微生物与寄生虫学实验指导目录实验一微生物的形态学检测（2学时）实验二理化因素对微生物的影响（2学时）实验三肠道致病性细菌的分离与鉴定（4学时）实验四抗酸染色（2学时）实验五寄生虫学实验（2学时）微生物与寄生虫学实验序言本实验在于使学生加深和巩固课堂内容，并在掌握系统理论知识的基础上，学习微生物与寄生虫学的基本操作技能，通过实验加强无菌概念，培养独立工作和分析问题的能力，为今后有关的疾病诊断与中医中药的科学研究工作打下良好的基础。
本实验指导共包括五个试验项目，共计教学12学时，按教学计划及大纲要求供我院中医学专业、针灸推拿专业、骨伤学专业、护理学专业、中西医结合等专业学生使用。
实验室规则本门学科实验的对象大多是病原微生物，如果不慎发生意外，不仅自身可能遭致感染，并有可能将病原微生物传给他人。
因此，进入实验室必须遵守以下规则：1. 非实验必需物品，不准带进实验室。
2．进入实验室必须穿工作服，按规定就座，保持肃静。
3．上实验课要严格遵守课堂纪律，不得高声谈笑及乱动物品，禁止吸烟和进食。
4．实验时听从老师指导，牢固树立无菌观点，严格遵守无菌操作规程，若发生菌液污染，损坏物品等事故，应立即报告老师及时处理。
5．实验中用过的染菌器材如吸管，试管和用过的玻片等应及时放人含有消毒液的容器内，不得放在桌上，也不可在水槽里冲洗。
6．爱护公物，节约使用实验材料；注意安全使用水、电、煤气。
7．实验完毕，按要求整理器材物品，打扫卫生。
脱下工作服，消毒洗手后，离开实验室。
8．作业应在规定时间内完成，实验报告要求简洁扼要，字迹清楚，画图力求正确、客观。
实验一微生物的形态学检测一、实验目的1、掌握细菌的基本形态（球菌、杆菌、弧菌）。
2、掌握革兰氏染色的操作方法。
3、熟悉生物显微镜的使用，特别是油镜的使用和保护；4、熟悉革兰氏染色的原理。
二、实验内容（一）显微镜油镜的使用及保护1、原理：在一般微生物学实验中最常使用的是普通光学显微镜的油镜。
油镜镜头透镜很小，进入镜筒的光线很少，使用时为了增加亮度，必须在标本玻片与油镜头之间，滴加香柏油，因为香柏油的折光率与载玻片相似，这样就可使通过聚光器进入载玻片的光线不会因折射而散失，几乎全部进入镜筒内，使视野明亮，物象清楚。
2、材料与试剂生物显微镜及香柏油、二甲苯、标本片等。
3、操作步骤（1）坐姿：使用显微镜油镜时，必须坐端，镜体保持垂直位，不要使载物台倾斜，以免香柏油或悬液标本流出。
（2）识别油镜头：油镜头上一般刻有“X 100”，“Oil”，“HI”等标记。
（3）对光：用低倍镜对光，检查染色标本时光线宜强，要抬高聚光器，放大光圈，取得最大亮度。
（4）滴加香柏油：将标本放在载物台上固定好。
滴加香柏油1滴，换油镜检查。
（5）找焦点：将油镜移至中央对准标本，从侧面注视镜头，并缓慢转动粗螺旋，使物镜筒下降，直至镜头浸于香柏油中并几乎接触到标本为止。
然后将视线移至目镜，一面观察一面向上慢慢转动粗螺旋，待看到模糊的物象时，即改用细螺旋，调节焦点以寻求清晰的物象。
（6）清洁保养：镜检完毕，将镜筒升起，取出标本片，用镜纸将镜头上的油擦净。
若油已干，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去油迹，再用擦镜纸揩去二甲苯。
然后，将聚光镜降下，各物镜呈“八”字形，套好保护套。
（二）细菌的革兰氏染色法1、原理G+菌细胞壁结构致密（肽聚糖层厚），且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色。
G-菌细胞壁结构疏松（肽聚糖层薄），且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。
G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；G-菌菌体内核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。
