人巨细胞病毒pp65抗原检测-医学资料

巨细胞病毒检测与鉴定研究进展微生物学免疫学进展2003年第31卷第2期巨细胞病毒检测与鉴定研究进展吴新刚综述;杨瑞馥审校(1.湖北郧阳医学院微生物学教研室,十堰442000;2.军事医学科学院微生物流行病研究所,北京100071)摘要:巨细胞病毒(CMV)多引起潜伏感染,而且其所致疾病的临床表现多为非特异性的,因此,建立早期快速,灵敏特异,可靠的检测和鉴定方法是至关重要的.本文从细胞培养,病毒抗原血症的检测,特异性抗体的检测和病毒核酸的检测四个方面就近年来CMV的检测和鉴定方法研究进展进行了简要的概述.关键词:巨细胞病毒(CMv);检测;鉴定中图分类号:R373.9文献标识码:A文章编号:1005—5673(2003)02—0066—05巨细胞病毒(Cytomegalovirus,,)是一类在自然界中普遍存在但又严格种属特异性的病毒,属疱疹病毒科.其中使人类致病的为人巨细胞病毒(HICMV),又名人疱疹病毒5型(HHV一5).HCMV在人群中的感染非常普遍,初次感染大多在2岁以下,除少数有临床症状外,通常呈隐性感染.人感染病毒后,多数可长期带毒成为潜伏感染.潜伏部位常在肾,唾液腺,乳腺及其他腺体中.在孕妇,原发或复发感染均可引起新生儿宫内感染或围产期感染,导致胎儿畸形,智力低下或发育迟缓等,严重者可引起全身性感染综合征,即巨细胞包涵体病.HCMV感染是导致免疫功能低下病人,尤其是HIV感染者,器官移植患者死亡的主要原因.长期以来,学者们在积极寻找高灵敏度,高特异性,快速,定量,早期,可靠的检测和鉴定方法.目前,HCMV的检测和鉴定方法主要包括以下几大类:细胞培养,病毒抗原血症的检测,特导性抗体的检测和病毒核酸(DNA及RNA)的检测.1细胞培养细胞培养是诊断HCMV感染的"金标准".传统的细胞培养方法是将尿液,唾液,血沉棕黄层等标本接种到单层人胚肺纤维母细胞上.在标准的试管细胞培养中,CMV会引起典型的细胞毒效应.这种效应的产生时间与样品中的病毒量有关,一般需2--21d(平均8d).病毒的定量一般根据蚀斑和TCIDso.尽管传统的病毒培养方法具有相当高的灵敏度和特异性,但它耗费大量的财力,物力和人收稿日期:2002_07_23作者简介:吴新1~(1977.),男,医学学士,助教,主要从事病原.微生物的检测.力,并且需要熟练的技术人员,因此,在临床上的应用受到了一定的限制L1】.在传统的细胞培养方法基础上,学者们发展了一种快速早期的检测技术即病毒壳脱落离心培养技术.该技术通过低速离心将标本接种于人胚肺成纤维细胞,培养24h后,用荧光标记的与HCMV即刻早期抗原有特异性反应的鼠单克隆抗体直接检测HCMV感染后表达的a,口蛋白.该方法通过维持接种常数及计算脱落壳感染病灶数来进行定量.它既保持了传统病毒培养的特异性,灵敏性,又加快了检测速度,一般24h即可检出【2】.但是,该方法的灵敏度会随标本保存时间的延长而降低,研究发现. 标本保存24h,其阳性率为44%--55%,而48h后再接种,其阳性率会下降到l0%.此外,其灵敏度会随该系统中多形核白细胞数量的增加而升高[3J. 但是,不管标本是保存于室温还是4℃,该方法的灵敏度不受影响.目前,该方法已得到了广泛的应用. Alexander等建立了一种新的微量病毒检测技术,即快速增强组织培养免疫荧光技术(Rapidan—hancedtissuecultureimmunofluorescence.RET—CIF).特异的细胞系培养于96孔微量板中,并向其中加入处理过的单克隆抗体,3298份标本接种后的3d即检出结果(92.5%);而病毒壳脱落离心培养技术需4.9d(87%).该方法适合大量临床标本的检测,它具有快速,灵敏,高分离率,省时的特点[4J.通过建立灵敏而特异的指示细胞系有利于微生物学免疫学进展2o03年第31卷第2期HCMV的快速检测和定量.Liu等通过将包含增强绿荧光蛋白报告基因(该基因受HCMVUL54启动子的调控)的表达盒导人雪貂肺细胞中,构建了一个稳定的指示细胞系,即ML-UL54.EGFP细胞系.使用该细胞系在感染后2d即能鉴定出HCMV.在荧光显微镜下可直接观察到EGFP阳性细胞,而通过流式细胞计数可对病毒进行定量.因此,使用该方法具有敏感,直接,廉价的优点L5J.2病毒抗原血症的检测最常用于检测的抗原为pp65,它是CMV活动性感染的早期标志物,由开放阅读框架UL82编码. 该方法的原理是用标记了荧光素或过氧化物酶的特异性单克隆抗体检测标本HCMVpp65.检测方法包括四个步骤:分离与制片,固定,免疫染色,阅读与定量.最常用的定量方法是报告每片的阳性细胞数或用于制片的每单位数量细胞的阳性细胞数;另一种方法是每片测定5万个细胞,计算其中的阳性细胞数.pp65病毒血症检测法是一种高灵敏度,高特异性的快速检测方法.一般3h即可出结果.