凯氏定氮法测定食品中蛋白质

蛋白质的测定方法—凯氏定氮法一、原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

二、试剂1、硫酸铜硫酸钾浓硫酸氢氧化钠2、硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解并稀释至1000ml。

3、氢氧化钠溶液（400g/L）：称取400gNaOH加水溶解后，放冷，并稀释至1000ml。

4、盐酸标准溶液（0.05mol/L）5、甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100ml。

6、溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100ml。

7、甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：临用时以1:5混合。

三、测定1、试样处理（消化）：准确称取水解胶原蛋白0.5g,准确至0.0001g，硫酸铜0.2g，硫酸钾6g于干燥洁净的凯氏定氮管中，至消化炉上，加浓硫酸20ml，盖帽。

开启消化炉（温度设定为400℃），仪器大约20分钟达到设定温度，开始计时，样品消化需2-3h，至液体呈蓝绿色并澄清透明后。

断电，放冷。

2、蒸馏与吸收：将消化好的试样转移至100ml容量瓶中，加水（边加边缓慢振摇容量瓶，由于样品放热，操作时戴手套以免烫伤）稀释至100ml容量瓶中，摇匀，备用。

同时做空白试验。

向接收瓶中加入硼酸（20g/L）50ml及10D甲基红—溴甲酚绿混合指示剂。

打开凯氏定氮仪电源开关，打开冷却水，设置加碱（40%的NaOH 溶液）时间为7秒，蒸馏时间为6分钟，取定容后溶液10ml到消化管中，放置到相应位置。

关闭安全门，开机预热3分钟后按启动键开始加碱、蒸馏。

当吸收液呈中性时，停止吸收。

用0.05mol/L盐酸标准液滴定接收液，颜色由绿色变为灰红色即为滴定终点，记录消耗盐酸体积。

3、计算C*(V1-V0)*0.014X=----------------------*F*100M*10/100其中水解胶原蛋白换算系数F为5.791、注意事项1、开机预热3分钟，第一个样品测试用蒸馏水代替样品，加碱时间设置为0，使仪器预热。

营养技能实训指导≤烹饪营养与安全≥课程组福州黎明职业技术学院药学系2007年02月目录1、实训一食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）2、实训二食物中脂肪含量的测定（索氏抽提法）3、实训三荧光法测定食物中维生素B24、实训四大学生食谱编制与计算5、实训五用配餐软件配制幼儿园一周食谱6、实训六烹饪营养配餐与菜单设计7、实训七厨房用具砧板的卫生调查（细菌菌落总数测定）8、实训八厨房卫生调查（大肠菌群快速检测法）实训一食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。

二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。

食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（CuSO4·5H20）2、硫酸钾3、硫酸（密度为1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）c——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；0.0140 ——1.0mL 盐酸[c(HCl) 1.000mol / L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；m——样品的质量（g）；F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。

计算结果保留三位有效数字。

六、注意事项及说明1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。

半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g；液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）。

实验:食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。

二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。

食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

三、仪器与试剂（一）试剂（所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制）1、硫酸铜（CuSO4·5H20）2、硫酸钾3、浓硫酸（密度为1.8419g/L）4、2%硼酸溶液（20g/L）5、40%氢氧化钠溶液（400g/L）6、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。

7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙醇溶液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。

（二）仪器微量定氮蒸馏装置：如图3-所示。

图3-微量凯氏定氮装置1、电炉；2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。

四、实验步骤1、样品消化称取样品约0.3g（±0.001g），移入干燥的100mL凯氏定氮烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。

一般消解温度都设在240度及240度以上，如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。

微量凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量一、实验目的：1、了解微量凯氏定氮法测定蛋白质的卫生学意义。

2、熟悉蛋白质西数在蛋白质含量计算中的应用与凯氏定氮法测定蛋白质的操作过程。

3、掌握微量凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法。

二、实验原理：有机物中的氮在强热和浓硫酸作用下，消化生成硫酸铵，在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出氨气，释放的氨气采用硼酸液进行收集，再用已知浓度的盐酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出氮含量，然后乘以相应的系数，计算得到蛋白质含量。

