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Southern Blot原理及实验方法Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.5)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。
2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。
S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。
4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。
为有效除去蛋白，此步可以重复）。
5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。
6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。
7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。
8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。
9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。
10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。
11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。
12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。
13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。
14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。
15)DNA样品可以放在4℃保存备用。
B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。
识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
southern blot是一种分子生物学技术，用于检测特定DNA序列在样本中的存在和数量。
以下是southern blot的步骤概括：
DNA提取：从样本中提取DNA，通常使用酚/氯仿/异戊醇法或柱层析法等方法。
DNA纯化：将提取的DNA进行纯化，去除杂质和其他分子。
DNA片段化：将纯化的DNA片段化成一定大小的片段，通常使用限制性内切酶（如EcoRI、BamHI等）进行切割。
凝胶电泳：将DNA片段进行凝胶电泳分离，使DNA片段按大小分开。
转膜：将凝胶上的DNA片段转移到NC膜上，可以使用毛细作用或真空转移的方法。
杂交：将标记的探针与NC膜上的DNA片段进行杂交，使特异的DNA序列被标记。
洗膜：去除未结合的探针，只留下特异的DNA序列与探针结合的部分。
检测：通过检测标记的探针来检测特异的DNA序列是否存在以及其数量。
以上步骤完成后，就可以得到southern blot的结果，并可以对结果进行分析和解读。
实验七Southern印迹法[目的]１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。
２．了解Southern印迹的意义。
[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
这种方法最初是由Southern于1975年建立的。
方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。
它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。
即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。
以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。
然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。
[器材与试剂]一、器材1．电热真空干燥箱2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意：操作戴手套！1．凝胶处理:1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。
southern blot原理
Southern Blotting 原理
Southern blotting 技术是由 Edwin M. Southern 在 1976 以
一种简单而有效的方法提出的，用于支持DNA含量的分析。
它最常被用于鉴定由多种DNA碱基构成的特定序列，以及鉴定和检测特定DNA 序列的存在、比较、分析及其分布。
它通过将DNA模板分离出来，再将DNA模板用聚合酶链反应(PCR)扩增以获得足够多的DNA模板，最后将经过扩增的DNA模板遇到一种特殊的处理，以使它与一张特殊的膜片或者膜片上的特定序列结合。
Southern blotting 包括以下几个步骤：1). 将DNA样本用双链酶将双链DNA分割成小的片段；2). 将分离出来的小DNA片段用一种特殊的方法分子印迹(molecular blotting)到一张特殊的膜片上；3). 将特定的标记物(比如特定的核酸或抗体)与经过分子印迹的DNA片
段结合；4). 将结合物暴露在感光材料上，从而将其结果显示出来。
Southern blotting 技术可以用于检测DNA片段的量、品种、分布、多样性及数量。