研究表明,高pp65血症时有严重的临床症状;中度pp65 血症时,临床症状轻微;而低pp65血症时无症状.本法的缺点在于一旦使用抗病毒药物治疗,pp65阳性率及其含量会显着降低,尽管它仍会间歇升高.此外,本方法需要标本中有足够数量的粒细胞,所以在骨髓或干细胞移植后很难用该法进行HCMV的的早期检测L2J.此外也常以HCMV的即刻早期抗原(IEA),早期抗原(EA),晚期抗原(LA)作为HCMV感染的检测对象LoJo3特异性抗体的检测机体受到HCMV感染后,可产生lgM,lgG和lgA抗体.近二十年来的研究表明,CMV的主要免疫原性蛋白包括基质磷蛋白ppl50与pp65,主要DNA结合蛋白(p52),pp38,糖蛋白gB与gH等.其中gB和gH是诱发中和抗体产生的最常见的靶抗原;pp65,ppl50和pp38等具有非常强而持久的免疫原性,它们与病毒其他结构蛋白如pp52,pp72 等可能是造成恢复期患者抗体持续阳性的原因.目前,多主张采用上述抗原的重组蛋白或多肽作为抗原包被来检测CMV感染者血清中相应的特异性抗体.但Weber等通过使用不同的重组抗原的免疫酶试验(EIA)检测血清样本中的CMV抗体时发现, 采用重组抗原检测CMV活动性感染与采用天然抗原检测相比,其特异性和灵敏性并没有提高L7】.67常用的血清学方法有间接免疫荧光试验IF,间接血凝试验(IHA),放射免疫试验(RIA),免疫酶试验(EIA),Western印迹等,其中最常用的是EIA. EIA是以免疫学反应为基础,将抗原,抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来, 根据酶作用底物后显色,以颜色变化判断试验结果, 可经酶标测定仪作定量分析,敏感度可达ng水平. 但在EIA检测中,某些血清抗体与正常细胞抗原有非特异性反应而产生假阳性,若提高起始稀释度以排除假阳性又会降低实验的敏感性,故需做重复试验并设定正常细胞抗原对照.此外,结果可能受类风湿因子等干扰.Western印迹法检测HCMVlgM较EIA法具有更高的特异度.与病毒学检测结果相比,Western 印迹法的检测结果比EIA法具有更高的一致性(前者88.7%,后者67.5%)J.4ItCMV核酸的检测早期采用从临床标本中提取病毒DNA,电泳,转移及杂交等手段进行检测,但因灵敏度低,操作复杂未能推广应用.目前,广泛采用的方法有PCR扩增技术,杂交捕获技术,支链DNA信号扩增技术, 依赖核酸序列的扩增技术(NA)等.4.1P(,R扩增技术PCR扩增技术已得到广泛应用,尤其是在器官移植患者中.在临床上,PCR扩增技术已应用于血清,尿液,脑脊液,晶状体和玻璃体等标本中CMV的检测,标本冻存2y仍可检出阳性结果.它不仅能检测出CMVDNA,还能检测CMVRNA.PCR扩增技术具有极高的灵敏度和特异性,因此,PCR阴性即可否定CMV的感染,但是,PCR阳性不能分辨病毒处于复制状态还是潜伏状态.用于检测CMV的PCR方法大致包括定性PCR,半定量PCR,竞争PCR和非竞争定量PCR四大类.其差异主要存在于扩增程序,如目的序列的选择,引物的特性,扩增的循环,巢式PCR和对扩增子内源序列杂交的选择等.定性PCR具有极高的灵敏度,但无法分辨是潜伏感染还是活动性感染;定量PCR对确定感染的严重程度和预示患CMV病的危险度有帮助.目前,还没有确定哪类方案是具有最高灵敏度和特异度的最适方案【2J.现有的PCR引物设计大多根据CMV即刻早期基因的启动子和开始的4个外显子序列,晚期抗原(LA)gp64和磷酸化蛋白pp71基因序列.PCR检测的具体方法包括传统PCR,巢式PCR,多重PCR,定量PCR,实时荧光定量PCR,逆转录PCR等多种.目前研究较多的是多重PCR,逆转录PCR和实时荧光定量PCR.g.1.1多重PCR多重PCR,又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上2对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应. 多重PCR可在检测CMV的同时进行分型【9】.在此基础上发展起来的四重PCR在反应体系中加入针对4个不同基因序列的探针,检测受CMV感染的MRC-5细胞中CMVDNA,结果显示,其检测的特异度和灵敏度与加入1对探针的反应体系相同. 该方法的应用有利于变异株的检出H0}.g.1.2实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出. Funato等【lIJ首次将它应用于CMV的检测.他们应用双重荧光标记的特异性探针(两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团),以持家基因和fi-肌动蛋白基因作为目的序列,检测临床标本中的CMVDNA,结果表明,CMVDNA的拷贝数与CMV病的临床表现相关,提示实时定量PCR在检测,上具有临床应用价值.