第三节 基因及基因表达的定量及定性分析

转录组和代谢组转录组和代谢组是生物学中常用的两个重要概念，它们在研究生物体内基因表达和代谢物变化方面发挥着重要作用。

下面将分别介绍转录组和代谢组的相关内容。

一、转录组转录组是指在特定条件下，生物体内全部或某一部分基因被转录成mRNA的总和。

转录组研究的主要内容包括基因表达的定量和定性分析、基因功能的预测、转录调控机制的研究等。

1. 基因表达的定量和定性分析转录组研究可以通过高通量测序技术，如RNA-seq，对某一细胞或组织内的所有mRNA进行测序和分析。

通过对比分析转录组数据可以定量和定性地研究基因表达在不同时间、空间和条件下的变化，从而发现调控基因表达的关键因子。

2. 基因功能的预测转录组数据的分析可以通过比对已知基因组数据库，对新基因进行注释和功能预测。

通过对基因表达模式的分析，可以找到与特定生物过程相关的基因集合，进一步解析基因功能和相关生物学过程。

3. 转录调控机制的研究转录组研究可以揭示基因调控网络的结构和功能。

通过对转录组数据的分析，可以找到可能参与基因调控的转录因子和其结合位点。

进一步研究这些调控因子和位点的功能和相互关系，可以深入理解基因调控的机制。

二、代谢组代谢组是指在特定条件下，生物体内所有代谢物的总和，即包括小分子有机物、离子和小分子代谢产物等。

代谢组研究的主要内容包括代谢通路的发现与分析、代谢物定性与定量分析、代谢调控机制的研究等。

1. 代谢通路的发现与分析代谢组研究可以通过质谱技术、核磁共振技术等对生物体内的代谢物进行检测和分析。

通过对代谢物的测定和比较，可以发现新的代谢通路和代谢物之间的相互关系，揭示代谢网络的结构和功能。

2. 代谢物定性与定量分析代谢组研究对于了解生物体内代谢物的种类和含量具有重要意义。

通过质谱技术等定性和定量分析方法，可以鉴定代谢物的结构和测定其浓度，进而研究不同条件下代谢物的变化以及代谢通路的调控机制。

3. 代谢调控机制的研究代谢组研究可以揭示代谢调控的机制和关键因子。

生物信息学中的基因表达谱分析基因表达谱是指在不同时间、不同环境或不同组织中，基因转录和翻译产生的RNA和蛋白质的数量和种类的一种定量和定性描述。

基因表达谱分析是研究生物学中基因表达的重要手段，可以帮助科学家研究基因功能、诊断疾病和开发新药。

生物信息学的发展为基因表达谱分析提供了许多新的方法和工具，让科学家能够更加快速、高效地分析和利用基因表达谱数据。

1. 基因表达谱分析的类型基因表达谱分析可以分为两种类型，即定性分析和定量分析。

定性分析主要依赖于基因表达谱的图形化展示和样本的聚类分析。

图形化展示可以帮助科学家快速地查看基因表达的变化趋势，如差异基因的表达，而聚类分析则可以将不同样本中的基因表达谱分为几类，有助于发现它们之间的相似性。

定量分析可以测量基因表达水平的数量，此类分析方法包括将基因表达谱数据和生物样本的方法学特征进行归一化，以便进行生物信息学方法的比较分析。

这些方法包括微阵列、RNA测序和蛋白质组学等技术，这些技术都可以更加准确地测量基因表达量，并能够比较不同样本之间的差异。

2. 基因表达谱分析的步骤基因表达谱分析需要经过多个步骤，通常包括数据预处理、探测器注释、归一化处理、差异基因筛选和生物功能的验证等步骤。

数据预处理涉及去除噪声、正规化和探针的标准化。

在预处理时，我们可以使用质控图来确保数据质量，同时，使用探测器注释，即对基因定位信息的注释，可以保证数据的准确性。

归一化处理用于保证基因表达量在样本之间具有可比性。

差异基因的筛选旨在发现基因表达谱中存在的显着差异，我们可以使用t-test、方差分析（ANOVA）和Pearson相关系数等统计方法来确定这些基因。

生物功能的验证是确定差异基因的生物作用和分子机制，以及它们在生物学过程中的重要性。

3. 基因表达谱分析的应用基因表达谱分析可以应用在许多领域，包括医学、农业、环境和食品安全等方面。

在医学领域中，基因表达谱分析可以用于研究基因在癌症和其他疾病中的功能，以及开发新的药物。

基因表达的测量和分析随着人类基因组的测序技术的不断完善，我们已经能够获取每个个体的基因信息。

然而，真正影响生物个体的并不是基因本身，而是基因表达。

基因表达是指基因通过蛋白质转录的方式表现出来的生物特征。

