子生物学的特性较稳定,变化不大.【总页数】3页(P224-226)【作者】杨雨辉;陈奖励【作者单位】中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001;中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.猪细小病毒YL株序列分析及其VP2基因原核表达 [J], 时乐;黄勇;许信刚;童德文2.传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达 [J], 黄春旭;许信刚;童德文;王志昇n;杜谦;唐麒麟;宁蓬勃3.大片吸虫成虫FG0018表达序列标签序列的电子克隆分析及实验验证 [J], 罗洪林;郑小龙;张为宇;覃华;黄维义4.4株IBDV分离株VP2基因的序列分析及原核表达 [J], 肖跃强;管宇;李书光;刘吉山;王金良;郭广君;沈志强5.广灵驴FTO基因克隆、序列分析及组织差异表达 [J], 邱丽霞;关家伟;李丽;李武峰;杜敏因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达黄冬艳;杨兵;齐欣;陈小玲;徐福洲【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2006(021)005【摘要】根据鸡贫血病毒Cux-1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因.将扩增出的片段克隆到pGM-T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux-1株的VP1基因序列一致.然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET-32a(+)载体上并进行原核表达.SDS-PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应.【总页数】4页(P50-53)【作者】黄冬艳;杨兵;齐欣;陈小玲;徐福洲【作者单位】江西农业大学,动物科学院,江西,南昌,330045;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089;沈阳农业大学,畜牧兽医学院,辽宁,沈阳,110161;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089【正文语种】中文【中图分类】S188【相关文献】1.重组A型FMDV VP1基因乳酸杆菌穿梭表达质粒的构建及在大肠杆菌BL21中的表达 [J], 王淼;周鹏;潘丽;张永光 Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因C末端在大肠杆菌中的表达与纯化 [J], 韩建成;王保海;刘晃;曾江勇;王宝闯3.鸡贫血病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆、原核表达和纯化 [J], 吴艳红;陈建龙;李丛丛;何成强;李云龙4.肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因部分序列在大肠杆菌中的表达 [J], 唐启慧;田新贵;林斌;向开军;周荣5.鸡贫血病毒VP1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物学特性的初步分析 [J], 刘岳龙;秦爱建;金文杰;叶建强;吉荣;崔治中;段玉友因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性分析赵锋;李学花;林世武;郭文杰;杨明;徐增强;邱建东;李进;张瑞【摘要】将从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)核酸进行PCR扩增,获得vp1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了CIAV vp1基因重组质粒,命名为pET32a-vp1.将pET32a-vp1转化E.coliplys,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果表明,vp1基因在大肠杆菌中成功表达.纯化的蛋白质作为包被抗原,ELISA鉴定结果表明具有良好的抗原性.本试验结果为进一步研究用重组抗原制备CIAV ELISA诊断试剂盒奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)008【总页数】5页(P34-38)【关键词】鸡传染性贫血病毒;vp1;原核表达【作者】赵锋;李学花;林世武;郭文杰;杨明;徐增强;邱建东;李进;张瑞【作者单位】太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027;太原市动物卫生监督所,山西太原 030027【正文语种】中文【中图分类】Q786鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)是免疫抑制性疾病鸡传染性贫血病(chicken infectious ane mia)的主要病原,其不但引起骨髓等造血组织萎缩,导致严重贫血甚至死亡,且引起胸腺等淋巴组织萎缩,进而导致免疫抑制,从而对其他病毒、细菌和真菌易感,因此会造成鸡新城疫、传染性法氏囊病及鸡马立克氏病等疫苗的免疫失败(Hassan等,2011)。