在此基础上发展起来的实时TaqMan定量PCR根据gB基因设计引物和探针,检测结果表明,pp65 检测结果与之有显着的相关性【I2】.而基于Light—Cycler的实时荧光定量PCR更表现出快速(1h内), 灵敏(检测下限<10拷贝/ml标本),定量范围广(2 ×10～2×10)等优点,而且已应用于多种类型临床标本中HCMV的检测和鉴定.该方法选择gB基因150bp的片段作为靶序列,逆转录探针标记了Cy5,序列特异性杂交探针3'端则标记了荧光素03}.g.1.3逆转录PCR(RT-PCR)RT-PCR是将RNA模板的反转录(I)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术.通过检测CMVmRNA可提示病毒的活动感染.可用于检测的mRNA包括剪接即刻早期mRNA和剪接晚期mRNA.由于剪接即刻早期mRNA在潜伏感染时也可能转录,因此更常用的是剪接晚期mRNA.Boriskin等[14】通过RT-PCR检测CMV剪接晚期RNAUL21.5,比检测DNA提前1～4w获得了阳性结果,而且该方法无需定量,可有效地反映病毒的活动性感染.但是, 通过常规RT-PCR,不易区分晚期mRNA和基因组DNA.此基础上发展的差异扩增PCR(DART- PCR)有效地克服了这一缺点.该方法的主要改进微生物学免疫学进展2o03年第3l卷第2期之处是使用不同的RT和PCR温度以及不同的RNA和DNA结构体系.Joo等[15】以HCMV gpUL55为靶序列对该方法进行的评估表明, DART-PCR无需分离DNA和RNA,可在一个管内同时检测DNA和RNA,并可进行定量.g.1.g连接依赖的PCR(Ligation.dependentPCR, U)_PCR)该方法的主要优点是可直接检测CMV感染细胞中而不是只含病毒DNA的上清液中的即刻早期mRNA.wu等[】使用该法检测临床标本中的CMV即刻早期mRNA,结果显示,31份阳性标本中18份培养阳性:一份阳性尿液标本培养为阴性;但有3份培养阳性标本LD-PCR检测为阴性. 提示,LD-PCR是一种可靠的检测CMV感染的方法.4.2杂交捕获技术(Hybridcaptureassay)这是一种通过RNA探针与病毒DNA杂交的溶液杂交抗体捕获技术.包含目的DNA的标本与特异的CMVRNA探针(该探针与,近40kb碱基对或17%的全基因组长度的碱基对互补)进行杂交,DNA:RNA杂交产物通过碱性磷酸酶偶联的特异性抗体捕获,化学发光底物进行定量.由于每38kb的杂交产物可与近1000个抗体结合,而每个抗体偶联有3个碱性磷酸酶分子,因此,结果被放大了至少3000倍.该方法有简单,快速的特点,它可在6h内获得结果.研究证实,白细胞高病毒含量与CMV病的发生有极强的关联.在判断CMV感染与严重的C病上,杂交捕获技术比PCR具有更高的特异性.此外,该方法受外源污染的影响小[17].4.3支链DNA信号扩增技术(BranchedDNAsig—halamplificationassay,bDNA)该方法是一种直接定量检测方法,它依赖bD—NA多聚体的信号放大,而不是目的序列的扩增.其关键在于构建特异性的探针.在反应体系中,共加入43对探针,9对介导CDNA与微孔板结合,34对介导CMVDNA和bDNA多聚体结合.每对探针包括能与CMV基因组gB或UL56区杂交的33对碱基序列,同时包括两种既能与捕获探针又能与bDNA多聚体杂交的18对碱基序列.该方法具有快速,灵敏的特点,而且重复性好,不受标本中其他病毒的影响.研究显示,阳性结果与活动性感染密切相关,不管是血清学阳性还是阴性的健康人, 其结果都是阴性.目前,该方法已用于外周血,脑脊液,精液等多种临床标本的检测[墙】.微生物学免疫学进展2003年第31卷第2期4.4依赖核酸序列的扩增技术(Nucleicacidse—quence-basedamplifictiontechnology,NASA) NASBA是199o年由Guatelli等建立的一种特异性的等温扩增技术,它能有效地鉴定多种类型临床标本中的CMV.该反应有赖于AMV逆转录酶.T7RNA多聚酶和核酸酶H共同协作而完成.在反应体系中,含有两种引物,引物I3'末端与靶序列互补,5'端含T7RNA多聚酶的启动子,这一引物用于合成eDNA;引物Ⅱ的碱基序列与cDNA的5' 末端互补.其基本原理是:在NASBA反应时,首先引物I与RNA模板复性,AMV逆转录酶催化合成cDNA,RNaseH水解eDNA上的RNA,形成一条单链的DNA;引物Ⅱ随即与此cDNA的5'未端结合,逆转录酶在此DNA模板的指导下合成第二条DNA 链.这样形成的DNA双链含有T7RNA多聚酶的启动子.该酶即以此DNA为模板,转录出与样品RNA序列相同的RNA链,而且每条DNA模板在该酶的作用下可合成约100个拷贝的RNA.