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病毒蛋白脂酰化及其功能刘红;叶荣【摘要】脂酰化是一种重要的蛋白翻译后修饰，主要包括棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊烯化和糖基化磷脂酰肌醇（GPI）共价结合4种方式。
不同的病毒蛋白可发生不同类型的脂酰化，其生物学功能也会发生相应改变。
棕榈酰化通常能增强病毒跨膜蛋白的疏水性，调节这些蛋白的胞内运输及定位，进一步影响病毒感染过程中的膜融合、病毒颗粒装配及释放等步骤。
豆蔻酰化则可调控病毒蛋白表面的正电荷强度，使病毒蛋白与脂质膜的亲和力改变，如preS1豆蔻酰化加强乙型肝炎病毒（HBV）和丁型肝炎病毒（HDV）的受体识别能力及感染性，而人类免疫缺陷病毒（HIV）Nef豆蔻酰化为病毒感染及免疫应答所必需。
异戊烯化能使病毒游离的蛋白与膜结合，并介导蛋白间的相互作用，如大 HDV抗原（L-HDAg）异戊烯化有利于其运输至内质网膜上，与HBV表面抗原（HBsAg）及HDV RNA共同形成HDV颗粒。
此外，一些病毒蛋白与GPI通过共价结合形成复合物，GPI基团可改变感染细胞的膜结构及胞质内磷脂构成，如GPI与朊蛋白（PrP）结合导致细胞型朊蛋白（PrPc ）交联或羊痒疫朊蛋白（PrPsc ）聚集，与朊病毒引起的海绵样病变有关。
进一步了解病毒蛋白脂酰化机制，有利于设计和开发以此为靶点的特异性抗病毒新药。
%Fatty acylation ,a posttranslational lipid modification process of proteins ,could be classified into four forms:palmitoylation , myristoylation , prenylation , and covalent binding of glycosylphosphatidylinositol (GPI) .All forms of fatty acylation may occur on viral proteins from a variety of viruses ,and may have the potential to change the functions of the targets .Palmitoylation regulates the intercellular transportation and location of viral transmembrane proteinsvia enhancing the hydrophobicity , which is involved in the membrane fusion ,assembly ,and release during viral infection andreplication .Through the regulation of the positive charges of protein’s surfaces ,myristoylation changes the affinity between the cellular membrane and some viral proteins . For example , myristoylation of preS1 increases the receptor recognition and infectivity of both hepatitis B virus (HBV) and hepatitis D virus (HDV) ,and the myristoylation of Nef is necessary for regulation of human immunodeficiency virus (HIV) infection and immunity .The interaction of viral proteins with the membrane compartments or other proteins is increased after prenylation . For example , prenylation could facilitate large HDV antigen’s ( L-HDAg’s ) trafficking to endoplasmic reticulum ,in which the proteins are assembled into HDV virions together with HBV surface antigen (HBsAg) and HDV RNA .Additionally ,GPI binds to viral proteins covalently ,and the GPI moiety would change the membrane structure or cytoplasmic phospholipid components of infected cells .For example ,GPI modification induced the cross-linkage of cellular prion protein (PrPC ) and agglutination of scrapie prion protein (PrPSC ) ,which is involved in the spongiform pathogenesis induced by the prions .It would be greatly beneficial for both design and development of new antiviral drugs when the mechanism of lipid modification of viral proteins is further uncovered .【期刊名称】《微生物与感染》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】9页(P122-130)【关键词】病毒蛋白;棕榈酰化;豆蔻酰化;异戊烯化;糖基化磷脂酰肌醇共价结合【作者】刘红;叶荣【作者单位】复旦大学基础医学院，上海200032;复旦大学基础医学院，上海200032【正文语种】中文脂酰化(fatty acylation)是蛋白修饰的重要方式之一，这种修饰可以是静态的，也可以是动态的，修饰后蛋白的功能呈现多样性。
HIV一1感染机体的分子生物学基础
陈勤
【期刊名称】《现代医院》
【年(卷),期】2004(004)004
【摘要】从分子生物学角度进一步阐明相关蛋白分子结构及作用机制.艾滋病(AIDS)主要是由HIV一1(人类免疫缺陷病毒一型)感染表达CD4表面抗原T淋巴
细胞而引起的.HIV-1病毒首先通过病毒表面膜蛋白(gpl0和gp41)与细胞表面受
体蛋白(CD4和CCR5等)之间相互作用,进而发生融合、进入、反转录、整合、表
达等反应过程,最终致细胞病变和机体发病.