这种技术具有准确性高、特异性好、操作简单、检测效率高的优势。
Southern blotting 技术可以用于：1). 鉴定特定的DNA序列；
2). 鉴定DNA片段的长度；3). 检测突变；4). 检测某种重组；5). 筛选特定基因序列；6). 检测融合基因；7). 研究基因组学；8). 检测特定的核酸，如RNA、miRNA、siRNA等。
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Southern Blot原理及实验方法Southern Blot是分子生物学中一种常见的实验技术，用于检测DNA样品中特定DNA 序列的存在和数量。
它被广泛应用于基因克隆、基因组分析、基因诊断、DNA指纹鉴定和DNA进化研究等方面。
Southern Blot的基本原理是将DNA样品经过限制酶切后，在电泳中分离出目标DNA 片段。
然后将这些片段转移到固体媒介（通常是尼龙膜或硝酸纤维素纸）上，并固定在媒介上。
接下来，将一段标记有特定序列的探针加入到膜上，在一定条件下进行杂交反应。
探针与目标DNA片段互补结合，形成杂交带，从而检测出特定的DNA序列的存在。
1. DNA提取与限制酶切首先需要从目标样品中提取所需的DNA，并通过限制酶切，将DNA切割成特定长度的片段。
限制酶的选择应根据所需检测的DNA序列而定。
2. DNA电泳分离将限制酶切割后的DNA通过电泳进行分离，使用凝胶电泳对目标DNA进行分离，通常使用琼脂糖凝胶或封孔凝胶。
3. DNA转移将DNA片段转移到固体媒介（通常是尼龙膜或硝酸纤维素纸）上，将凝胶与固体媒介层间贴合，通过电流使DNA穿过凝胶，转移到固体媒介上。
4. 探针与杂交使用特定序列的探针，对膜上的目标DNA进行杂交。
探针需要标记上含有辨识探针的标记物，如放射性同位素或酶。
在一定条件下进行杂交反应，探针需要与目标DNA序列互补，形成稳定的结合。
5. 洗脱将未结合的杂交缓冲液和杂交条件下无法结合的DNA片段洗脱，保留与探针杂交的特定DNA带。
6. 分析结果可通过显色、荧光标记等方式对膜上的目标DNA进行检测。
检测结果通常以浓度及分子量的方式呈现。
sourthern印迹法摘要：一、Southern印迹法的原理二、Southern印迹法的实验步骤三、Southern印迹法的应用领域四、Southern印迹法的优缺点五、我国在Southern印迹法的研究与发展正文：一、Southern印迹法的原理Southern印迹法（Southern blotting）是一种分子生物学技术，主要用于检测DNA分子中的特定序列。
该技术的核心原理是将DNA从凝胶转移到膜上，然后通过与标记的探针进行杂交，从而检测目标DNA序列。
二、Southern印迹法的实验步骤1.制备样品：提取生物组织中的DNA，并进行纯化和定量。
2.电泳分离：将DNA样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据分子量分离出不同的DNA片段。
3.转移：将凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。
4.杂交：将膜放入含有标记探针的杂交液中，让探针与目标DNA序列结合。
5.洗涤：去除未结合的探针，洗涤膜以消除非特异性信号。
6.检测：使用放射性自显影或化学发光法检测杂交信号，分析结果。
三、Southern印迹法的应用领域Southern印迹法广泛应用于基因mapping、基因突变检测、基因表达分析和病原体检测等领域。
在基因研究中，它可以确定基因的位置、大小和数量；在医学领域，可用于检测肿瘤基因、病原体基因等。
四、Southern印迹法的优缺点优点：具有较高的灵敏度和特异性，可以检测到微量的目标DNA序列。
缺点：实验操作复杂，耗时较长，对实验环境要求较高，且存在放射性污染风险。
五、我国在Southern印迹法的研究与发展我国科研人员在Southern印迹法的研究方面取得了丰硕的成果，不仅在基础研究中有广泛应用，还将其应用于农业、医学等领域。
为降低放射性污染，我国科研人员还研发了非放射性Southern印迹法，如化学发光法等。
在未来，我国将继续加大对Southern印迹法的研究力度，推动分子生物学技术的发展。
【结束语】通过本文的介绍，我们对Southern印迹法有了更深入的了解。
southern blotting原理和步骤嘿，咱今儿个就来唠唠 southern blotting 这档子事儿哈！你说 southern blotting 呀，那就像是一场分子世界里的奇妙探险！想象一下，我们就像一群好奇的探险家，要在那茫茫的分子海洋里找到我们想要的宝贝。
它的原理呢，其实挺有意思的。
简单来说，就是利用核酸分子杂交的特性，来检测特定的 DNA 片段。
就好像我们有一把专门的钥匙，能打开特定的那扇门。
这钥匙就是我们设计的探针，而那扇门就是我们要找的目标 DNA 呀！接下来讲讲步骤，这可真是个精细活儿！首先得把我们要研究的DNA 从细胞里提取出来，这就好比从一个大宝藏里把宝贝给挖出来。
然后呢，用限制性内切酶把这 DNA 切成一段段的，哎呀，这就像把一个大拼图给拆开了。
再之后，把这些切好的 DNA 片段通过电泳的方式，让它们在凝胶里排好队，这就像是让一群小朋友按高矮个站好一样。
接着，把这些排好队的 DNA 从凝胶里转移到膜上，这一步可关键啦，就像把宝贝从一个地方小心翼翼地搬到另一个地方。
然后呢，就是让我们的探针上场啦！这探针就像个机灵的小侦探，专门去寻找它的目标。
把膜和探针放在一起，让它们相互作用，就像两个好朋友见面聊天一样。
最后呀，通过一些检测手段，我们就能知道探针有没有找到它的目标啦！如果找到了，那就大功告成啦！你说这 southern blotting 是不是很神奇？它就像是在分子世界里搭建了一座桥，让我们能从茫茫的分子中找到我们想要的那一部分。