每条新的RNA又可作为逆录酶的模板合成eDNA.如此反复进行,将获得更多的RNA和cDNAMerlino等【19]采用NASBA技术检测肾移植患者血液标本中的pp65mRNA时发现,pp65抗原血症阳性的活动性HCMV感染者即使抗原血症水平低.pp65 mRNA检测仍有73.8%为阳性,其中21.4%的感染者,NASEIA技术比抗原血症检测法早6～15d即获得阳性结果.提示,NASBA技术在HC的活动感染的早期检测中具有重要的价值.Blok等(2o】用NASBA技术检测了HCMVpp67rnRNA,发现该方法比抗原血症检测法具有同样的特异性,而灵敏度较之更高.Greijer等【】在此基础上,建立了采用三种分子信标的多重实时NASBA技术(MR_NAS—BA).该技术能同时检测和定量即刻早期基因一1和UL65基因编码的IE-1和pp65mRNA.4.5电化学法检测扩增的CMVDNA产物CMV核酸扩增后,常采用琼脂糖凝胶电泳或比色杂交法进行检测,但其灵敏度有待进一步提高. Azek等(z2J首先采用电化学法进行检测,他们发现电化学法的灵敏度较琼脂糖凝胶电泳高23000倍, 较比色杂交法高出83倍.Authier~3】在此基础上进行了改进,建立了基于金微粒的电化学定量检测法. 其基本原理是:①单链目的CMVDNA与金微粒修饰的寡核苷酸探针结合;②通过氧化作用使结合在杂交产物上的Au释放到溶液内;③在一个夹心式丝网印刷微条电极(Sandwich—typescreen—printed microbandelectrode,SPMBE)上通过溶出伏安法间接测定溶解的Au3离子.由于电极沉积期内Au3质量转移的增加呈非线性,因此SPMBE能够灵敏的检测出静态液体中Au".研究证实,该方法可检测出5pM的CMVDNA扩增产物.4.6分子杂交技术IE-1是CMV进入宿主细胞后最先表达的基因,并且它的表达不需要病毒蛋白的参与,因此IE- 1可望作为特异性的探针来检测CMVmRNA.Wu 等【]构建一种链特异性32p或地高辛标记的探针, 该探针来源于HCMVIE-1基因的特异性外显子序列.通过Southem印迹和RNA原位杂交,在HCMV感染的容许细胞(人纤维原细胞)和非容许细胞(鼠纤维原细胞)均可检测阳性结果.结果显示,直接检测IE-I转录的RNA原位杂交技术是检测CMV早期感染的有效方法.综上所述,尽管病毒壳脱落离心培养技术得到了极其广泛的应用,但其耗时较长,结果受标本保存时间影响较大,所以其临床应用价值尚不明朗.血清学试验由于只能在感染2～4w后才能检出阳性结果,而且不能分辨潜伏感染和活动性感染,其临床应用价值受到了一定的限制.抗原血症检测技术是一种更快速,更灵敏,早期检测CMV活动性感染的技术,但一旦使用抗病毒药物治疗,其灵敏度会受到影响.分子生物学技术的发展则提供了更灵敏的早期检测工具.在出现临床症状以前,抗原血症检测技术和PCR技术均可检测和鉴定出CMV的感染.参考文献:[1]SiaIG,PatelR.Newstrategiesforpreventionandtherapyofey—tomegalovirusinfectionanddiseaseinsolid-organtransplantred#一eros[J).ClinMicrobiolRev2000,13(1):83—121.[2]BoeckhM,BoivinG.Quantitationofcytcm~egalovim:method—ologicaspectsandclinicalapplications[J].ClinMicrobiolRev 1998,11(3):533—554.[3]LandryML,CohenS,l~sonofEDTAandacid—citrat~dextrosecollectiontubesfordetectionofcytomegalovims antigenemiaandinfectivityinleukocytesbeforeandafterstorage [J].JClinMierobiol1997,35(1):305—306.[4]AlexanderR,LambD,~VhiteD,eta1.'RE-'TCIF:arapid,sen—sitivemethodfordetectionofviruses,applicableforlargema'abers ofclinicalsamp1es【J].Jvim1Methods2001,97(1-2):77—85. 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人巨细胞病毒核酸定量核酸检测标准操作规程（荧光PCR法）1.目的规范人巨细胞病毒(HCMV)核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA分析。

