载脂蛋白E基因型分型方法研究
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载脂蛋白E基因型的检测及临床意义张艳敏;辛俊;李萱【期刊名称】《心血管康复医学杂志》【年(卷),期】2002(011)002【摘要】目的:探讨载脂蛋白E(ApoE)基因型的检测方法及其临床意义.方法:用人工合成的寡聚核苷酸引物,通过多聚酶链反应(PCR)特异性体外扩增ApoE基因的特异性DNA片段.扩增产物用限制性内切酶Hhal消化,聚丙烯酰胺凝胶电泳后,进行限制性片段长度多态性(RFLP)基因分型.结果:运用PCR-RFLP方法检测了53例健康人和55例冠心病患者的ApoE基因型.两组对象基因型频率E3/2分别为9.4%和3.6%;E3/3为64.2%和60%;E4/3为26.4%和30.9%;E4/4为0和3.6%;等位基因频率E2分别为0.047和0.027;E3为0.820和0.773;E4为0.132和0.200,P 均>0.05,可能与样本小有关.结论:PCR-RFLP法检测ApoEAD基因型简便、准确,有很强的临床应用价值.【总页数】3页(P137-139)【作者】张艳敏;辛俊;李萱【作者单位】新疆自治区人民医院高血压科,乌鲁木齐市,830001;兰州军区乌鲁木齐总院老年病科;新疆医大一附院干部病房【正文语种】中文【中图分类】R446.112【相关文献】1.应用微流控电泳联合检测载脂蛋白C3基因型 [J], 俞娟;卢美红;王惠民;仲人前2.聚合酶链反应/变性高效液相色谱技术检测载脂蛋白E基因型 [J], 黄盛文;向道康;安邦权;李贵芳;罗振元3.载脂蛋白AI与载脂蛋白B100检测在肝炎后肝硬化并发门脉高压患者中的临床意义 [J], 陈树添;林章礼;吴伟聪4.冠心病患者载脂蛋白E基因型及表型的研究与临床意义 [J], 彭健;龚五星;彭澍;王骏;石理;林岫芳5.基因芯片法检测载脂蛋白E(ApoE)基因型试剂性能验证 [J], 金雅琼;张进因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
载脂蛋白E基因分型检测
载脂蛋白E基因分型检测
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基于TaqMan-TAMRA探针技术的ApoE基因快速分型方法研究摘要】目的建立基于TaqMan-TAMRA探针技术的快速、准确的载脂蛋白E(ApoE)基因型检测方法,为临床诊断、治疗和预防ApoE基因相关疾病提供依据。
方法对1049例血液样本提取DNA后,利用TaqMan-TAMRA探针对ApoE基因进行检测和分型,并利用测序法进行验证。
结果 1049例样本中,共检出1048例,ApoE基因的6种基因型(ε3/ε3、ε2/ε3、ε3/ε4、ε2/ε4、ε2/ε2、ε4/ε4)所占比例分别为68.64%、13.54%、14.97%、1.72%、0.76%、0.38%。
TaqMan-TAMRA探针法分型结果与测序结果完全一致。
结论 TaqMan-TAMRA探针法操作简便,分型结果准确度高,是一种适用于临床的ApoE基因快速分型方法。
【关键词】载脂蛋白ETaqMan-TAMRA基因分型测序【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752(2013)35-0132-02Development of a fast genotyping forApoEbased on TaqMan-TAMRAprobes【Abstract】Objective:To establish a method for fast and accurategenotyping ApoE with TaqMan-TAMRA probes and to support the clinical diagnosis、treatment and prevention.Methods:DNA was extracted from 1049 blood samples, then detected and genotyped with TaqMan TAMRA probes. The genotypes were compared with sequencing results. Results: DNA were detected in 1048 out of 1049 samples.Of which, six genotypes of ApoE gene (ε3/ε3, ε2/ε3, ε3/ε4, ε2/ε4, ε2/ε2, ε4/ε4) accounted for 68.64%, 13.54%, 14.97%, 1.72%, 0.76%, 0.38%.TaqMan-TAMRA probe genotypes were consistent with sequencing results. Conclusion:TaqMan-TAMRA is a fast and accurate method for genotyping ApoE.