【总页数】3页(P7-9)
【作者】陈勤
【作者单位】广州万孚生物技术有限公司,广东广州,51064l
【正文语种】中文
【中图分类】Q7
【相关文献】
1.用锌原紫质（ZPP）作为缺铁性红细胞生成的标记衡量感染免疫缺陷病毒（HIV）病人机体铁状况 [J], 康龙丽
2.广东省HIV/HCV共感染者及单纯HIV感染者HIV-1基因亚型分析 [J], 袁小珍;陈伟烈;卓丽
3.HIV-1gp120分子结构针对机体免疫应答的研究进展 [J], 谭寿南
4.饲用酶制剂作用的分子营养学机理与加酶日粮ENIV系统的分子生物学基础 [J],
冯定远;谭会泽;王修启;左建军
5.我国云南瑞丽市区HIV感染者HIV分子流行病学分析 [J], 滕智平;朱托夫;段一娟;张家鹏;曾毅
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HIV-1 P24抗原检测感染HIV-1后，机体针对HIV-1基因编码的抗原性物质产生相应抗体，在临床上具有重要诊断学意义的主要是对抗结构基因编码抗原(如gpl60，gpl20，gp41，p66，p55，p51，p31，p24，p17等)的抗体。
由于个体差异、各种病毒蛋白的浓度和抗原性强弱不同及不同个体对不同抗原成分的反应性均有所不同，因此相应抗体的产生时间和不同个体对相同抗原成分的免疫应答强度等存在一定差别，此外，检测方法和使用试剂的敏感性不同对HIV-l抗体的检出时间产生一定影响。
在感染HIV-1后，患者血清中最先出现p24抗原，继之，各种HIV-1抗原可达到高峰；2-6周后，随着HIV-l抗体产生及浓度的不断增加，HIV-l抗原渐趋降低或检测不出。
在HIV感染后期，抗原量不断增加，往往预后不佳，至少约有50%左右的病人发展为艾滋病。
目前用于HIV抗体检测的第三代ELISA试剂窗口期为3-4周，在该期病毒抗体不能被检出，但可检测到病毒相关抗原或分离出病毒，故在窗口期检测P24抗原是早期辅助诊断和进一步缩短窗口期的一种方法。
P24抗原的检测，大约可以使抗体窗口期缩短1周，因为估计检测P24抗原到检出P24抗体间隔只有1周时间。
有助于多数急性感染者血清HIV抗体阳转之前的诊断，还适用于：HIV-1 阳性母亲所生婴儿的早期辅助鉴别诊断；第四代 HIV-1 抗原 / 抗体 ELISA 试剂检测呈阳性反应、但 HIV-1 抗体确认阴性者的辅助诊断；监测病程进展和抗病毒治疗效果。
但由于不是所有新近感染的人都可以检出P24抗原，加上该项检测费用较高，所以一般不作为常规诊断项目。
HIV-1 P24抗原检测一般用ELISA双抗体夹心法试剂，必须经过 SDA 批准注册。
阳性结果必须经中和试验确认，该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊；HIV-1 P24抗原检测阴性，只表示在本试验中无反应，不能排除HIV 感染。
独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得酉ｊＥ太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
学位论文作者签名：卫ｐ回签字日期：狮｛‘年ｒ月／ｏ日摘要获得性免疫缺陷综合症（ａｃｑｕｉｒｅｄｉｍｍｕｎｏｃｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＡＩＤＳ）是当今世界影响最大，危害也最大的疾病之一，它的防治迫在眉睫。
人类免疫缺陷病毒（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）是ＡＩＤＳ的病原体，其中编码核，Ｉｉ，蛋白的ｇａｇ基因是ＨＩＶ基因中最保守的一段。
含有ｐ２４和ｐ１７的核心蛋白，又称Ｇａｇ蛋白具有一定的抗原性，而且抗Ｇａｇ蛋白的抗体是ＨＩＶ感染后可从血液中最早检出的抗体，因此ＨＩＶ－Ｇａｇ蛋白对ＡＩＤＳ的检测有着重要的作用。
本文主要是对ＨＩＶ－ｇａｇ基因的重组、表达和应用进行了研究。
目的研制ＨＩＶ抗体诊断试剂。
方法根据从Ｇｅｎｂａｒｔｋ上查询到的ＨＩＶ－ｇａｇ基因的序列，分别设计了上游引物（ｇａｇＦ）：５＇－ＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡ一３’和下游引物（ｇａｇＲ）：５＇－ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＣＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＴＧＡ一３’。