2.应用范围使用中山大学达安基因股份有限公司人巨细胞病毒(HCMV)核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）和PE GeneAmp 5700、ABI Prism 7000、ABI Prism 7700等仪器进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA 检测。

3.职责由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。

4.内容4.1 实验原理和临床应用本品选取人巨细胞病毒珠（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针，扩增片段长度为86bp,利用实时荧光定量PCR技术，定量检测尿液、乳汁、血清或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。

本品用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性/AIDS患者尿液、乳汁、血清或淋巴细胞中的人巨细胞病毒(HCMV)感染的检测，用于人巨细胞病毒感染的辅助诊断和疗效监控，不用于血源筛查。

本品检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。

4.2标本采集4.2.1 使用标本类型：尿液、乳汁、血清和淋巴细胞4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。

4.2.2.1 尿或乳汁：取晨尿或成熟乳1ml于1.5ml的无菌离心管中，离心取沉淀即为标本。

标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。

4.2.2.2 血清：用无菌注射器抽取受检者静脉血1ml,注入无菌1.5mlEppendoff管，4℃静置过夜。

吸取上层血清（注意勿带入红细胞）至另一无菌1.5mlEppendoff管中，即为血清标本。

标本可立即用于测试（48小时以内），也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。

4.2.2.3 淋巴细胞：取静脉血（EDTA抗凝）1ml,利用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞即为标本。

人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒临床应用及初步评价王述莲;邓中平;呼建民;戴立忠;黄基容;王军;艾颖娟【摘要】目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）核酸定量检测试剂（PCR‐荧光探针法）的临床使用及初步评价。

方法：用浓缩一步法试剂与煮沸法试剂对192例临床收集的样本进行HCMVDNA检测并对比其结果，同时，将两种试剂的检测结果分别与HCMV‐pp65抗原检测结果进行对比。

结果：新型人巨细胞病毒核酸检测试剂与煮沸法试剂的阳性一致性百分比98．06％，阴性一致性百分比95．51％，总一致性百分比96．88％；对6例不符样本进行测序复核，并对复核后的结果进行Kap‐pa检验一致性分析，结果Kappa值＝1．000，表明新型试剂的检测结果与煮沸法试剂及复核检测的结果具有很好的一致性。

在与HCMV‐pp5抗原检测结果的对比中，两种试剂均表现出较好的准确性。

结论：人巨细胞病毒核酸检测试剂与煮沸法试剂检测结果具有很好一致性，操作简单快速，减少污染环节，并具有内标控制假阴性，结果准确，符合临床检测要求，具有较高的应用价值。