江苏1株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其编码区基因序列杜宗沛;杜乐伦【摘要】利用 MDCC -MSB1细胞系从江苏省泰州市发病鸡中分离获得1株病毒,通过间接荧光抗体试验(IFA)确定该病毒为鸡传染性贫血病毒(CAV)。
利用 PCR 扩增、电泳、克隆、核酸测序得到全长2324 bp 的基因编码区序列,该序列碱基完整,无缺失和插入。
经遗传学方法分析发现,该株序列与 GenBank 中已收录的可见 CAV 序列同源性为96.5%~99.8%。
CAV 的3个编码基因序列VP1(1315 bp)、VP2(643 bp)、VP3(366 bp)均有不同程度变异,以VP1变异程度最大。
使用电子显微镜观察到病毒粒子与鸡传染性贫血病毒一致,证实该病毒为鸡传染性贫血病毒新亚型,将其命名为 CAV MY1305-30株并提交至 GanBank,编号为 KF318725、KF318726。
【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】3页(P244-246)【关键词】鸡;传染性贫血病毒;分离鉴定;基因序列;编码【作者】杜宗沛;杜乐伦【作者单位】江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;福建农林大学,福建福州 350002【正文语种】中文【中图分类】S855.3鸡传染性贫血病(Chicken infectious anemia,CIA)最早被称为贫血综合征、贫血-皮炎综合征、出血性贫血病、贫血因子病等,其病原于1979年被首次分离并确定,早期称其为鸡贫血因子(chicken anemia agent,CAA)、鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV),之后逐渐统一称作鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)。
CAV的核酸为环状单股负链DNA,在1995年第6次国际病毒分类大会上将其与猪圆环病毒(PCV)、长尾鹦鹉啄羽病病毒(PBFDV)一起归属于圆环病毒科(Circoviridae),该科病毒是已知最小的动植物病毒,因此很少有人能通过电子显微镜观察到CAV。
鸡贫血病毒VP 3基因的克隆及其体外凋亡诱导效应的研究王宇哲;申志发;田俊;宗义强;屈伸【期刊名称】《华中科技大学学报(医学版)》【年(卷),期】2001(030)004【摘要】用PCR方法扩增了鸡贫血病毒标准株的vp3基因,并将其克隆于真核表达载体pcDNA3上,构建了重组体pcDNA-vp3.经酶切鉴定及测序分析表明,该片段和预期相符.在体外利用LipofectAMINETM介导的基因转染,将pc-DNA-vp3、pcDNA3分别转入肝癌细胞系HepG2和二倍体肝细胞系L-02中,转染后的RT-PCR结果证实vp3基因在细胞中得到了表达.同时利用筛选稳定表达细胞株的技术和原位细胞凋亡检测法,证明了鸡贫血病毒是以凋亡的方式诱导细胞死亡,并且只诱导癌细胞的凋亡,而不诱导正常或二倍体细胞死亡.表明鸡贫血病毒vp3基因很可能成为一种极具潜力的抗肿瘤生物制剂.【总页数】4页(P300-303)【作者】王宇哲;申志发;田俊;宗义强;屈伸【作者单位】华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学教研室,武汉,430030;江汉大学医学与生命科学学院生物化学教研室,武汉,43001;华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学教研室,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学教研室,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学教研室,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】R373;R394;Q343.1【相关文献】1.TRAIL基因与鸡贫血病毒vp3基因体外协同效应的研究 [J], 彭冬君;尹燕华;王宇哲;孙军;宗义强;屈伸2.鸡贫血病毒广州株VP3和VP1基因的克隆与序列分析 [J], 沈海燕;张建峰;刘志成;周恒;郭翠丽;郭鹏举;张春红3.鸡贫血病毒(CAV)vp1基因的克隆及与其他CAV vp1基因的比较(英文) [J], 张刚;何成强;安利国;李云龙4.鸡贫血病毒VP3基因的克隆及在H22细胞中的凋亡诱导状况 [J], 申志发;王宇哲;孙军;宗义强;屈伸5.鸡贫血病毒VP3基因的克隆及诱导人肺癌A549细胞凋亡的研究 [J], 李璐;李琬;喻江因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