【Key words】 Apolipoprotein E TaqMan-TAMRA genotyping sequencing 载脂蛋白(ApoE)基因位于人的第19号染色体,编码由299个氨基酸组成的ApoE蛋白,该蛋白具有脂蛋白转运、代谢及修复细胞膜等功能[1,2]。
阿尔茨海默病患者载脂蛋白E基因多态性、血脂水平的研究阿尔茨海默病是一种常见的神经系统退行性疾病,主要通过病理学表现为神经原纤维缠结和淀粉样蛋白沉积。
近年来的研究表明,阿尔茨海默病的发病可能与遗传因素有关,其中载脂蛋白E(Apolipoprotein E, APOE)基因的多态性与阿尔茨海默病之间存在关联。
APOE基因编码载脂蛋白E,它是一种脂蛋白,在脂代谢中起着重要的作用。
APOE基因有三种主要等位基因,分别是ε2,ε3和ε4。
据研究发现,APOE ε4等位基因是阿尔茨海默病的一个重要遗传风险因素。
携带APOE ε4等位基因的个体患上阿尔茨海默病的风险要高于其他等位基因的个体。
为了探究APOE基因多态性与阿尔茨海默病的关系,研究人员进行了大量的研究。
其中一项研究包括对大量阿尔茨海默病患者和健康对照组的基因分型分析。
研究结果显示,APOE ε4等位基因的携带率在阿尔茨海默病组中显著高于对照组,这表明APOE ε4等位基因是阿尔茨海默病的一个重要遗传风险因素。
除了APOE基因多态性与阿尔茨海默病的关联,一些研究还发现APOE基因多态性与患者的血脂水平之间也存在一定的关系。
具体而言,携带APOE ε4等位基因的个体在血脂水平上往往表现为高胆固醇、高低密度脂蛋白胆固醇和低高密度脂蛋白胆固醇水平。
这种血脂异常可以增加心血管疾病的风险,进一步加剧了阿尔茨海默病患者的病情。
在APOE基因多态性与阿尔茨海默病患者的研究中,还有一些争论的问题。
一方面,APOE ε4等位基因的携带并不一定导致阿尔茨海默病的发病,因此还需要进一步研究其他的遗传和环境因素的影响。
另一方面,APOE基因多态性与血脂异常之间的关系也存在一定的不确定性,有些研究结果并不一致。
总的来说,APOE基因多态性与阿尔茨海默病之间存在关联,APOE ε4等位基因是阿尔茨海默病的一个重要遗传风险因素。
此外,携带APOE ε4等位基因的个体还可能表现出血脂异常,增加了心血管疾病的风险。
中国人载脂蛋白E基因分型
范纯武;唐凤强;赵锐;吴桂宏
【期刊名称】《中国老年学杂志》
【年(卷),期】2004(024)002
【摘要】载脂蛋白E(APOE)存在于多种脂蛋白颗粒中[1]已证实,在Alzheimer病(AD)的病理学变化如老年斑(SP)、神经原纤维结(NFT)、脑血管淀粉样变性中也都有APOE[1],并且APOE基因型也与AD的发生、发展相关。
为此,本文采用PCR法,对北京地区健康成人进行APOE基因分型,旨在调查该地区人群APOE 基因分型的特点,为AD的防治研究提供资料。
【总页数】1页(P178-178)
【作者】范纯武;唐凤强;赵锐;吴桂宏
【作者单位】电力总医院,北京,100073;电力总医院,北京,100073;电力总医院,北京,100073;电力总医院,北京,100073
【正文语种】中文
【中图分类】Q753
【相关文献】
1.载脂蛋白E基因分型在痴呆诊断中的意义探讨 [J], 王清峰
2.载脂蛋白E基因分型与HCV感染的相关性分析 [J], 王威;马清峰;姚雯;闵晓春
3.脑微出血影像学分类与血浆血管内皮生长因子水平及载脂蛋白E基因分型的关系研究 [J], 白家赫; 于永鹏; 刘丽君; 郑亚利; 李鑫; 谭兰
4.Cog-12量表联合载脂蛋白E基因分型检测对老年人群轻度认知功能障碍的评估
价值 [J], 卢海龙; 周晓兵
5.Cog-12量表联合载脂蛋白E基因分型检测对老年人群轻度认知功能障碍的评估价值 [J], 卢海龙; 周晓兵
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阿尔茨海默病患者载脂蛋白E基因多态性血脂水平的研究阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种常见的老年性神经退行性疾病,其主要病理特征是脑部神经元退化和淀粉样β-蛋白斑块的形成。