通过测量基因表达水平，我们可以深入了解生物个体的生存状态，生长、分化、细胞增殖、蓄积、代谢等等生命过程中的各个环节。

基因表达的测量是通过转录组技术来实现的，这类技术首先需要提取样品中的RNA，然后通过RNA测序来获取转录组信息。

基因表达水平的测量可以在两个水平进行，一个是转录水平，另一个是蛋白质水平。

转录水平的测量可以通过 RNA-seq技术、microarray或者qPCR等技术实现，而蛋白质水平的测量则可以采用质谱技术或其他蛋白质测量技术。

RNaseq技术是一种快速、高灵敏度的方法，可以检测到全基因组的所有转录本，并且有高水平的准确性和可靠性。

Microarray技术则可以将全部的转录本与DNA探针结合，然后通过荧光标记检测信号强度来测量不同基因转录本的表达水平。

而qPCR技术则是一种单基因转录本检测技术，可以对单个基因分子进行量化测量。

基因表达的分析，一般可以分为两种类型：差异表达和聚类分析。

通过差异表达分析，我们可以比较两组不同样品（如正常人和病人），以分析出哪些基因在这两组样品中是不同的。

而聚类分析则可以将每个样品根据基因表达的相似性进行聚类。

差异表达分析可以帮助我们寻找在不同生理状态或病理状态下的关键调控因子。

例如，在与某种病毒感染的细胞样本和健康的细胞样本中测量基因表达，可以发现哪些基因与病毒感染有关，这可以用于预测病毒感染的机制，为新药物研发和基础医学研究提供支持。

聚类分析则可以将我们的样品分为不同的类别，这些类别的基础是根据某些确定的维度而形成的。

例如，根据转录本的表达水平，我们可以将一大组的放线菌进行有意义的聚类，然后对于每组放线菌，我们可以检测在不同条件下它们生长的速度和产生多少有效化合物等多个方面的表现进行分析，从而预测可能更好的生产条件并最大化产量，同时保证化合物的表现和纯度。

基因表达定量原理
基因表达定量是一种用于确定特定基因在细胞中的表达水平的方法。

该方法可以帮助研究人员了解基因在不同组织、发育阶段以及疾病状态下的表达程度。

在基因表达定量中，首先需要收集细胞或组织样本，并提取其中的RNA。

然后，利用逆转录酶反转录RNA为cDNA，以便
后续的定量分析。

接下来，通过定量PCR技术测量目标基因
在cDNA中的拷贝数目。

定量PCR通常使用荧光探针或
SYBR Green等荧光染料来检测PCR扩增的过程中的目标基因
拷贝数目。

为了准确测量基因表达量，必须选择一个合适的内参基因（也称为参考基因或内部控制基因），以作为基准来标准化实验结果。

内参基因应具有稳定的表达水平，并且在不同样本之间不发生变化。

常用的内参基因包括β-actin、GAPDH和18S
rRNA等。

在定量PCR反应中，需要设立标准曲线来确定目标基因的拷
贝数。

标准曲线通常由一系列已知浓度的DNA标准样品构建
而成。

将标准样品的Ct值与其对应的DNA浓度绘制成曲线，可以通过测量实验样品的Ct值与标准曲线的交叉点来确定目
标基因的拷贝数。

最后，通过比较不同样本中目标基因的表达水平，可以了解不同条件下的基因调控情况。

例如，研究人员可以比较疾病组织和正常组织中某个基因的表达差异，以便探索该基因在疾病发
生发展过程中的作用。

总之，基因表达定量是一种重要的实验手段，可以帮助研究人员了解基因的表达调控机制，从而深入研究生物学过程和相关疾病。

第十二章分子生物学常用技术及应用【授课时间】3学时【目的要求】1．掌握基因工程与重组DNA技术相关概念，核酸分子杂交、探针、PCR、DNA 芯片技术、基因诊断和基因治疗的概念。

2．熟悉重组DNA技术、PCR的基本原理及基本反应步骤。

3．了解基因工程在医学中的应用，PCR 的主要用途。

4．了解DNA芯片技术的原理与方法，基因诊断与基因治疗的应用。

【教学内容】1．一般介绍：基因工程2．一般介绍：核酸分子杂交技术3．一般介绍：聚合酶链反应4．一般介绍：DNA芯片技术5．一般介绍：基因诊断与基因治疗【授课学时】3学时第十二章分子生物学常用技术及应用第一节基因工程第二节核酸分子杂交技术第三节聚合酶链反应第四节 DNA芯片技术第五节基因诊断与基因治疗第一节基因工程噬菌体(bacteriophage，phage)是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，所以称为噬菌体。