G+菌等电点比G-菌低，在同一pH值条件下阳性菌比阴性菌所带负电荷要多，故与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合牢固，不易被乙醇脱色。
2、材料金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌培养液、接种环、酒精灯、革兰染色液（结晶紫、卢戈碘液、95％乙醇、复红或沙黄染液）。
3、操作步骤（1）标本片制备①取干净载玻片l块，用玻璃铅笔划一个区域。
②接种环按无菌操作法挑取少许菌液于区域中涂成一薄层，接种环在火焰上烧灼灭菌。
③在室温下自然干燥。
④将玻片通过火焰3次固定标本，自然冷却。
（2）染色①初染：在固定好并已冷却的涂片标本上滴加结晶紫染液，要盖满菌膜。
约1分钟后用细水流从玻片的一端把游离的染液洗去。
②媒染：滴加卢戈碘液数滴，作用l分钟后，轻轻水洗。
③脱色：在玻片上加95％乙醇2～3滴，并轻轻转动玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如此重复数次，直至流下的乙醇几乎无色或稍呈淡紫色，流水冲洗。
④复染：滴加稀释复红染液数滴，作用1分钟后流水冲洗。
染色完毕，用吸水纸将标本片吸干，玻片上滴加香柏油，油镜观察。
（3）结果判定：染成紫色者为革兰阳性（G＋）菌，染成红色者为革兰阴性（G-）菌。
（三）细菌的基本形态（示教）油镜下观察：球菌（葡萄球菌）革兰染色片、杆菌（大肠杆菌）革兰染色片、弧菌（霍乱弧菌）革兰染色片，注意观察细菌的形态、大小、排列和染色。
三、作业1、绘出示教镜下细菌的基本形态（注意标明菌名、形态、排列、染色性）。
2、革兰氏染色结果（1）、用红蓝铅绘制出镜下所见两种细菌的形态（注意大小、形态、排列和染色性）。
（2）、叙述革兰氏染色的意义。
四、思考题1、试比较革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁结构的特征？实验二理化因素对微生物的影响一、实验目的1、掌握细菌常用的接种方法和在不同培养基上的生长现象，细菌的三种特殊结构。
2、熟悉常用人工培养基的种类，实验室常用消毒和灭菌设备的原理及使用方法。
3、了解常用人工培养基的制备方法、细菌在自然界和人体的分布特点。
二、实验内容（—）常用培养基的制备方法1、原理：培养基是用人工方法制备而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养制品。
培养基按其物理性状可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种。
2、材料与方法：（1）肉汤培养基①成分：新鲜绞碎牛肉50g（或牛肉膏0.5g），蛋白胨lg，氯化钠0.5g，蒸馏水100m1。
②方法：取新鲜牛肉50g去脂肪、筋膜，绞碎。
加水100rnl，搅匀，置冰箱过夜，次日取出，煮沸半小时，用脱脂棉和纱布过滤，并补足水分至原来的量，即为牛肉浸液。
再加人蛋白胨、氯化钠，加热使之完全溶解，调整pH值至7.6～7.8，煮沸10分钟，过滤，分装，高压灭菌后备用。
（2）琼脂培养基①固体培养基：在肉汤培养基中加人2％～3%琼脂，融化后调整pH值至7.6～7.8，分装，高压灭菌，在室温下凝固即为固体培养基，有平板、斜面和琼脂高层等数种。
②半固体培养基：如果在肉汤培养基中加人的琼脂量为0.3％～0.5％，如上炮制，灭菌后取出直立冷却，即为半固体培养基。
③血液琼脂培养基：有些细菌营养要求比较高，在普通的琼脂培养基上不能很好生长，需用血液琼脂培养基进行培养。
将预先制备好的普通固体培养基100ml加热融化，待冷却到50℃左右时，用无菌操作法加入8～10ml的脱纤维兔血或羊血，混匀后倒入无菌平皿或试管中，冷却后即为血平板或血琼脂斜面培养基。