近年来研究表明,载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)基因多态性与AD的发病风险密切相关,同时也与血脂水平的变化有关。
APOE基因是编码了APOE蛋白的基因,APOE蛋白在人体中主要参与胆固醇和三酰甘油代谢,对于脂质运输和胆固醇代谢具有重要的生理作用。
APOE基因有三个主要的等位基因,分别是ε2、ε3和ε4,这三个等位基因间的单核苷酸多态性差异主要是由两个位点(C112R和R158C)的单核苷酸转变导致的。
其中,ε4等位基因是AD发病的最重要的遗传因素之一,携带APOE-ε4等位基因的个体具有更高的AD发病风险。
研究发现,携带APOE-ε4等位基因的AD患者的血脂水平相对较高。
APOE-ε4与高胆固醇和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)水平之间存在密切的关联。
实验证实,APOE-ε4携带者的血浆中LDL水平高于APOE-ε2和APOE-ε3携带者。
高胆固醇水平可能增加了LDL与细胞壁中淀粉样β-蛋白的结合,促进了斑块的形成。
此外,APOE-ε4携带者还表现出较低的高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)水平,这可能与APOE-ε4基因的脂代谢相关基因表达的改变有关。
此外,APOE基因多态性还与其它代谢相关的异常有关。
研究发现,APOE基因与肥胖、糖尿病等代谢性疾病之间存在关联。
APOE-ε4携带者的身体质量指数(body mass index,BMI)和腰臀比(waist-to-hip ratio,WHR)较高,而APOE-ε2携带者的BMI和WHR较低。
这些代谢异常与AD的发病机制有关,进一步证实了APOE基因在AD发病过程中的作用。
载脂蛋白E载脂蛋白E载脂蛋白E结构示意图载脂蛋白E是一种富含精氨酸的碱性蛋白,人ApoE是由299个氨基酸残基组成,分子量为34145D,含32个Arg和12个Lys存在于血浆的CM、VLDL及其残粒和β-VLDL中均含有ApoE,一部分ApoE在血液中与ApoAⅡ形成复合体。
Shore于1973年首先发现ApoE,Rall等于1982年测出ApoE 的蛋白质一级结构,其后Taylor建立ApoE的cDNA序列,Breslow 和Zannis首先测出ApoE有3个等位基因异构体以及基因在染色体上的定位。
据推算和测定,在介质中ApoE有62%的α-螺旋,9%的β-片层,11%的β-转角和18%无规则线团。
ApoE分子可以被凝血酶水解为二个区域,N-端区(1~191)为22kD的可溶性球蛋白,此区域较稳定,该片段的136~158位肽段为受体结合位点,富含碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸),也属于肝素结合区。
此片段为一个反平行的四螺旋束,是α-螺旋蛋白的一般折叠方式。
C端区(216~299)分子量为10kD,螺旋程度很高,不稳定,是与脂蛋白的结合区。
用截去了末端的变异体及合成多肽片段进行ApoE羧基末端的检测表明,191残基以外羧基端存在三个螺旋,其中两个为A型(203~223和225~266),第三个(268~289)为一种G型螺旋。
与脂类或不同的脂质微粒或二甲基磷脂酰胆碱结合的结果说明,G螺旋和第二螺旋的末端在脂质连结,在ApoE的四聚体化过程中起重要的作用。
更精确地说是263~286片段可能在脂连结ApoE与VLDL的结合中起有关键作用。
ApoE主要由肝脏合成,近年来发现脑,肾,骨骼,肾上腺及巨噬细胞也能合成。
载脂蛋白E生理功能ApoE生理功能有:①是LDL受体的配体,也是肝细胞CM残粒受体的配体,它与脂蛋白代谢有密切相关性;②ApoE具有多态性,多态性是决定个体血脂水平与动脉粥样硬化发生发展密切相关;③参与激活水解脂肪的酶类,参与免疫调节及神经组织的再生。
琼脂糖凝胶PCR-RFLP对载脂蛋白E基因分型方法初探吴晓兰;尹世达;龙建秋;杨书福;何秋忠;蒋凌波;王群【期刊名称】《海军医学杂志》【年(卷),期】1997(000)002【摘要】目的:从基因水平对apoE基因常见6种基因型(E2/2、E3/3、E4/4、E2/3、E3/4、E2/4)进行分型。
方法:用PCR-RFLP、高浓度4%琼脂糖凝胶(Sigma)对PCR扩增片段HhaI限制性内切酶酶切产物电泳分型。