鸡传染性贫血病毒VP1基因的原核表达冯昕;荣俊;匡红艳【摘要】根据GenBank上公布的鸡传染性贫血病毒VP1的基因序列设计一系列引物,通过基因扩增得到了鸡传染性贫血病毒(CAV) VP1基因的全长片段和一系列不同N末端截断的VP1基因片段,分别将这些片段插入表达质粒载体pET28a的多克隆位点上,构建成4种重组表达工程菌(E.coli BL21/pET-28-CAVVP1、Ecoli BL21/pET-28-CAVVP1Nd29、E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56、E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137),研究了4种不同长度VP1片段在重组大肠杆菌中的表达,并通过SDS-PAGE电泳筛选最佳表达方式.结果表明:E.coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd29能表达分子质量为44ku的可溶性蛋白,E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56能表达分子质量为40ku的不可溶性蛋白,而在E.coli BL21/pET-28-CAV VP1和E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137的诱导表达产物中未见明显的表达蛋白出现.其中可溶性的CAV VP1Nd29蛋白将有可能用于研制CAV诊断抗原和亚单位疫苗研究.【期刊名称】《长江大学学报(自科版)农学卷》【年(卷),期】2012(009)003【总页数】4页(P34-37)【关键词】鸡传染性贫血;抗原蛋白;原核表达【作者】冯昕;荣俊;匡红艳【作者单位】长江大学生命科学学院,湖北荆州434025;长江大学生命科学学院,湖北荆州434025;长江大学临床医学院,湖北荆州434000【正文语种】中文【中图分类】Q786鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)是鸡传染性贫血病(Chicken infectious anemia,CIA)的主要病原,主要侵害雏鸡,造成以鸡群死亡率升高、再生障碍性贫血、骨髓黄化、胸腺等淋巴器官萎缩为特征的免疫抑制性传染病[1-2]。
鸡贫血病毒全长基因感染性分子克隆的构建李秀梅;江丽萍;郭立力;李颖;朱雅宁;石瑜;杨爱华;陈荣荣【摘要】PCR法扩增鸡贫血病毒全长基因组,将2个全长基因组顺向连接插入到pBluescriptⅡSK(+)质粒载体中,获得Psk2CAV质粒并转染MDCC-MSB1细胞,盲传4代后,用间接免疫荧光抗体试验(IFA)能检测到特异性荧光.将Psk2CAV质粒DNA于腿部肌肉接种10羽1日龄CAV阴性SPF鸡.剖检结果显示,阳性对照组和Psk2CAV质粒组均有鸡只出现腿肌、胸肌轻微出血,胸腺出现萎缩或出血.组织病理学结果显示,阳性对照组和Psk2CAV质粒组胸腺小叶萎缩,出血、淤血,髓质部萎缩,淋巴细胞减少.通过PCR可以分别从体外感染MDCC-MSB1细胞和体内感染鸡只中扩增到病毒基因片段.本研究证明含有双拷贝CAV的重组质粒Psk2CAV在体内、外均具有感染性,能衍生出病毒,并产生符合自然感染CAV的大体病变和组织病理学变化.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2011(032)008【总页数】6页(P6-11)【关键词】鸡贫血病毒;聚合酶链反应;感染性分子克隆;转染【作者】李秀梅;江丽萍;郭立力;李颖;朱雅宁;石瑜;杨爱华;陈荣荣【作者单位】天津市动物疫病预防控制中心,天津300402;山西农业大学,山西太谷030801;天津市动物疫病预防控制中心,天津300402;天津市动物疫病预防控制中心,天津300402;天津市动物疫病预防控制中心,天津300402;天津市动物疫病预防控制中心,天津300402;天津市动物疫病预防控制中心,天津300402;天津市动物疫病预防控制中心,天津300402【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2;Q785鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)的基因组是2.3 kb的单股环状链DNA[1],由编码区和非编码区两部分组成。
编码区的CAV基因组包含3个部分或完全重叠的开放阅读框(ORF),分别命名为ORF1、ORF2和ORF3,大小分别为648,363和1 350 bp,其中,ORF1和ORF2完全重合,ORF1与ORF3部分重叠[2],分别编码 VP2(24 Ku)、VP3(14 Ku)和VP1(52 Ku)的蛋白。