用聚合酶链反应（ＰＣＲ）的方法从ＨＩＶ－１的基因中扩增出ｇａｇ的ＤＮＡ。
经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将ｇａｇ的ＤＮＡ插入表达载体ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ质粒中，构成重组的ｇａｇ－ｐＴｒｅＨｉｓ２Ａ质粒。
将此重组质粒转化原核表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）中，用异丙基一Ｂ—Ｄ．琉代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达。
表达的蛋白用Ｎｉ”亲和层析柱纯化后做ＳＤＳ．ＰＡＧＥ检测，以及蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，Ｗｂ）和间接ＥＬＩＳＡ实验的应用研究。
关于HIV-1_pol基因的比较分析_生物信息关于HIV-1 pol基因的比较分析摘要 HIV是RNA病毒,属慢病毒科Lentiviridae,为正链RNA病毒,由两条相同的线状RNA组成,两条链通过氢键形成二聚体。
病毒基因组长约9.7KB,共由9个基因片段,3个结构基因编码病毒结构蛋白。
pol基因序列为:NH-蛋白酶-逆转录酶p66/p51-内切核酸酶p32?COOH。
本课题研究蛋白酶和逆转录酶段序列。
由于逆转录酶缺乏3′→5′外切酶活性,使得HIV在复制的过程中不能对错误掺入的单核苷酸加以校正,从而表现出易错倾向,这是HIV产生高度变异的最重要的原因。
本课题主要运用PHYLIP、TREEVIEW和CLUSTALX等软件,对HIV-1的pol基因进行了序列相似性比较。
系统发育推断软件PHYLIP即是Phylogeny Inference Package的缩写,共包括37个程序, 按照所处理数据对象的不同可分为五类。
PHYLIP的大多数程序运行时, 从一个名为“infile”的输入文件读入数据, 如果没有该文件, 程序将会询问你输入文件的名称。
然后会出现一些应答选项让你选择。
最后输出结果到outfile或treefile文件中。
CLUSTALX是CLUSTAL多重序列比对程序的Windows版本。
本课题采用了两种方法,即最大简约法和邻位相连法,最后得到了两个进化树。
关键词:PHYLIP,TREEVIEW,CLUSTALX,进化树,genetic distance1 绪论1.1 课题背景及目的1.1.1 HIV概述HIV是RNA病毒,属慢病毒科Lentiviridae,于1983年首次在法国一位患慢性淋巴结综合症的病人身上发现。
一年后,类似的病毒在美国的一位患艾滋病的患者身上发现。
当初这种病毒被认为是一种癌病毒,与人的T-细胞白血病病毒(HTLV-1)相近,于是命名为HTLV-Ⅲ,后来发现它是慢病毒的一种,改为HIV[1]。
蛋白免疫印迹法(WB)试验结果与HIV感染关系的分析【摘要】目的通过对蛋白免疫印迹法(WB)试验结果的观察,确定个体是否感染HIV以及HIV感染的状况。
方法对60份抗-HIV初筛阳性血清使用蛋白免疫印迹法(WB)进行确认实验。
结果在被检测样品中,HIV-1型确认试验阳性54例,占90%;HIV-1型确认试验阳性,且提示HIV-2阳性感染1例,占1.6%;HIV-1型确认试验弱阳性(不确定)3例,占5%;HIV-1型确认试验阳性2例,占3.3%。
结论蛋白免疫印迹法(WB)试验确定个体有无HIV感染以及HIV感染情况提供依据。
【Abstract】Objective Through to western blot assay observation of result of the test, confirm individual infect HIV and HIV infect the state.Methods Safe the positive serum and use western blot assay to confirm to cases of 60 persist-HIV positive for the first time.Results Being measured in the sample, HIV-1 types confirm testing 54 cases of positive,takes 90%.HIV-1 types confirms testing positive,and point outHIV-2 infect one positively,takes 1.6%.HIV-1 types confirm testing weak positive 3,takes 5% HIV-1 type confirm testing negative 2,take 3.3%.Conclusion Western Blot Assay test offers basis on confirm whether individuals have HIV is infected and HIV infect the state.