结果:E3/3有91bp、48bp、38bp和35bp;E2/4有91bp、83bp、72bp、48bp、35bp;E2/3有91bp、83bp、48bp、38bp、35bp;E3/4有91bp、72bp、48bp、38bp、35bp。
结论:琼脂糖凝胶PCR-RFLP法分辨率高、结果可靠、操作简便,为apoE遗传多态与临床代谢紊乱疾病关系提供一种有效的检测方法。
【总页数】3页(P146-148)【作者】吴晓兰;尹世达;龙建秋;杨书福;何秋忠;蒋凌波;王群【作者单位】海军医学研究所;解放军第四一一医院;海军医学研究所;解放军第四一六医院【正文语种】中文【中图分类】R【相关文献】1.刚地弓形虫非洲分离株的PCR-RFLP和微卫星基因分型研究进展 [J], Faustina PAPPOE;王林;Dorcas OBIRI-YEBOAH;陈鹤;程维晟;王晓玮;刘芳;罗庆礼;沈继龙2.MDA在PCR-RFLP基因分型中的实用性 [J], 贾彦彬;张建祖;高静3.应用PCR-RFLP方法进行载脂蛋白E基因分型的研究 [J], 李芳芳4.应用PCR-RFLP技术进行ABO基因分型研究 [J], 周代锋;蔡望伟;王政;蒙晶;王小英5.Nest-PCR和PCR-RFLP在恶性疟原虫地理株基因分型及多态性研究中的应用[J], 张青锋;胡晶莹;杨月欣;潘卫庆因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
冠心病患者载脂蛋白E基因型及表型的研究与临床意义彭健;龚五星;彭澍;王骏;石理;林岫芳【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】1999(15)9【摘要】目的:探讨在冠心病(CHD)发生发展中载脂蛋白E(apoE)基因多态性的作用及其对血脂水平的影响.方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法,测定210例CHD患者和172例正常对照者的apoE基因型.应用SPSS统计软件包分析该基因对两组受试者的血脂、脂蛋白和载脂蛋白AI(apoAI)、载脂蛋白B100(apoB100)的影响及其与CHD的临床相关关系.结果:CHD组apoE4/3基因型和ε4等位基因频率均显著高于对照组(P<0.01);CHD组总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著高于对照组(P<0.01);在CHD组的apoE各亚型之间,TC和LDL-C水平之间存在统计学差异(P<0.05).结论:apoE基因多态性对血脂、脂蛋白水平有明显作用,ε4等位基因携带者CHD发病的危险性显著增加.【总页数】3页(P695-697)【作者】彭健;龚五星;彭澍;王骏;石理;林岫芳【作者单位】暨南大学医学院第三附属医院,519000;暨南大学医学院第三附属医院,519000;暨南大学医学院第三附属医院,519000;暨南大学医学院第三附属医院,519000;暨南大学医学院第三附属医院,519000;暨南大学医学院第三附属医院,519000【正文语种】中文【中图分类】R5【相关文献】1.载脂蛋白E基因型的检测及临床意义 [J], 张艳敏;辛俊;李萱2.重庆地区人群 CYP2C19基因型表型多态性分析及检测的临床意义 [J], 邓济甦;唐翌姝;毕小云3.优化的热启动PCR—限制性酶切法检测冠心病患者载脂蛋白E基因型 [J], 彭澍;龚五星;王骏;彭健;石理;林岫芳4.冠心病患者载脂蛋白E、血管紧张素转换酶联合基因型研究 [J], 李红梅;潘闽;梁舒;王惠民;崔之础;朱健华5.早发冠心病患者颈总动脉内膜—中层厚度与载脂蛋白E基因型的关系 [J], 陈忠;黄峻;朱铁兵;杨志健;马根山;王连生;曹克将因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
载脂蛋白E基因的PCR快速分型法的建立
张婷;陈盛强;陈柏铭
【期刊名称】《中华生物医学工程杂志》
【年(卷),期】2000(006)002
【摘要】目的建立载脂蛋白E基因的PCR快速分型法.方法采用以PCR扩增为核心的载脂蛋白E(apoE)基因型分析方法,扩增其中含有112位和158位两个氨基酸位点之间的编码序列,产物为267bp apoE基因经扩增后,扩增产物经HhaI 内切酶消化后,然后进行5%琼脂糖凝胶电泳检测,快速鉴定apoE的基因型.结果本法检测了85名健康人apoE 基因型,求出三个等位基因E2、E3、E4的频率分别为
0.0824、0.8412、0.0764.结论该方法简单、准确,适合于一般实验室开展.