三、实验原始数据记录：HCL标准液的摩尔浓度：M=0.01mol/L空白滴定消耗HCL体积：V1=0.2ml样品滴定消耗HCL体积：V2=1.3ml样品消化液体积：V3=5ml样品质量W=0.212g四、结果计算：样品中蛋白质含量（g/100g）=[(V2-V1)*M*0.014*6.25]*100/(V3*W/100)=9.08五、结果分析及讨论：（1）凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量时，样品应是均匀的。

所以固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。

若沾附可用少量水冲下，以免样品消化不完全，使结果偏低。

（3）蒸馏前，样品和反应液从加样口加入，每加一次，用蒸馏水冲洗一次，再关闭加样口，并加少量蒸馏水封液，以防止漏气，导致结果偏低。

（4）氨气收集管口应没入指示剂中，防止氨气溢出，导致结果偏低。

（5）利用负压可将反应室内的溶液吸出，在加适量蒸馏水冲洗，反复几次，可清洗反应室。

（6）滴定终点以绿色消失为准，终点稍过即为紫红色。

（7）这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。

只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。

思考题（1）消化时为什么只能用浓硫酸，而不用浓硝酸或高氯酸？答：凯氏定氮的基本原理是使有机物中的氮转化为铵盐，然后加碱蒸出氨气，然后酸碱滴定。

其中消化作用就是使有机氮变为铵盐，如果用硝酸或者高氯酸，在加热、酸性情况下硝酸会氧化铵根，生成氮气、一氧化氮等物质，从而使定氮结果偏低或无法定出。

凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量实验凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量一、实验目的与要求：1.掌控微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作方式技术。

2.掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技能与含氮量的计算。

二、实验原理样品与浓硫酸和催化剂一同冷却消化，并使蛋白质水解，其中c、h构成co2、h2o逸出，而样品中的有机氮转变为氨与硫酸融合成硫酸铵回到酸液中。

然后将消化液碱化，酿造，并使氨游离，用水蒸气滤出，用硼酸稀释。

稀释氨后的硼酸再以标准盐酸溶液电解所分解成的硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可以排序出来总氮量，再换算为粗蛋白含量。

2nh2-(ch2)2-cooh+13h2so4=(nh4)2so4+6co2↑+12so2↑+16h2o(nh4)2so4+2naoh=2nh3↑+na2so4+2h2o2 nh3+4h3bo3=(nh4)2b4o7+5h2o(nh4)2b4o7+2hcl+5h2o=2nh4cl+4h3bo3三、样品：面粉四、仪器与试剂仪器：凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、微量滴定管、加热套1000w试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。

1.消化试剂：浓h2so4硫酸铜(液态)硫酸钾(液态)2.2%硼酸(h3bo3)溶液:10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用。

二组配500ml3.40%naoh溶液4.0.0100mol/l盐酸标准溶液5.混合指示剂:临用时，把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成(比例5：1)．(公用)五、测定方法1、样品消化：1精确称取面粉1.0~1.2g左右于定量滤纸上，纸盒不好，插进潮湿的定氮烧瓶中（勿附着在瓶壁上），重新加入0.5gcuso4、6gk2so4及25ml浓硫酸，提数粒玻璃珠，轻轻容器后，用电炉以小火冷却，等待泡沫暂停产生后，加强火力，至液体变小蓝绿色透明化后，再继续冷却微沸30分钟。

凯氏定氮法测定蛋白质含量简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它通过将样品中的有机氮转化为氨，然后将氨转化为氨基氮，再由氨基氮计算得出蛋白质的含量。

这个方法的优点是稳定可靠，适用于各种类型的样品。

实验原理凯氏定氮法的实验原理如下：1.样品预处理：将待测样品进行预处理，去除样品中的非氮有机物。

这样可以确保凯氏定氮方法只测定到蛋白质中的氮。

2.消化反应：将预处理后的样品与硫酸相结合，加热至沸腾。

在这个过程中，有机氮将被转化为氨。

3.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。

4.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。

5.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束，测定出反应过程中消耗的酸的体积。

6.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。

实验步骤以下是凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验步骤：1.准备样品：根据实验需要，准备待测样品。