【Key words】HIV infect;Western Blot Assay;Strip艾滋病(AIDS)是一种目前尚无有效治愈方法,病死率极高的传染病,它在全世界的广泛流行已经成为严重的公共卫生问题和社会问题。
HIV gp120 包膜糖蛋白与CD4 受体和一个中和抗体的复合物的结构摘要：HIV 进入靶细胞需要病毒外膜糖蛋白gp120 与细胞表面的CD4 糖蛋白和趋化因子受体的序列之间的相互作用。
这些作用将导致病毒病毒包膜和靶细胞膜之间的融合。
尽管gp120 能诱导病毒中和抗体的产生，但HIV 能逃避免疫反应。
我们在2.5 的分辨率下分析了HIV-1 gp120 核心与CD4 受体的两个结构域片段和能阻断趋化因子受体的结合的中和抗体的与抗原结合片段的复合物的X-射线结构。
这个结构显示出gp120 与CD4 结合面上的洞状结构，一个保守的趋化因子受体结合位点，CD4 结合后的构象变化的迹象，CD4i 抗原表位的特征，和免疫逃避的具体机制。
我们的结果为理解HIV 进入靶细胞的复杂的生物学特性提供了一个框架，并且可能为干预HIV 进入靶细胞提供指导。
HIV-1、HIV-1 和与其相关病毒SIV，能导致机体的CD4细胞的减少，进而导致AIDS 疾病的进展。
HIV 进入靶细胞时有病毒包膜糖蛋白介导的，包膜糖蛋白组合成寡聚体，尤其是三聚体，表达在病毒表面。
这些病毒包膜糖蛋白被HIV 跨膜糖蛋白gp41 固定在病毒包膜上。
病毒刺突的表面主要由外膜糖蛋白gp120 组成，gp120 与CD4 三聚体复合物的每一个亚基之间形成非共价键。
比较不同的灵长类免疫缺陷病毒的序列发现有5 个相似的可变区（V1V5）。
前 4 个可变区形成暴露于表面的环状结构，并在环基底部有分子内二硫键。
保守的gp120 区域形成了对于gp120 与CD4 膜外区和细胞表面上病毒受体之间的相互作用非常重要的不连续的结构。
HIVgp120 的保守区和可变区均被广泛地糖基化。
gp120 表面的变异性和糖基化可能会调节gp120 糖蛋白的抗原性和免疫原性，同时在自然感染过程中，gp120是作为中和抗体的主要靶点。
灵长类免疫缺陷病毒进入靶细胞包括gp120 与HIV 首要受体CD4 的结合。
抗HIV-1 gp41单克隆抗体的制备及意义邓郁青;张坤娟;王从印;张征峥;宋小天;张红中;王润田【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2009(49)19【摘要】目的为HIV-1感染的检测和研究提供依据.方法以基因工程重组抗原HIV-1 gp41蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法制备抗gp41蛋白的单克隆抗体(mAb),用ELISA法鉴定所得mAb的Ig亚类、效价及特异性.单抗经饱和硫酸铵(SAS)纯化和HRP标记后,利用双抗体夹心ELISA筛选检测gp41蛋白的最佳配伍单抗,分别包被ELISA板及作为酶标mAb,建立双mAb夹心ELISA法.结果经细胞融合、筛选、克隆化,获得了12株可分泌高效价mAb的杂交瘤细胞.纯化的腹水mAb经配对试验,选出2株mAb:7D4和9G2-HRP建立了双mAb夹心ELISA法,检测HIV-1 gp41抗原的灵敏度是1 μg/L.结论获得12株效价高的抗HIV-1 gp41的mAb,建立了特异性强、灵敏度较高的检测HIV-1 gp41抗原的双抗体夹心ELISA法.【总页数】2页(P48-49)【作者】邓郁青;张坤娟;王从印;张征峥;宋小天;张红中;王润田【作者单位】河北医科大学基础所,石家庄,050017;河北医科大学生物医学工程中心;河北医科大学生物医学工程中心;河北医科大学基础所,石家庄,050017;河北医科大学基础所,石家庄,050017;河北医科大学生物医学工程中心;河北医科大学基础所,石家庄,050017【正文语种】中文【中图分类】R512.91【相关文献】1.抗鸡IgA单克隆抗体的研究Ⅲ.