【总页数】1页(P39-39)
【作者】张婷;陈盛强;陈柏铭
【作者单位】广州医学院检验系,广州,510182;广州医学院检验系,广州,510182;广州医学院检验系,广州,510182
【正文语种】中文
【中图分类】Q503
【相关文献】
1.鉴定载脂蛋白M基因敲除小鼠的实时荧光定量PCR法的建立 [J], 于洋;郑璐;梁云;潘丽莉;张俊;魏江;喻妙梅;罗光华
2.PCR—SSP快速HLA—DR基因分型法的建立及临床初步应用 [J], 王晓波;陈规
划
3.HLA—DR快速基因分型PCR—SSP方法的建立 [J], 曹孟德;秦东春
4.建立一种实时荧光PCR对维生素D受体基因单核苷酸多态性快速分型 [J], 李胜涛;陈磊;徐玉娟;曹红;周丹旎;彭小友
5.希特林蛋白缺乏症实时荧光PCR解链曲线快速基因分型的建立与应用 [J], 刘海平;秦佳纯;袁伟曦;黄伟伦;周万军
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老年人载脂蛋白E基因型与认知功能关系的研究黄文;朱佩芳;王正国;陈曼娥;周华东;张映琦【期刊名称】《中华行为医学与脑科学杂志》【年(卷),期】2002(011)006【摘要】目的研究老年人中载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因型的分布情况,分析Apo E基因型与认知功能的关系.方法用简易智能量表(Mini-Mental State Examination,MMSE)对316例60岁以上老龄人进行认知功能检查,根据MMSE得分将研究对象分为认知功能正常组和认知功能障碍组,分离其白血细胞基因组DNA,用聚合酶链反应(ploymerase chain reaction,PCR)技术扩增ApoE带有多态性位点的第四外显子片段,根据限制性酶切片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法检测其基因型.结果两组人群中ApoEε3/3基因型分布的百分比最大,其次为Apo Eε3/4基因型,而Apo Eε2/2基因型最小;ε2、ε3、ε4等位基因频率在认知功能障碍组和认知功能正常组分别为:0.095、0.560、0.345;0.146、0.699、0.155.认知功能障碍组ε4携带者百分比大于对照组(P<0.01),Apo Eε3/4基因型百分比也较认知功能正常组大(P<0.01).结论老年人群中,Apo Eε3/3为最常见的基因型,而ε2/2最少见;Apo Eε4为老年人认知功能障碍发病的危险因子.【总页数】4页(P614-617)【作者】黄文;朱佩芳;王正国;陈曼娥;周华东;张映琦【作者单位】第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所神经内科,重庆,400042;第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所四室,重庆,400042;第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所四室,重庆,400042;第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所神经内科,重庆,400042;第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所神经内科,重庆,400042;第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所神经内科,重庆,400042【正文语种】中文【中图分类】R749.1+6【相关文献】1.常州老年人载脂蛋白E基因型与胆囊结石病的相关性研究 [J], 崔文贤;陈桂金2.118例老年人的认知功能改变与载脂蛋白E基因型的关系 [J], 李亚健;李文贤3.载脂蛋白E基因型在老年人群中的分布及与老年认知损伤的关系 [J], 殷淑琴;聂宏伟;徐勇4.血清载脂蛋白水平与老年人认知功能障碍的关系 [J], 黄文;谢鹏;朱丹;陈晓5.重庆市某区316例老年人中载脂蛋白E基因型频率分布及与痴呆发病的关系 [J], 黄文;陈曼娥;周华东;张映琦因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
载脂蛋白E 基因型分型方法研究钱士匀 覃 西 王丹妹(海南医学院附属医院检验科) 海口 570102 摘要 目的:为调查海南省老年性痴呆患者载脂蛋白E (Apo E )基因频率,建立一种简便、快速、准确的人载脂蛋白E 基因型检测方法。