（二）细菌的培养技术（技术操作）1、材料：普通液体培养基、琼脂平板培养基、斜面培养基、半固体培养基、大肠埃希菌与葡萄球菌混合菌液、大肠埃希菌斜面培养物、酒精灯、接种环、恒温培养箱。
2、操作步骤：细菌的接种方法因各种培养基的不同而异。
常用的有以下几种方法：（1）液体培养基接种法①用灭菌接种环取细菌（链球菌、大肠埃希菌等）培养物少许。
②按无菌操作法将沾有细菌的接种环在倾斜的接近液面的管壁上轻轻涂抹研匀，试管直立使沾附在管壁上的细菌混人液体即可。
③接种完毕将试管置37℃培养24小时，观察上述细菌在液体培养基中的生长状况。
（2）平板划线接种法：本法要求通过划线将混杂的细菌在平板上分散开来，并在平板上长成菌落，以达到分离培养获得纯培养物的目的。
具体的方法有两种：①平行划线法：左手斜持平板底，右手持接种环。
接种环在火焰上灭菌，冷却后，沾取菌种，先在平板的一端涂开，然后由此开始向下平行密集划线，约占平板的一半。
将平板转180°角，从平板的另一端开始平行密集划线，直至划满平板的剩余部分。
置37℃温箱培养。
②分区划线法：右手将接种环按无菌操作法沾取少许培养物（金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等），左手拿平板略打开，将标本涂于平板表面的一侧边缘，运用腕力连续划线（要密但不要重叠，不要划破培养基），划线范围约占平板面积的1／4。
将平板旋转约90°，接种环经灭菌、冷却后，通过第一次划线区2～3次。
再作同样划线又占平板面积约1／4。
重复上述操作，划完整个平板。
将平板放在37℃温箱内，18～24小时后观察各区细菌生长情况，有无单个菌落，以及菌落的颜色、形态等。
比较金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等的菌落特点。
（3）半固体接种法：左手持半固体培养管，右手持接种针，火焰灭菌冷却后，挑取细菌（大肠埃希菌、痢疾杆菌等），垂直刺入半固体培养基中心，至近管底处，然后循原路退出。
塞上硅胶塞，接种针重新灭菌。
接种完毕，于37℃培养18～24小时，观察细菌生长情况。
比较大肠埃希菌和痢疾杆菌固体培养基中的生长情况。
（三）细菌生长现象（示教）观察金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌及痢疾志贺菌在各种培养基上的生长现象和特点。
1、在液体培养基上生长情况（1）表面生长：液体清晰，细菌生长在液面形成菌膜。
如枯草杆菌。
（2）混浊生长：液体均匀混浊，或有少量沉淀。
如大肠埃希菌。
（3）沉淀生长：液体清晰，细菌生长在管底，形成沉淀。
如链球菌。
2、在固体培养基上的生长情况（1）菌落：将细菌划线接种在固体培养基上，经18~24小时培养，由单个细菌繁殖成的肉眼可见的细菌集团。
观察时要注意菌落的大小、形状、表面性状、边缘是否整齐、透明度、颜色等，可作为鉴别细菌的依据之一。
3、在半固体培养基上的生长情况有鞭毛的细菌，由于能运动，在半固体培养基内沿穿刺线弥漫性长，使穿刺线变的模糊不清，出现试管刷现象。
无鞭毛的细菌，因为不能运动，接种后仍沿穿刺线生长，穿刺线与周围界限清楚。
（四）微生物的分布检测（讲解并指导学生操作）1、空气中细菌的检查（采用沉降法）取无菌普通平板1只，置一处，启盖约15分，再盖上，37℃培养24h，取出观察有无细菌生长。
2、皮肤表面、水中细菌、75%乙醇消毒试验检查（采用涂抹法）在普通培养基上分区后，直接用手指在无菌平板表面轻轻涂按1处，之后用自来水洗手指在平板表面2处轻轻涂按，再用75%乙醇棉球擦拭手指后，手指在平板表面3处轻轻涂按，37℃培养24h后，取出观察有无细菌生长。
3、咽喉部细菌检查用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，37℃培养24h后观察结果。
注意平板上菌落种类及是否溶血。