抗鸡IgMμ链单克隆抗体的制备及生物… [J], 钱建飞;毛洪先2.HIV-1包膜蛋白gp41单克隆抗体研究进展 [J], 郭海萍;富宁3.HIV-1囊膜糖蛋白gp41三聚体结构域基因的表达及其单克隆抗体的制备 [J], 陈峥;徐志凯;黄庆生;黎志东;姜世勃4.抗HIV-1 gp41合成多肽C34单抗的制备及生物学活性 [J], 郭海萍;刘北一;罗海波;韩强涛;富宁5.抗人Ig轻链系列单克隆抗体的研制1．抗人λ轻链亚型／亚群单克隆抗体的制备及特性鉴定 [J], 赵蓉;郑志竑;谢捷明;包少佳;吴国华;邱文萱因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
HIV包膜蛋白的结构及其相应的病毒进入抑制剂夏承来;姜世勃;刘叔文【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2009(25)8【摘要】HIV-1病毒包膜蛋白gp120和gp41在病毒感染中起着重要的作用.在病毒进入细胞的过程中,gp120先和CD4分子结合,发生构象改变,进而导致gp41构象的变化,使病毒包膜和细胞膜融合而感染细胞.与gp120或者gp41相结合的多肽、大分子和小分子化合物,都可能影响HIV-1病毒包膜和靶细胞膜结合的过程,从而起到抗HIV-1病毒的作用.该文对gp120和gp41的结构及其相互作用,以及以HIV-1包膜糖蛋白为靶点的病毒进入抑制剂类抗艾滋病药物进行综述.【总页数】4页(P991-994)【作者】夏承来;姜世勃;刘叔文【作者单位】南方医科大学药学院,广东,广州,510515;南方医科大学药学院,广东,广州,510515;New,York,Blood,Center,New,York,NY,10065,USA;南方医科大学药学院,广东,广州,510515【正文语种】中文【中图分类】R978.7;R966;R373.9【相关文献】1.HIV进入抑制剂Vicriviroo的Ⅱ期试验因病毒学指标未达标而停止 [J], 张翔（编译）2.HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达 [J], 孙丹丹;金宁一;李昌;李太元;朱娜;杜寿文;任大勇;刘存霞;秦艳青;李沂3.作用于HIV包膜蛋白亚基gp41的多肽类融合抑制剂 [J], 刘叔文;吴曙光;姜世勃4.抗HIV-1包膜蛋白gp41核心结构合成肽C34单抗对H9/HIVⅢB细胞的作用[J], 郭海萍;富宁5.靶向包膜蛋白的HIV进入抑制剂非感染性定量筛选方法的研究 [J], 李珉珉;夏承来;毛芹超;姜世勃;刘叔文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
研究报告doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2011．06．003HIV－1包膜蛋白gp41优势抗原的构建及可溶性表达杜刚1，江蒙蒙2，尹林1，王宏萍1，周晓明11．上海市公共卫生临床中心，上海201508；2．苏州大学基础医学院，江苏苏州215006［摘要］目的：筛选1型人免疫缺陷病毒（HIV－1）中国流行株中包膜蛋白gp41的优势抗原片段，构建具有区域流行代表性的HIV－1gp41重组抗原，为改进现有HIV－1初筛试剂盒中使用的同类抗原奠定基础。
方法：利用免疫斑点杂交和生物信息学方法，从收集自重庆、广州、上海的区域代表性150份HIV－1感染者血清标本中筛选gp41抗原性强的候选样本，利用RT－PCR及巢式PCR方法扩增包含重要抗原表位决定蔟的gp41基因片段，与原核表达载体pQE30连接，转化大肠杆菌M15构建gp41重组抗原表达菌株，表达后经亲和层析纯化、SDS－PAGE和Western印迹鉴定。
结果：兔源HRP标记的gp41多抗能识别标本中gp41抗原性差异，得到候选样本，扩增包含gp41主要抗原表位片段；构建了包含gp41抗原表达簇的重组原核表达质粒，表达、纯化后经His标签抗体Western印迹鉴定为阳性。
结论：高纯度的重组优势gp41抗原的构建和鉴定，为进一步改进现有HIV初筛诊断奠定了基础。