你想想，要是没有 southern blotting，我们怎么能这么准确地找到特定的 DNA 呢？它可是为我们打开了一扇了解基因的大门啊！所以说呀， southern blotting 虽然步骤有点多，有点复杂，但它的用处可大着呢！它就像一把神奇的钥匙，能帮我们解开很多基因的秘密。
咱可得好好记住 southern blotting 的原理和步骤，说不定啥时候就能派上大用场呢！是不是很有意思呀？哈哈！。
Southern Blot 实验流程（包括原理/细节）一、DNA 的提取人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase 处理和纯化来提取DNA。
(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。
(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1% SDS)充分混匀，加入蛋白酶K 至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。
(3)50℃水浴2h，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DN A断裂，约3min。
12000r/min 离心15分钟（室温）(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质12000 r/min 离心15分钟（室温）(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀12000 r/min 离心15分钟（室温）(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时12000 r/min 离心15分钟（室温）(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。
(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K 至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入NaAC至终浓度10mmol/L。
(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。
(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃1小时。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。
Southern对DNA的质量要求比较高，一般来说，高质量DNA样品需具备以下几点：①DNA 完整性好；②DNA 纯度高；③勿用TE 溶解DNA；④DNA 浓度不低于0.7ug/ul，杂交需模板DNA 约20ug/泳道/次二、引物设计三、DNA 检测1、DNA浓度的测定DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于28 0nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于1.8.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。
若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。
取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8,OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA，故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50μg/ mL×稀释倍数。
DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL)2、DNA分子量的测定DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。
四、探针制备（以PCR 标记方法为例）1、标记原理Dig-dUTP 在Taq DNA 聚合酶的作用下，经基因特异的引物PCR 指数扩增，可掺入到新合成的DNA 分子中，从而完成DNA 探针的标记。
在延伸反应中，每20~25 个核苷可有一个Dig-dUTP 分子掺入到新合成的DNA 链中。
2、操作步骤1）探针标记注意：在探针标记前，必须用普通PCR 优化反应条件（试剂盒中提供了过量的Taq DNA 聚合酶及其B uffer，建议用于条件优化），包括引物、退火温度、延伸时间、模板量等，设定好最佳反应条件。
任何非特异扩增可能导致高的杂交背景甚至假阳性。
在标记反应的同时，用普通d NTP 做一个相同体系的非标记PCR 扩增。
扩增体系：95℃5min;[ 95℃30sec,60℃35sec, 72℃30sec;] 72℃5min;30 cycles2）标记探针检测取标记产物和普通PCR扩增产物各1μl，1.0%的琼脂糖凝胶电泳。
由于大分子量的DIG掺入，标记产物泳动速度比普通PCR产物要慢。
所以根据电泳图就可以判断是否标记上和有没有非特异标记！其余标记产物-20℃保存。
如果要准确检测标记效率（一般不必），取标记产物1μl和Dig标记的对照DNA，用DNA 稀释液按10倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。
用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA 探针，按杂交检测方法进行信号检测，然后与膜条上的Dig标记的对照DNA信号强度对比，推算出标记的探针浓度。
如初始模板量较大，可取1μl标记产物稀释10~100倍后定量。