样品的选择应根据实验目的和样品的特性进行。

2.样品预处理：将样品经过细碎、研磨等处理，去除样品中的非氮有机物。

3.消化反应：将预处理后的样品与浓硫酸相结合，加热至沸腾。

消化时间一般为2小时。

4.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。

5.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。

6.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束。

7.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。

实验注意事项1.在进行样品消化时，必须控制好加热温度，避免样品的溢出和烧焦。

2.在进行滴定时，应注意控制滴液的速度，避免过量的酸滴入。

3.实验过程中需注意个人安全，避免触及强酸和强碱。

食品中蛋白质的测定方法GB/T14771-931 本标准规定了用凯氏定氮法测定食品中蛋白质的方法。

本标准适用于肉禽制品、豆制品、水产品、调味品、谷物制品、发酵制品、糕点、植物蛋白饮料等食品中蛋白质的测定。

2 引用标准GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备3 原理以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，与硫酸生成硫酸铵。

然后加碱蒸馏使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用盐酸标准滴定溶液滴定。

根据盐酸标准滴定溶液的消耗量计算蛋白质的含量。

4 试剂和溶液：所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水。

4．1 硫酸铜（GB 665）。

4．2 硫酸钾（HG 3—920）。

4．3 硫酸（GB 625）。

4．4 40%氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠（GB 629）溶于60mL蒸馏水中。

4．5 4%硼酸溶液：称取4g硼酸（GB 628）溶于蒸馏水中稀释至100mL。

4．6 0.1mol/L盐酸标准滴定溶液：按GB 601规定的方法配制与标定。

4．7 95%乙醇（GB 679）。

4．8 甲基红-次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液（1g/L）与甲基红乙醇溶液（1g/L）按1+2体积比混合。

5 仪器、设备实验室常规仪器及下列各项：5．1 凯氏烧瓶：500mL。

5．2 可调式电炉。

5．3 蒸汽蒸馏装置：见图1和图2。

6 试样的制备6．1 固体样品：取有代表性的样品至少200g，用研钵捣碎、研细；不易捣碎、研细的样品应切（剪）成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎。