［关键词］1型人免疫缺陷病毒；包膜蛋白gp41；抗原表位；斑点杂交；亲和层析［中图分类号］R392．1;Q78［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2011)06－0764－05 Construction and Prokaryotic Expression of Soluble HIV－1gp41 Dominant EpitopesDU Gang1,JIANG Meng－Meng2,YIN Lin1,WANG Hong－Ping1,ZHOU Xiao－Ming11．Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University,Shanghai201508;2．Basic Medicine Department,Soochow University,Suzhou215006;China［Abstract］Objective:To prepare the major antigen fragment of gp41of HIV－1based on main epidemic strains in China and to construct representative gp41recombinant antigen of HIV－1for further improving the efficacy of current HIV screening test．Methods:Combined with viral load of each sample,dot blot and bioinfomatic analysis were to identify two candidate samples from150HIV－1postive serums collected from Chongqing,Guangzhou and Shanghai．Subsequently,RT－PCR and nested PCR were performed to synthesize gp41epitope－specific sequences, then the cloned fragments containing dominant gp41epitopes cotransformed with the backbone vector pQE30into E．coil M15was performed to obtain recombinant gp41expression strain．Results:Rabbit HRP－labelled anti－gp41 polyclonal antibody could recognize the different gp41intensity in150samples,from which the result led to the successful selection of two candidate samples．Then we constructed the recombinant expression plasmid,the positive result was demonstrated by His－tag monoclonal antibody after affinity chromatography purification．Conclusion:The acquisition of highly purified gp41recombinant expression plasmid has laid a good foundation for further amealiot-ing current HIV screening test．［Key words］HIV－1;envelope glycoprotein;dominant gp41epitope;dot blot;affinity chromotograhpy自1983年我国首次报告HIV感染者以来，到2010年我国实际HIV感染人数已超过100万，中国成人流行率为0．1％～0．5％[1]。
为控制HIV流行，在献血者及艾滋病防治自愿门诊中对HIV进行全面筛查是必要的工作。
其中，以HIV抗原抗体反应为基础的ELISA方法被用于我国筛检HIV病原标准流程中的初筛及血清型分析。
我国国产初筛试剂盒经历了多年的发展，但由于HIV基因组的高度变异使抗原特点在年度间可发生累积的改变[2]，从而降低原有试剂的灵敏度和特异度，因此需要选择具有流行代表性的抗原来提高试剂的检测效果。