五、基因组DNA 酶切限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶的特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。
不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。
单位(U)RE活性是在37℃1小时内能将1μg DNA所有特异性位点切断的酶用量。
若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。
通常，10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
在正式酶切之前先用20μl小体系预酶切看是否切得动，然后用大体系37℃酶切过夜。
1、酶切体系：每一种酶都有其相应的最佳缓冲液，以保证最佳酶活性，使用时的缓冲液浓度应为1×。
有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。
不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上检测酶切是否充分。
如果酶切充分，灌制1%的agrose胶，加入上样buffer后，在25-30V稳压电泳12-24hrs（包括DNA Marker）。
2、电泳1%浓度琼脂糖凝胶、TBE buffer（EB 染料电泳后染）100ml TBE buffer中加入10μl 10mg/ml溴化乙锭（EB）,将凝胶放置其中染色30分钟, 照相。
六、转膜1、将胶裁成9.8cm×8.0cm 大小，于平皿中用蒸馏水冲洗一次；（此步一定记好胶的大小，后面裁纸/膜以及杂交液体积的选择都要用到）2、加入100ml 0.25 mol/L 的盐酸脱嘌呤，室温振荡15~30 min，至溴酚蓝完全变成黄色。
（如果限制性片段＞10kb，酸处理时间可适当延长；若限制性片段很小，此步可省略）3、用蒸馏水冲洗2 次。
加入变性液（1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH）室温振荡20~30min；至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。
4、用蒸馏水冲洗2 次。
加入中和液（1.5mol/L NaCl、1.0mol/L Tris-Cl ，pH7.4）室温振荡2×15min；5、用蒸馏水冲洗2 次。
加入2×SSC 平衡凝胶和尼龙膜5min；6、虹吸印记法转膜26 小时1) 在方盘上放置一平板，其上放置一滤纸，滤纸两端搭入盘内浸入2×SSC中，用玻璃棒赶走滤纸和平板之间的气泡。
2) 将凝胶倒置于平台上, 正面朝下，切掉右下角，并用保鲜膜封闭四周以防止吸水纸接触凝胶的边缘从而接触平板造成液流的短路。
3) 将尼龙膜放于胶上，赶走气泡。
4) 膜上放两张滤纸，其上再放20层吸水纸。
5) 吸水纸上放一平板，其上放500g左右的重物，目的是建立液体从液池经凝胶向尼龙膜的上行通路，以洗脱凝胶中的DNA 并使其聚集到尼龙膜上。
6) 室温下过夜转膜，持续16小时以上，期间换纸2-3次。
7）完成转膜后，胶染色，观察转膜效果。
并标记好序号、加样孔位置和对应分子量标准的位置，尼龙膜和凝胶直接接触的一面为正面。
8）用2×SSC漂洗尼龙膜一次，滤纸吸干，紫外交联仪下照射固定DNA(5000μJ /cm2)5min。
七、杂交1）预杂交：取8.0ml 65℃预热的Hyb 高效杂交液（Hyb-100），加入杂交管中，排尽气泡，65℃杂交炉中预杂交2h（8-15转/分）。
（此步中高效杂交液的用量根据9.8cm×8.0cm计算所得，1ml高效杂交液/10cm2胶，9.8×8.0=78.4 ）2）探针变性：将已标记好的探针沸水浴中变性10 分钟，立即放冰水浴冷却10min(探针一经变性，立即使用)，。
3）杂交：排尽预杂交液，在8.0ml 新Hyb 高效杂交液（Hyb-100）加入4.0μl 新变性好的探针(1-3ul/膜，5-20ng/ml杂交液)，混匀。
65℃杂交仪中杂交过夜（8-15转/分）。
4）杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可耐沸水浴的管中，贮存于-70℃以备重复使用。
重复使用时，解冻并在65℃下变性10min.。
八、洗膜、信号检测（(化学显色法)1）杂交后室温下，20 ml 2×SSC/0.1%SDS洗膜2×5min。
2）50℃，20 ml 0.1×SSC/0.1%SDS 洗涤2×15min。
（洗液需要先预热到50℃）3）再将膜置于20ml 洗涤缓冲液中平衡2-5min。
4）将膜在10 ml 阻断液中阻断30min（在摇床上轻轻摇动）。
5）封闭完成后倒出阻断液，加入稀释好的10ml 抗体溶液，浸膜至少30min。
(Anti-Dig-A P 在10000rpm 离心5min。
离心后将Anti-Dig-AP 用阻断液稀释(1:5000)，2.0μl Anti-Di g-AP 加入10ml 封闭液混匀)6）去除抗体溶液，用20 ml 洗涤缓冲液缓慢洗膜2 次，每次15min。
7）去除洗涤缓冲液，在20 ml 检测液中平衡膜2 次，每次2min。
8）用检测缓冲液稀释300μl NBT/BCIP 化学显色底物，在约15ml 新鲜制备的显色液中反应显色，在显色过程中勿摇动。
注意：在几分钟内即有颜色开始沉淀，并在16h后完成反应。
为检测显色程度，膜可以短时碱暴露于光线下。
9）当达到所需的点或带强度后，用50ml双蒸水或TE 缓冲液洗涤5 min 终止反应，照相记录结果。
若是杂交结果不满意，尼龙膜可经过处理进行重杂交。
膜重杂交前的处理如下：a. NBT/BCIP化学显色法1. 烧杯中盛装适量的DMF(Dimethylformamid,二甲基甲酰胺)，通风橱内50-60℃水浴。
注：DMF是挥发性的，且大约67℃时能够燃烧。
2. 将膜置于烧杯内，温育至褪色。
3. 用双蒸水彻底淋洗膜。