方法:应用碘化钠法提取模板DNA ,聚合酶链反应(PCR )特异性扩增Apo E 基因含112位和158位氨基酸的基因序列,扩增产物用限制内切酶Hha I 酶切,聚丙烯酰胺凝胶电泳后,观察酶切位点的限制性片段长度多态性(RFIP)图谱。
结果:碘化钠法提取模板DNA 与经典法无差异;运用PCR -RFIP 法检测30名健康人Apo E 基因型,实验成功。
结论:该方法简单、快速、准确,适合于一般实验室开展Apo E 基因型调查。
关键词 载脂蛋白E 类;聚合酶链反应;限制性片段长度多态性;基因型分类号 Q 783.1METHODOLOGY FOR APOLIPOPROTEIN E GENOTYPINGQian Shiyun,Qin Xi,Wang Danmei(T he Centr al La bo rat or y,Affiliated Ho spital o f Hainan M edical co llege ) Haikou 570102 ABSTRAC T Objectiv e :T o establish a simple ,im mediate and accurate m ethod fo r apolipoprotein E (Apo E )g enoty ping in patients w ith Alzheim er 's dem entia in Hainan Pro vince .M ethod :The tem-plate DNA w as collected with the NaI method.Apo E gene sequences containing amino acid positions 112and 158w ere amplified for electr ophor esis on poly acrylam ide gels by polym erase chain r eaction (PCR ).The patter ns of restriction fragm ent leng th poly morphism o f Apo E gene w ere distinguished .Results:T he NaI m ethod show ed no difference as com pared w ith the classical metho d for collecting tem plate DNA.T hus,Apo E g enoty ping by PCRRfip w as carried o ut w ith success in 30healthy indi-viduals .Conclusion :T he metho d is considered to be sim ple ,imm ediate ,and accur ate fo r Apo E g eno-ty ping in ordinary labo rato ries .Key words Apo lipoprotein E;PCR;restriction fragm ent length po lymo rphism ;genotype 载脂蛋白E (Apo E )是一种富含精氨酸的碱性蛋白质,Apo E 在脂类代谢中起着重要的作用,Uterman [1]等1975年首先报道了Apo E 存在的3种异构体,即E 2,E 3,E 4,3种异构体分别由3个共显性等位基因E 2、E 3、E4所决定,3种常见的等位基因可产生6种不同的基因型:E 2/2、E 3/2、E 4/3、E3/3、E 4/3及E 4/4。
近年来研究发现Apo E 等位基因与冠心病、动脉粥样硬化、迟发性家族性Alzheimer 病及脂质代谢紊乱密切相关,Apo E 多态性的研究目前是医学热门研究项目,Apo E 表型和基因型的研究方法众多[2~4],本文采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,测定Apo E 基因型,为调查分析人群Apo E 基因型及等位基因频率分布提供一种快速、简便、准确的检测手段。
1 材料与方法1.1 对象健康成人30例,经体检,无心血管及脂代谢有106海南医学院学报 1999,5(3):97~101Journal of H ainan M edical Colleg e5卷关疾病,男性21名,女性9名,年龄42~61岁,平均年龄49.6岁。
1.2 试剂TaqDNA 聚合酶,dNTPs,DNA 片段长度标准物,Hha Ⅰ酶均由湖北维科公司提供的MBI 产品,其余试剂均为分析纯。
其引物序列为:P 1:5’-AACAACT GACCCCGGT GGCG -3’;P 2:5’-AT GGCGCTGAGGCCGCGCTC-3’;特异性扩增Apo E 基因第4外显子区含编码112位与158位氨基酸的基因序列,产物片段为292bp 。