用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。

（一）目的基因的制备目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是需要克隆或．基因组DNA文库cDNA文库．聚合酶链式反应（polymerase chain reaction．化学合成（二）目的基因与载体的连接将目的基因或序列插入载体，主要通过DNA（二）Northern 印迹杂交Northern 印迹杂交是指将待测RNA 样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交，检测的方法。

其基本原理和基本过程与印迹杂交主要用于检测各种基因转录产物的大小、转录的量及其变化。

（三）斑点及狭缝印迹杂交分子杂交实验①②③目录三、探针的标记（一）探针的特征探针的特点：①要加以标记、带有示踪物，便于杂交后检测，②应是单链，若为双链用前需先行变性为单链；③具有高度特异性，只与靶核酸序列杂交；④标记的探针应具有高灵敏度、稳定、标记方法简便、安全。

（二）探针的种类及制备探针第四节 DNA芯片技术第五节基因诊断与基因治疗。

基因表达调控的实验方法与分析基因表达调控是指在生物体内，通过多种方式来调节基因的表达。

这种调控非常重要，因为它直接影响着细胞的功能和性质，进而影响整个生物的发育、生长和适应环境的能力。

因此，研究基因表达调控的实验方法和分析工具也变得越来越重要。

本文将介绍一些常用的实验方法和分析工具，以及它们的原理和应用。

一、mRNA定量PCRmRNA定量PCR是目前基因表达调控研究中最常用的实验方法之一。

它基于聚合酶链式反应（PCR）的原理，利用反转录酶将mRNA反转录为cDNA，然后使用PCR扩增cDNA，并通过荧光信号分析来定量目标mRNA的表达水平。

在进行mRNA定量PCR前，需要确定一个内部参照基因，作为样品中基因表达水平的标准。

一般来说，这个参照基因应具有稳定的表达量，不受实验条件的影响。

目前常用的参照基因包括GAPDH、β-actin和18S rRNA等。

利用mRNA定量PCR可以快速准确地测定目标基因在样品中的表达水平，以及在不同条件下的变化趋势。

二、RNA测序技术随着高通量测序技术的发展，RNA测序已经成为全面研究基因表达调控的有力工具。

RNA测序可以同时检测几千个基因的表达情况，从而获得巨大的数据量。

RNA测序的过程大致分为以下几个步骤：1）RNA提取；2）RNA碎片化和反转录；3）建立文库和测序；4）基因表达水平分析。

在数据分析方面，最常用的是检测差异基因的表达水平。

这通常涉及数据标准化、筛选差异基因和进行生物学注释等步骤。

三、RNAi技术RNA干扰（RNAi）是一种特殊的基因调控技术。

它通过特定的RNA序列或质粒（siRNA或shRNA）靶向靶基因的mRNA，并将其特异性地降解。

这种技术可以用于研究基因功能以及疾病的发生机制等方面。

RNAi的实验步骤包括：1）设计和合成siRNA或shRNA；2）细胞转染或注射RNAi；3）检测基因表达水平的变化。

在实验过程中，需要确定RNAi的效率和特异性，以及是否对其他相关基因表达造成影响。

基因组学中的表达定量分析基因组学是指研究基因组结构、功能和变异的学科，是生命科学里面的一个新兴领域。

随着生物技术的不断发展，基因组学在医学、农业、环境保护等领域都得到了广泛的应用。

其中，基因表达定量分析是基因组学研究的重要方向之一。

1. 基因表达定量分析的定义基因表达是指一个细胞或组织内发生的所有基因产物（RNA或蛋白质）的总和。

基因表达分析是对细胞的基因组进行测量和研究的过程。

基因表达定量分析是对基因表达量进行定量研究的过程。

通过这种分析，可以获得不同基因在不同组织或不同发育阶段的表达水平，并找出相关的调控机制和信号通路，为疾病诊断、治疗和预防提供有力支持。

2. 基因表达定量分析的方法目前，基因表达定量分析主要有三种方法：RT-PCR、DNA芯片和RNA测序。

其中，RT-PCR是金标准方法，是最常用的方法之一。

RT-PCR法可以用来精确地测量同一个样本中不同基因的表达量，或者在不同样本中同一个基因的表达量。

这种方法的优点是精度高、灵敏度高，可以检测极低浓度的RNA。

但是，RT-PCR法只能同时测量少量的基因，且需要先知道要检测的基因序列。

DNA芯片是通过将一系列的探针固定在玻璃或硅片上制成芯片，然后用荧光检测不同样本中RNA的含量。

DNA芯片可以同时检测成千上万个基因的表达量，但是精度和灵敏度相对较低。

此外，DNA芯片还需要事先知道要检测的基因序列，并且芯片的制备比较复杂，成本也比较高。

RNA测序方法则使用高通量测序技术。

通过测量RNA序列的数量来确定不同基因的表达量。

相比其他方法，RNA测序具有高通量、精度高、无偏性等优点，可以同时检测成千上万个基因，并且不需要已知基因序列。

但是成本较高，并且需要大量数据分析。

3. 基因表达定量分析在疾病研究中的应用基因表达定量分析在疾病研究中有广泛的应用。

例如，在癌症研究中，通过基因表达定量分析可以确定哪些基因与癌症的发生和发展密切相关，并且可以发现新的药物靶点。

1．GUS报告基因的定性检测GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。

GUS染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。

1.1 GUS染色底物的配制按下表1配制GUS染色的底物。

表1. GUS染色底物的配制GUS 能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。

MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。

因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。

2.1 试剂配制1) 1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。

2) 1mol/L NaH2PO4 溶液：15.601g NaH2PO4 溶于100ml水。

3) 0.1M 磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。

4) 10％ SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。

5) 0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。

6) GUS酶提取液：0.1M 磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml； 0.5MEDTA(PH8.0)取2ml；Triton X-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。

7) MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。

分子生物学知识：基因表达的定量分析和单细胞转录组学研究基因表达的定量分析和单细胞转录组学研究随着分子生物学和生物信息学的快速发展，我们对基因表达的了解越来越深入。

在过去，我们主要通过基因表达谱的研究来了解某种生物在特定条件下的基因表达情况。

但是，基因表达谱只能提供总体的信息，并不能反映单个细胞的表达情况。

而随着单细胞转录组学的出现，我们可以更好地研究单个细胞的基因表达情况。

本文主要介绍基因表达的定量分析和单细胞转录组学研究。

基因表达的定量分析在不同生物学过程中，基因表达量的定量分析是非常重要的。

基因表达数据可以分为两类：定性数据和定量数据。

定性数据表明该基因是否表达，而定量数据则给出基因表达的数量。

定量数据可以帮助我们比较不同生物或不同样本之间的基因表达差异，以及分析在不同物种和组织中的基因表达模式。

基因表达的定量分析通常需要使用PCR、Northern blot、Western blot、RNA-seq、microarray等技术来获得。

PCR技术PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）用于分离和扩增目标DNA序列。

PCR可以识别和定量基因表达，因此在基因表达的定量分析中起着至关重要的作用。

PCR技术的一个优势是它可以分析从微量RNA中提取的RNA分子，这在用较旧的技术进行分析时是困难的。

PCR的量化分析主要是通过Real-time PCR实现，通过定量PCR图谱来测量RNA分子的数量。

RNA-seq和microarray技术RNA-seq技术已经普遍应用于一些研究领域，包括它们在基因表达定量分析中的应用。

RNA-seq技术是一种基于高通量测序的方法，它通过转录本整体研究基因表达，即一次RNA-seq测序可以获得一个细胞或样品的整个转录本。

它不仅可以定量表达基因，还可以检测单个剪接变异、基因差异、SNPs和新的转录本。

Microarray技术通过研究整个基因组来推断出基因表达，并且是许多基因表达研究的经典方法。

第二篇细胞的遗传物质第三章基因表达的分析技术生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。

对基因结构与基因表达调控进行研究，是揭示生命本质的必经之路。

在基因组研究的过程中，逐步建立起一系列行之有效的技术。

针对不同的研究内容，可建立不同的研究路线。

第一节 PCR技术聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是一种体外核酸扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。

PCR技术日斟完善，成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。

应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。

扩增的片段可以直接通过电泳观察，并作进一步的分析。

一、实验原理PCR是根据DNA变性复性的原理，通过特异性引物，完成特异片段扩增。

第一，按照欲检测的DNA的5＇和3＇端的碱基顺序各合成一段长约18～24个碱基的寡核苷酸序列作为引物（primer）。

引物设计需要根据以下原则：①引物的长度保持在18～24bp之间，引物过短将影响产物的特异性，而引物过长将影响产物的合成效率；②GC含量应保持在45～60%之间；③5＇和3＇端的引物间不能形成互补。

第二，将待检测的DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。

通过95℃变性，在进入较低的温度使引物与待扩增的DNA链复性结合，然后在聚合酶的作用下，体系中的脱氧核苷酸与模板DNA 链互补配对，不断延伸合成新互补链，最终使一条DNA双链合成为两条双链。

通过变性（92～95℃）→复性（40～60℃）→引物延伸（65～72℃）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段。

理论上循环20周期可使DNA扩增100余万倍。

二、PCR技术的分类及其应用范围1．逆转录PCR 逆转录PCR（RT-PCR）是将RNA反转录和PCR结合而建立起来的一种PCR技术。

其包括两个过程：通过逆转录合成cDNA和对之进行PCR扩增。