%Objective:The goal of this study is to evaluate the clinical application of a new Human Cyto‐megalovirus DNA Diagnostic Kit (refer to as concentrated one‐step method hereafter) .Methods:A total of 192 clinical specimens were detected by concentrated one‐step method and another kind of fluorescence diagnostic kit u‐sing boiling method ,The results were analyzed a nd compared .Simultaneously ,HCMV‐pp65 antigenemia test re‐sults of these 192 specimens were gathered and compared with the results from the one step and Boiling method kits . Results :The two kits showed excellent agreement The Positive consistency was 98 .06% ,the negative consistency was 95 .51% and the total consistency was 96 .88% ;6 cases ofdiscrepant samples were sequenced review ,then the results were performed with the Kappa consistency analysis ,The value ofKappa=1 .000 ,showed good consistency between the two methods .In addition ,compared with HCMV‐pp65 antigenemia test results ,the two reagents both showed good accuracy .Conclusion :The one step method showed good consistency compared with the conventional boiling method ,In this method ,the nucleic acid targets extracted by lysis buffer all went into the PCR reaction .This avoids laboratory contaminations which occur often during routine DNA extraction process .And the PCR detection system uses an internal positive control (internal control) to avoid a false negative result .With a simple procedure , precise results ,this new diagnostic kit is suitable for routine clinical lab usage .【期刊名称】《陕西医学杂志》【年(卷),期】2014(000)011【总页数】3页(P1542-1544)【关键词】巨细胞病毒感染;脱氧核糖酸酶类/分析;荧光免疫测定;聚合酶链式反应;试剂盒,诊断;煮沸法【作者】王述莲;邓中平;呼建民;戴立忠;黄基容;王军;艾颖娟【作者单位】武警北京市总队第三医院检验科北京100141;湖南圣湘生物科技有限公司;武警北京市总队第三医院检验科北京100141;湖南圣湘生物科技有限公司;武警北京市总队第三医院检验科北京100141;湖南圣湘生物科技有限公司;湖南圣湘生物科技有限公司【正文语种】中文【中图分类】R446人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）亦称细胞包涵体病毒，为疱疹病毒科β属的双螺旋DNA病毒，由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体，所以称为巨细胞病毒。

新生儿人巨细胞病毒感染的实验室诊断研究进展作者：王帅来源：《中国当代医药》2012年第29期[摘要] 新生儿巨细胞病毒性疾病是一种新生儿常见疾病，因其发病隐匿，故临床上以实验室检测为诊断疾病的关键。

本文综述了实验室常用的检测方法，比较了各种检测方法的利弊及临床的应用状况和前景，为医生合理地诊断新生儿巨细胞病毒性疾病提供参考。

[关键词] 巨细胞病毒感染；新生儿；pp65抗原血症；研究进展[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）10（b）-0017-02新生儿巨细胞病毒性疾病是由人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染所引起的一种疾病，新生儿因免疫系统尚未发育完全，机体抵抗HCMV的入侵能力极弱，很容易形成HCMV活动性感染。

2004年的统计学研究报道，新生儿的HCMV平均感染率接近10%，病死率接近20%；其余感染患儿可出现中枢神经系统损害、颅骨发育畸形、发育迟缓等症状[1-3]。

因HCMV感染无特异的临床症状和体征，而且患儿多因免疫系统发育不完全而表现为隐性感染，故如何准确、快速、特异性地检测到早期HCMV活动性感染成为临床治疗的关键。

1 病毒分离病毒分离法一直被认为是诊断HCMV活动性感可靠性和特异性最强的方法。

利用免疫标技术检测病毒抗原可缩短病毒检测时间至24～48 h。

常采用尿样本，也可取体液和组织样本[4-5]。

该方法将尿、脐血等检测标本与人胚成纤维（HF）细胞共同孵育，在培养1～3周后，观察HF细胞有无出现致细胞病变效应。

但由于HCMV在体外生长速度缓慢，检测时间长，不能快速确诊以满足临床需要，故该法主要应用于科研[3]。

2 血清特异性抗体检测新生儿HCMV感染后可刺激人体产生体液免疫反应，因此，通过ELISA法检测血清中特异性HCMV-IgM、HCMV-IgG抗体可间接证实体内是否有HCMV感染。

其中，血清IgM抗体因发生于感染早期，故IgM抗体阳性被认为是HCMV活动性感染的指标；而血清IgG抗体阳性则表明患儿曾有HCMV感染史[6]，若HCMV-IgG滴度升高4倍以上则提示有HCMV活动性感染。