6．2 液体样品：取充分混匀的液体样品至少200g。

6．3 粉状样品：取有代表性的样品至少200g（如粉粒较大也应用研钵研细），混合均匀。

6．4 糊状样品：取有代表性的样品至少200g，混合均匀。

6．5 固液体样品：按固、液体比例，取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，混合均匀。

6．6 肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g，用铰肉机至少铰两次，混合均匀。

食品安全国家标准食品中蛋白质的测定1范围本标准规定了食品中蛋白质的测定方法㊂本标准第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定,第三法适用于蛋白质含量在10g/100g 以上的粮食㊁豆类奶粉㊁米粉㊁蛋白质粉等固体试样的测定㊂本标准不适用于添加无机含氮物质㊁有机非蛋白质含氮物质的食品的测定㊂第一法凯氏定氮法2原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵㊂碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量计算氮含量,再乘以换算系数,即为蛋白质的含量㊂3试剂和材料3.1试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂3.1.1硫酸铜(C u S O4㊃5H2O)㊂3.1.2硫酸钾(K2S O4)㊂3.1.3硫酸(H2S O4)㊂3.1.4硼酸(H3B O3)㊂3.1.5甲基红指示剂(C15H15N3O2)㊂3.1.6溴甲酚绿指示剂(C21H14B r4O5S)㊂3.1.7亚甲基蓝指示剂(C16H18C l N3S㊃3H2O)㊂3.1.8氢氧化钠(N a O H)㊂3.1.995%乙醇(C2H5OH)㊂3.2试剂配制3.2.1硼酸溶液(20g/L):称取20g硼酸,加水溶解后并稀释至1000m L㊂3.2.2氢氧化钠溶液(400g/L):称取40g氢氧化钠加水溶解后,放冷,并稀释至100m L㊂3.2.3硫酸标准滴定溶液[c(12H2S O4)]0.0500m o l/L或盐酸标准滴定溶液[c(H C l)]0.0500m o l/L㊂3.2.4甲基红乙醇溶液(1g/L):称取0.1g甲基红,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂3.2.5亚甲基蓝乙醇溶液(1g/L):称取0.1g亚甲基蓝,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂3.2.6溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L):称取0.1g溴甲酚绿,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂3.2.7 A混合指示液:2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合㊂3.2.8 B混合指示液:1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合㊂4仪器和设备4.1天平:感量为1m g㊂4.2定氮蒸馏装置:如图1所示㊂4.3自动凯氏定氮仪㊂说明:1 电炉;2 水蒸气发生器(2L烧瓶);3 螺旋夹;4 小玻杯及棒状玻塞;5 反应室;6 反应室外层;7 橡皮管及螺旋夹;8 冷凝管;9 蒸馏液接收瓶㊂图1定氮蒸馏装置图5分析步骤5.1凯氏定氮法5.1.1试样处理:称取充分混匀的固体试样0.2g~2g㊁半固体试样2g~5g或液体试样10g~25g (约当于30m g~40m g氮),精确至0.001g,移入干燥的100m L㊁250m L或500m L定氮瓶中,加入0.4g硫酸铜㊁6g硫酸钾及20m L硫酸,轻摇后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45ħ角斜支于有小孔的石棉网上㊂小心加热,待内容物全部碳化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色并澄清透明后,再继续加热0.5h~1h㊂取下放冷,小心加入20m L水,放冷后,移入100m L容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用㊂同时做试剂空白试验㊂5.1.2测定:按图1装好定氮蒸馏装置,向水蒸气发生器内装水至2/3处,加入数粒玻璃珠,加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾㊂5.1.3向接受瓶内加入10.0m L硼酸溶液及1滴~2滴A混合指示剂或B混合指示剂,并使冷凝管的下端插入液面下,根据试样中氮含量,准确吸取2.0m L ~10.0m L 试样处理液由小玻杯注入反应室,以10m L 水洗涤小玻杯并使之流入反应室内,随后塞紧棒状玻塞㊂将10.0m L 氢氧化钠溶液倒入小玻杯,提起玻塞使其缓缓流入反应室,立即将玻塞盖紧,并水封㊂夹紧螺旋夹,开始蒸馏㊂蒸馏10m i n 后移动蒸馏液接收瓶,液面离开冷凝管下端,再蒸馏1m i n ㊂然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,取下蒸馏液接收瓶㊂尽快以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点,如用A 混合指示液,终点颜色为灰蓝色;如用B 混合指示液,终点颜色为浅灰红色㊂同时做试剂空白㊂5.2 自动凯氏定氮仪法称取充分混匀的固体试样0.2g ~2g ㊁半固体试样2g ~5g 或液体试样10g ~25g (约当于30m g ~40m g 氮),精确至0.001g ,至消化管中,再加入0.4g 硫酸铜㊁6g 硫酸钾及20m L 硫酸于消化炉进行消化㊂当消化炉温度达到420ħ之后,继续消化1h ,此时消化管中的液体呈绿色透明状,取出冷却后加入50m L 水,于自动凯氏定氮仪(使用前加入氢氧化钠溶液,盐酸或硫酸标准溶液以及含有混合指示剂A 或B 的硼酸溶液)上实现自动加液㊁蒸馏㊁滴定和记录滴定数据的过程㊂6 分析结果的表述试样中蛋白质的含量按式(1)计算:X =(V 1-V 2)ˑc ˑ0.0140m ˑV 3/100ˑF ˑ100 (1) 式中:X 试样中蛋白质的含量,单位为克每百克(g /100g );V 1 试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,单位为毫升(m L );V 2 试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,单位为毫升(m L );c硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度,单位为摩尔每升(m o l /L );0.0140 1.0m L 硫酸[c (12H 2S O 4)=1.000m o l /L ]或盐酸[c (H C l )=1.000m o l /L ]标准滴定溶液相当的氮的质量,单位为克(g);m试样的质量,单位为克(g);V 3 吸取消化液的体积,单位为毫升(m L );F氮换算为蛋白质的系数,各种食品中氮转换系数见附录A ;100换算系数㊂蛋白质含量ȡ1g /100g 时,结果保留三位有效数字;蛋白质含量<1g /100g 时,结果保留两位有效数字㊂注:当只检测氮含量时,不需要乘蛋白质换算系数F ㊂7 精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%㊂第二法 分光光度法8 原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,在p H4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物㊂在波长400n m下测定吸光度值,与标准系列比较定量,结果乘以换算系数,即为蛋白质含量㊂9试剂和材料9.1试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂9.1.1硫酸铜(C u S O4㊃5H2O)㊂9.1.2硫酸钾(K2S O4)㊂9.1.3硫酸(H2S O4):优级纯㊂9.1.4氢氧化钠(N a O H)㊂9.1.5对硝基苯酚(C6H5N O3)㊂9.1.6乙酸钠(C H3C O O N a㊃3H2O)㊂9.1.7无水乙酸钠(C H3C O O N a)㊂9.1.8乙酸(C H3C O O H):优级纯㊂9.1.937%甲醛(H C HO)㊂9.1.10乙酰丙酮(C5H8O2)㊂9.2试剂配制9.2.1氢氧化钠溶液(300g/L):称取30g氢氧化钠加水溶解后,放冷,并稀释至100m L㊂9.2.2对硝基苯酚指示剂溶液(1g/L):称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20m L95%乙醇中,加水稀释至100m L㊂9.2.3乙酸溶液(1m o l/L):量取5.8m L乙酸,加水稀释至100m L㊂9.2.4乙酸钠溶液(1m o l/L):称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠,加水溶解稀释至500m L㊂9.2.5乙酸钠-乙酸缓冲溶液:量取60m L乙酸钠溶液与40m L乙酸溶液混合,该溶液p H4.8㊂9.2.6显色剂:15m L甲醛与7.8m L乙酰丙酮混合,加水稀释至100m L,剧烈振摇混匀(室温下放置稳定3d)㊂9.2.7氨氮标准储备溶液(以氮计)(1.0g/L):称取105ħ干燥2h的硫酸铵0.4720g加水溶解后移于100m L容量瓶中,并稀释至刻度,混匀,此溶液每毫升相当于1.0m g氮㊂9.2.8氨氮标准使用溶液(0.1g/L):用移液管吸取10.00m L氨氮标准储备液于100m L容量瓶内,加水定容至刻度,混匀,此溶液每毫升相当于0.1m g氮㊂10仪器和设备10.1分光光度计㊂10.2电热恒温水浴锅:100ħʃ0.5ħ㊂10.310m L具塞玻璃比色管㊂10.4天平:感量为1m g㊂11分析步骤11.1试样消解称取充分混匀的固体试样0.1g~0.5g(精确至0.001g)㊁半固体试样0.2g~1g(精确至0.001g)或液体试样1g ~5g (精确至0.001g ),移入干燥的100m L 或250m L 定氮瓶中,加入0.1g 硫酸铜㊁1g 硫酸钾及5m L 硫酸,摇匀后于瓶口放一小漏斗,将定氮瓶以45ʎ角斜支于有小孔的石棉网上㊂缓慢加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热0.5h ㊂取下放冷,慢慢加入20m L 水,放冷后移入50m L 或100m L 容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用㊂按同一方法做试剂空白试验㊂11.2 试样溶液的制备吸取2.00m L ~5.00m L 试样或试剂空白消化液于50m L 或100m L 容量瓶内,加1滴~2滴对硝基苯酚指示剂溶液,摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色,再滴加乙酸溶液至溶液无色,用水稀释至刻度,混匀㊂11.3 标准曲线的绘制吸取0.00m L ㊁0.05m L ㊁0.10m L ㊁0.20m L ㊁0.40m L ㊁0.60m L ㊁0.80m L 和1.00m L 氨氮标准使用溶液(相当于0.00μg ㊁5.00μg ㊁10.0μg ㊁20.0μg ㊁40.0μg ㊁60.0μg ㊁80.0μg 和100.0μg 氮),分别置于10m L 比色管中㊂加4.0m L 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0m L 显色剂,加水稀释至刻度,混匀㊂置于100ħ水浴中加热15m i n ㊂取出用水冷却至室温后,移入1c m 比色杯内,以零管为参比,于波长400n m处测量吸光度值,根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程㊂11.4 试样测定吸取0.50m L ~2.00m L (约相当于氮<100μg)试样溶液和同量的试剂空白溶液,分别于10m L 比色管中㊂加4.0m L 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0m L 显色剂,加水稀释至刻度,混匀㊂置于100ħ水浴中加热15m i n ㊂取出用水冷却至室温后,移入1c m 比色杯内,以零管为参比,于波长400n m 处测量吸光度值,试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量㊂12 分析结果的表述试样中蛋白质的含量按式(2)计算:X =(C -C 0)ˑV 1ˑV 3m ˑV 2ˑV 4ˑ1000ˑ1000ˑ100ˑF (2) 式中:X 试样中蛋白质的含量,单位为克每百克(g/100g );C试样测定液中氮的含量,单位为微克(μg );C 0试剂空白测定液中氮的含量,单位为微克(μg );V 1 试样消化液定容体积,单位为毫升(m L );V 3 试样溶液总体积,单位为毫升(m L );m 试样质量,单位为克(g);V 2 制备试样溶液的消化液体积,单位为毫升(m L );V 4测定用试样溶液体积,单位为毫升(m L );1000换算系数;100换算系数;F氮换算为蛋白质的系数㊂蛋白质含量ȡ1g /100g 时,结果保留三位有效数字;蛋白质含量<1g /100g 时,结果保留两位有效数字㊂。