包膜蛋白gp41包含大量特异性的抗原表位簇，［收稿日期］2011－04－06［基金项目］复旦大学新教师启动基金（JJF162002）；上海市公共卫生临床中心资助项目（KSF0295）［作者简介］杜刚（1984－），男，硕士，研究实习员［通信作者］周晓明，（E－mail）xmzhou＠shmu．edu．cn表1扩增HIV－1gp41优势抗原片段的引物及反应条件引物及序列方向（5′→3′）反应条件第一轮扩增第二轮扩增测序引物ｇｐ４１Ｆ１：ＴＣＴＴＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＧＧＧｇｐ４１Ｒ１：ＡＡＣＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＧＴＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＡＡｇｐ４１Ｆ２：ＴＣＴＴＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＧＧＧｇｐ４１Ｒ２：ＧＧＡＧＧＣＴＴＡＴＡＴＡＣＣＡＣＡＧＡＣＣＡＲＴＴｐＱＥ３０Ｆ：ＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＡＴＡｐＱＥ３０Ｒ：ＧＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＣＡＴＡＴＴ94℃4min ；94℃30s,65℃30s ，68℃30s ，25个循环；68℃10min;4℃保温94℃4min ；94℃30s ，66℃30s ，68℃30s ，5个循环；94℃30s ，63℃30s ，68℃30s ，25个循环；68℃10min ；4℃保温pQE30测序引物不包含HIV 扩增序列和限制性内切酶位点；引物gp41R2中的R 表示兼并碱基包含T ／G ／A是一种良好的早期诊断HIV 感染的抗原标志物[3]。
我们从重庆、广州、上海收集2008年HIV－1感染者血清，从中筛选出gp41相对抗原强度较高的样本，利用RT－PCR 及巢式PCR 扩增出包含重要抗原表位决定簇的gp41基因片段，与原核表达载体pQE30连接，转化大肠杆菌M15构建gp41重组抗原表达菌株，表达、纯化后经SDS－PAGE 、Western 印迹和阳性血清组测评。
筛选的抗原片段可用于改进现有HIV－1初筛试剂盒的应用效果。
1材料和方法1．1材料收集重庆市HIV 感染者血清35份、广州市HIV 感染者血清18份、上海市HIV 感染者血清47份，记录感染途径、年龄、职业及实验室相关检验指标。
将收集的血清样品各1mL 平均分装3份，分类编号，分别保存于4℃、－20℃和－80℃度冰箱。
4℃保存的血清稀释至1／200后进行点印迹实验，－20℃保存的血清用于提取病毒RNA 并进行RT－PCR 实验，－80℃中的血清为长期保存[4]。
大肠杆菌M15感受态细胞和原核载体pQE－30分别购自天根和Qiagen 公司；pQEHIV2质粒由本实验室合成；辣根过氧化物酶（HRP ）标记的羊gp41多克隆抗体购自Fitzgerald 公司；鼠源gp41单克隆抗体和兔源gp41多克隆抗体购自eEnzyme 公司；6×His 标签的鼠抗购自北京中杉金桥公司；HRP 标记羊抗鼠IgG 购自Santa Cruz 公司。
T 4DNA 连接酶及高保真酶KOD －Plus 购自Toyobo 公司；D2000DNA marker 购自天根公司；各种限制性内切酶购自Promega 公司。
1．2点印迹筛选HIV 阳性血清样本取PVDF 膜（15cm×15cm ），用甲醇润湿活化5s ，蒸馏水洗3次，转膜缓冲液浸泡15min ，晾干；按顺序在膜上点2μL HIV 阳性血清1∶50稀释样品，待干后用含5％BSA 的TBS－T 室温下封闭1h ；TBS－T 洗3次，每次5min ；分别用兔源gp41多克隆抗体及鼠源gp41单抗加入用TBS－T 按1∶1000稀释的一抗，室温2h ；TBS－T 洗3次，每次5min ；加入按1∶2000稀释的HRP 标记二抗，TBS－T 清洗15min ；取Millipore immoblin 显色液A 、B 各500μL ，混匀室温放置5min ，暗室显影，扫描记录。
1．3提取病毒RNA 进行RT－PCR用Axygen Biosciences 体液DNA ／RNA 提取试剂盒，从HIV 血清200μL 中提取到RNA 50μL ，取10μL 逆转录得到HIV cDNA 。
以筛选出的部分重庆及广州感染者阳性血清标本的cDNA 为模板，用TaKaRa 公司PCR 扩增试剂盒进行基因扩增，反应体积为50μL ，包括10×PCR 缓冲液5μL 、50mmol ／L MgCl 25μL 、2．5mmol ／L dNTP 5μL 、20mmol ／L 上下游引物各1．5μL 、TaKaRa Ex Taq 酶和模板各0．5μL 。