人巨细胞病毒pp150-pp65蛋白的表达与应用金玉芬;李艳蕾;华艳;张晓刚;于庭【摘要】Objective To construct mid express the rccombinant plasmid and lisa the purified protein for the eolloidal gold kit for its antigenicity evaluation. Methods Losing PCR technology,the pp150 and pp65 gene fragments were cloned and expressed, The recombination protein was inelueed , purified and identified. At last to eonstruet the eombined detce tion Kit for IgG/IgM Antibody to HrMV( Colloidal Gold) to eletcet the samples in contrast with the imported reagent kit. Results The gene fragment was correctly amplified and surrcssfully ronstrurt the rcrombinant vcrtor. The purified protein with the molcrular weight of 45 kd had good antigenirity. The protein was assembled into a rolloidal gold kit to detect 600 scrum samples, in contrast with the imported reagent kit HCMVTgG ,the kit of the sensitivity was 92. 7 ％ specificity was 83.1 ％ ,coarse consistency was 90. 2 ％ ,in contrast with the imported reagent kit HCMV TgM, the kit of the sensitivity was 88. 1 ％ . specificity was 89. 2 ％ . coarse consistency was 88. 5 ％ : in contrast with the local reagent kit, coarse consistency to TgG and TgM was 93. 0 ％ and 91.2％ ,thc stability is good. Conclusion HCMV pp150 pp65 protein highly expressed had strong specificity. Contrast to the local and the imported reagent kit, the colloidal gold kit market prospect.%目的构建并表达人巨细胞病毒(HCMV)pp150-pp65蛋白,将纯化的重组蛋白制备成胶体金试剂盒对其抗原性进行评价.方法采用PCR 方法扩增HCMV pp150-pp65基因片段,连接到原核表达载体pET28a进行表达并纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并与北京英诺特生物技术有限公司合作研制出巨细胞IgG/IgM抗体联合检测试剂盒(胶体金法),与进口试剂盒(酶免法)进行临床标本比对试验.结果成功构建了HCMV的高效表达载体pET28a-pp150-pp65,并得到分子量在45 kd的高表达蛋白,具有良好的抗原性.将该蛋白制备成胶体金试剂盒,经600份血清标本的检测,与进口CMV-IgG试剂盒进行比对,本试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为92.7%和83.1%,总的符合率为90.2%;与进口CMV-IgM试剂盒进行比对,本试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为88.1%和89.2%,总的符合率为88.5%,稳定性良好.结论高效表达纯化的pp150-pp65重组蛋白抗原性强,利用其建立的胶体金试剂盒与国产已上市试剂盒和进口试剂盒比对,不仅具有较高的灵敏度和特异性,而且经初步临床应用,表明该试剂盒能检测不同临床感染阶段的患者,具有较好的市场前景.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)012【总页数】4页(P2193-2196)【关键词】巨细胞病毒;pp150-pp65;巨细胞IgG/IgM抗体联合检测试剂盒;胶体金法【作者】金玉芬;李艳蕾;华艳;张晓刚;于庭【作者单位】吉林大学第二医院,吉林,长春130041;吉林大学第二医院,吉林,长春130041;北京英诺特生物技术有限公司,北京100070;北京英诺特生物技术有限公司,北京100070;吉林大学第二医院,吉林,长春130041【正文语种】中文【中图分类】R373.1+1人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，简称HCMV）属疱疹病毒β亚科，是一种DNA病毒，其感染在人群中广泛存在，我国人群中HCMV感染相当严重。

第１０卷　第２期２０１９年３月Ｖｏｌ．　１０ Ｎｏ．　２Ｍａｒ．　２０１９器官移植Ｏｒｇａｎ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ【摘要】 为了进一步规范中国实体器官移植（SOT ）受者巨细胞病毒（CMV ）感染的诊断和治疗，中华医学会器官移植学分会组织器官移植专家、感染病学专家及呼吸内科专家，在《实体器官移植受者巨细胞病毒感染诊疗指南（2017版）》的基础上，从CMV 感染的主要危险因素、实验室诊断、临床类型、预防方案，CMV 病的治疗，儿童SOT 术后CMV 感染或CMV 病的防治，CMV 肺炎合并伊氏肺孢子菌肺炎的防治等方面，制订本规范，以期为我国SOT 术后CMV 感染的规范化防治提供指导意见。

【关键词】 器官移植；巨细胞病毒；感染；巨细胞病毒病；巨细胞病毒肺炎；伊氏肺孢子菌肺炎；更昔洛韦【中图分类号】R617，R373 【文献标志码】A 【文章编号】1674-7445（2019）02-0005-07器官移植受者巨细胞病毒感染临床诊疗规范（2019版）中华医学会器官移植学分会DOI: 10.3969/j.issn.1674-7445.2019.02.005基金项目：国家自然科学基金（81570680、81571555）执笔作者单位：100039 北京，中国人民解放军总医院第八医学中心器官移植研究所（石炳毅、肖漓）通信作者：石炳毅，Email ：********************由于免疫抑制剂的大量且长期应用，实体器官移植（solid organ transplant, SOT ）受者各种病原体感染的机会显著增加。