一、概述蛋白质是生命活动中不可或缺的重要物质，其含量的测定在生物化学研究和食品加工领域具有重要意义。

针对蛋白质含量的测定方法有许多种，其中凯氏定氮法是一种经典且常用的测定方法，本文将就凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作进行详细介绍。

二、凯氏定氮法原理1. 基本原理凯氏定氮法是通过测定样品中氨基氮的含量来间接测定蛋白质含量的方法。

蛋白质是由氨基酸构成的，而氨基酸中含有氮元素，故可以通过测定样品中氮元素的含量来推算出样品中蛋白质的含量。

2. 操作步骤（1）样品的预处理：将待测样品进行适当的预处理，通常是将样品中的有机物燃烧成气体，从而将其中的氮元素转化为氮气。

（2）氮气的收集：收集样品燃烧产生的氮气，通常是通过化学吸收剂的吸收来将氮气纯化。

（3）氮气的测定：将纯化后的氮气进行定量测定，得出氮气的含量。

（4）蛋白质含量的计算：根据氮气的含量，通过一定的计算公式来推算出样品中蛋白质的含量。

三、凯氏定氮法操作注意事项1. 样品的选择选择代表性好的样品进行测定，避免样品中含有其他干扰物质，影响测定结果的准确性。

2. 仪器的使用严格按照仪器的操作说明进行操作，保证测定过程的准确性和精确度。

3. 数据的处理对测定得到的数据进行严格的处理，计算过程中不应出现错误，以确保蛋白质含量的测定结果准确可靠。

四、凯氏定氮法测定蛋白质的优缺点1. 优点（1）测定范围广：凯氏定氮法可以适用于各种类型的样品，包括食品、饲料、生物组织等。

（2）测定结果可靠：经过严格的样品预处理和操作步骤，测定结果具有较高的准确性和精确度。

2. 缺点（1）操作繁琐：凯氏定氮法的操作步骤相对繁琐，需要较长的操作时间。

（2）不适用于含氮杂质的样品：如果样品中含有其他氮元素化合物的干扰物质，则可能影响凯氏定氮法的测定结果。

五、结语凯氏定氮法作为一种经典且常用的蛋白质测定方法，其原理和操作步骤相对简单明了，但需要严格遵守操作规范，以确保测定结果的准确性和可靠性。