1.3 模板DNA 提取取全血100L l 加无菌双蒸水100L l 混匀,加6mol/L NaI 200L l 涡旋震荡30s,加等体积氯仿/异戊醇(24∶1),涡旋震荡30s,离心后取上清加0.6体积异丙醇混匀,室温静置15min ,离心后沉淀以37%异丙醇洗1次,晾干后溶于TE (T ris 1mol/L,EDT A 0.1M ol/L,pH 7.6)液中,提取的DNA 经紫外分光光度计定量后,置-20℃保存备用。
1.4 PCR 扩增0.5m l 扩增管内加入扩增缓冲液;dNTPs,引物P 1、P 2及模板DNA 。
置热循环仪(PE 480型,Perkin-Elmer cetus)中的95℃预变性12m in 后,再加入T aqDNA 聚合酶2U 。
然后按下列程序循环35次,即94℃变性1m in ,65℃退火1m in ,72℃延伸1.5min ,最后于72℃再延伸10min 。
取产物10L l 经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶(EB)染色,以DNA Markers 为标准参考物,紫外灯下观察扩增结果,无非特异性条带出现。
1.5 PCR 产物的限制性酶切吸取扩增物于另1试管,加入Hha I 酶1L l (10U /L l ),充分混匀,置扩增仪内,37℃4h ,反应终止后,酶切产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,EB 染色35min,以DN A M arkers 为标准参考物,紫外灯下观察结果。
2 结 果Apo E DNA 经PCR 扩增后,其产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察292bp 处有一明显的条带,与标准DNA M ar kers 比较,无非特异性区带出现。
扩增产物经限制性酶切后,于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出Apo E 基因型的片段,见图1。
7为PCR 产物(292bp ),M 为M ar kers ,1-6分别为基因型图1 A po E 基因扩增产物HhaI 酶切后图谱 Apo E 基因型判定参照Richar d [5]方法,E 2/E 2为91、83、38bp 3条区带;E 3/E 3为91、48、38bp 3条区带;E 4/E 4为72、48、38bp;E 2/E 3为91、83、48、38bp 4条区带;E 2/E 4为91、83、72、48、38bp 5条区带;E 3/E 4为91、72、48、38bp 4条区带,30份血样中仅检出1例E 2/E 2基因型,共检出6种基因型。
3 讨 论Apo E 结构基因位点存在多态性,其多态性的分子基础是112位点上半胱氨酸T GC (Cys)和158位点上的精氨酸CGC (Arg )互换,其DNA 序列分别为T GC 和CGC ,本试验用特异性的引物进行扩增,包含上述2位点DNA 序列,扩增产物为292度bp,产物进一步用Hha I 酶切,因Hha I 酶可特异性识别GCGC 序列,故可识别A rg 位点DNA 序列,而不能识别Cys 位点DNA 序列,由于扩增产物GCGC -GT GC 2位点的差异,酶切后可产生不同的限制性片段长度多态性E 2、E 3、E 4,并由此产生6种不同的基因型,早期Apo E 基因型分析方法有超速离心法、IEF 法、I-GBlot 法、IEF-PAGE 法等,但由于上述方法均存在有操作复杂、费时费力且成本过高或结果不稳定等问题,较难在普通实验室开展,本文参照国内外文献[6~8]在普通实验室内运用PCR-RFLP 方法,特异性扩增Apo E 结构基因第4外显子区域含编码112位点和158位点,氨基酸的基因序列,扩增产物用HhaI 酶切,酶切产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,即可观察不同107 3期钱士匀等.载脂蛋白E 基因型分型方法研究基因酶谱,30例血样检出图谱与文献报道相符。
该方法检测Apo E 基因型的重要环节之一,是模板DNA 的制备,通常实验室均选择经典法提取模板DNA ,但经典法操作复杂且饱和酚的制备与保存均较困难,给实验室工作带来一定难度,本文所使用的碘化钠法试剂易得,操作简单无需特殊设备,与经典法比较,模板提取时间大大缩短,且与经典法一致,易于在普通实验室使用。
本方法的建立对研究人群Apo E 基因及基因型在脂类代谢中的作用及与各类疾病的关系提供了一个简便、快速、准确的基因型分析方法。
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