鸡贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备齐欣;杨兵;赵玉军【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2006(000)005【摘要】鸡贫血病毒是鸡传染性贫血病的病原体,它广泛存在于世界各地,成为危害养禽业的主要病原之一.鸡贫血病毒基因组含有3个开放阅读框架,分别编码分子量为51.6 kDa(VPl)、24 kDa(VP2)和13.6 kDa(VP3)的3种蛋白质.本文将克隆化VP2基因亚克隆到PET-32a(+)载体上并进行原核表达,用PET-32a(+)表达的VP2融合蛋白免疫Balb/c小鼠,经过杂交瘤细胞的建立、融合细胞的筛选和克隆化培养,获得一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3C5.腹水单克隆抗体的ELISA效价为1:409 600,经Western-blotting证明单抗3C5为针对VP2融合蛋白的单抗.为VP2融合蛋白的纯化和鸡贫血病毒的检测、鉴定和奠定了基础.【总页数】4页(P48-51)【作者】齐欣;杨兵;赵玉军【作者单位】沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁,沈阳,110161;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100089【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.25型蓝舌病病毒VP2蛋白原核表达及其单克隆抗体制备 [J], 李一经;李佳璇;武啸;臧明鑫;谢双羽;姜艳平;崔文;唐丽杰2.抗鸡贫血病毒结构蛋白单克隆抗体制备及其对应抗原表位分析 [J], 王晓艳;高宏雷;高玉龙;程宇;王笑梅3.蓝舌病病毒15型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定 [J], 张沁;孙恩成;徐青元;杨涛;王海秀;冯瑜菲;李俊平;吕爽;吴东来4.一株抗猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定 [J], 张泉;张元峰;黄丽;王胜男;蔡雪辉;熊涛;翁长江5.牛细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立 [J], 赵飞鹏;李木子;于晓丽;秦松跃;狄亚心;王一晗;姜艳平;崔文;乔薪瑗因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
鸡贫血病毒全长感染性分子克隆的构建
1 材料和方法
1.1毒株、载体和细胞
CAV毒株由本实验室分离、保存,pBluescript ⅡSK(+)载体、大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存;MDCC-MSB1细胞
1.2 主要试剂
限制性内切酶KpnⅠ,Ncol,T4DNALigase,小牛肠碱性磷酸酶,PrimesTARWHsDNA Polymerase, DNAMarker;质粒小量提取试剂盒,核酸凝胶回收试剂盒;PCR产物纯化试剂盒;其他试剂( )。
1.3 引物设计与合成
根据CA VCux-l株序列,设计一对引物IU、IL扩增CA V
全长基因组,利用引物将基因组1902位的碱基G替换为A,从而在不改变编码氨基酸的前提下引入KpnⅠ酶切位点作为分子标签;为了在拯救病毒过程中,检测分子标签的存在,设计引物P13和P16用来扩增含有分子标签的VP1基因。
引物序列见表1
表1 PCR引物序列
Table1 Primers sequence of PCR
引物名称引物序列引物位置NameofPrimers SequeneesofPrimers Position
IU 5’一GCTGGTACCGCTCGGCACGGAGAC一3’1920一1940 IL 5’一AGGGGTACCAGCGTGTGCCATCTC一3’1925一1905 P13 5’一ATCTGCAGGTAAGATGGCAAGACGAG一3’848一865
P16 5’一AACTGCAGTTTTCAGGGCTGCGTCC一3’2189一2205 注:下划线代表酶切位点,阴影代表突变的碱基。
1.4 重组质粒pBluem2CA V的构建和鉴定
1.4.1 CA V全长基因组的获取
由CA V鸡胚中提取基因组,以此为模板,用引物IU、IL进行PCR扩增,反应条件为94℃预变性5min,98℃变性10s,68℃退火延伸3min30s,30个循环,72℃延伸10min,扩增后产物用核酸凝胶回收试剂盒回收。
回收后产物用KpnⅠ酶切,回收备用。
1.4.2 重组质粒pBluemCA V的构建和鉴定
pBluescript载体用KpnⅠ酶切,回收纯化后,再用小牛肠碱性磷酸酶进行去磷酸化处理,回收纯化后,与KpnⅠ酶切的基因组连接,转化E.coliDH5α感受态细胞。
挑取单个菌落培养,提取质粒,进行PCR、KpnⅠ酶切及测序鉴定。
所有操作都参照《分子克隆》(第三版)进行。
1.4.3 重组pBluem2CA V的构建和鉴定
提取1.4.2中鉴定为阳性的质粒,通过改变KpnⅠ酶的作用浓度及反应时间来摸索最佳的不完全酶切条件,将阳性质粒进行不完全酶切,回收纯化不完全酶切产物,去磷酸化处理后,与1.4.1中处理的基因组进行连接,转化E.coliDH5α感受态细胞。
挑取单个菌落培养,提取质粒,进行酶切鉴定,同时用载体通用引物进行测序,进一步证实两个基因组是否顺向连
入载体。
1.5 pBluem2CA V转染MDCC-MSB1细胞。