病毒感染中，以巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV ）感染最常见。

CMV 是一类常见的疱疹病毒，在人类血清中的阳性率为30%～97%[1]。

免疫功能正常人群感染CMV 后，通常表现为短时间的发热或无症状，此后CMV 会在多种细胞中呈终生潜伏状态，成为再次活化的储存，携带者成为易感人群[2]。

《中国实体器官移植受者巨细胞病毒感染诊疗指南》要点—、前言巨细胞病毒（CMV ）感染是实体器官移植（SOT ）术后最为常见的病毒感染，临床表现多样。

未采取预防措施的SOT受者CMV感染率较高，在不同移植类型和不同患者人群中也存在明显差异。

CM V侵入人体成为CMV 感染，可为静止性感染或活动性感染。

CMV侵袭肺、肝脏、胃肠道、肾上腺、中枢神经系统以及骨髓等多种器官组织并引起相应临床症状,称为CMV病。

CMV感染可对移植受者造成多方面损害，包括移植物功能丧失、受者死亡或医疗成本増加。

CMV感染与移植物急性排斥反应互有促进作用；并可增加或加重移植受者各种机会性感染，如CMV肺炎。

二SOT受者CMV感染的主要危险因素（一）供、受者血清CM V状况接受血清CMV阳性供者的器官移植的CMV阴性受者（供者阳性/受者阴性，D+/R-）应视为CMV感染极高风险人群。

相对而言，D-/R-移植受者CMV感染的发生率最低（＜5%\（二）移植器官的种类CMV感染风险与移植器官的种类相关：肺、小肠、胰腺移植受者比肾、肝移植受者危险性更高。

（三）其他危险因素其他危险因素包括受者的免疫力低下、合并其他病毒感染、急性排斥反应、高龄和器官移植物功能不全等；供者在重症监护病房（ICU ）监护时间较长，面临多重感染的风险，移植后也可造成受者获得性感染风险增加。

推荐意见：1. 推荐所有器官移植供、受者术前均进行CMV血清学检测，参考风险分层，指导制定预防策略（I-BL2. 建议术后对受者进行CMV-IgG血清学检测（I-B）O抗CMV-IgG 阳性或抗CMV-IgG呈4倍以上增高者为高危纟吉果为临界值或不确定时, 可按阳性考虑（2-C L3. ABO血型不合器官移植、接受淋巴细胞清除性抗体治疗以及术前存在人类免疫缺陷病毒感染的受者均可视为高危患者（I-B）O三、实验室诊断推荐意见：1. CMV的早期快速诊断,推荐外周血及尿液的CMV DNA核酸定量(QNAT )检测，或间接免疫荧光法(IFA )外周血白细胞的CMV-PP65抗原检测(I-A)t> CMV DNA病毒载量> 103拷贝/ml为病毒复制阳性，CMV-PP65抗原一个以上细胞阳性即可报告阳性。

高级卫生专业资格（正高副高）临床医学检验临床微生物技术专业资格(正高副高)模拟题2021年(95)(总分116.4,考试时间120分钟)不定项选择1. 男性38岁。

HBsAg阳性20年，肝功能异常5年。

20年前体检发现HBsAg阳性，当时肝功能正常，无明显症状。

5年前开始ALT升高。

HBeAg及HBV DNA均阳性，服用中药或保肝药治疗，ALT时而正常或升高。

一周前工作忙感乏力。

化验ALT200IU/L来诊，除有轻度乏力外无其他症状。

无其他疾病，无烟酒嗜好无输血及服用损肝药物史，家中母亲及姐姐均为乙肝。

查体：一般情况良好，无黄疸、肝病病容、肝掌及蜘蛛痣，肝肋下未及，脾侧位可及。

临床初步诊断：病毒性肝炎，乙型，慢性。

下列关于HBV的叙述，正确的是（）A. 核酸为双链线状DNAB. 其DNA多聚酶有反转录酶功能C. HBV与肝细胞肝癌关系密切D. HBsAg是体内HBV复制的指标之一E. 主要传播方式为粪-口途径F. 血液中若检出Dane颗粒，则标志着肝内病毒复制活跃G. HBV感染的潜伏期较长，仅少数呈显性感染H. 在乙型肝炎抗原检测中，PreS1抗原不易检测出2. 患者女，30岁，间断乏力、食欲减退，伴恶心、呕吐。

既往体健，否认结核、肝炎、伤寒等传染病史。

既往在3年前“因剖宫产”，术中输血。

体查：无明显黄疸，肝右肋下1cm，脾未扪及，肝功能检查：血清ALT179U/L，TBIL26μmol/L，HBsAg（-），HBeAg（-），抗-HBc （-），抗-HBe（-），抗-HBs（-），血清丙肝抗体检测阳性。

为进一步明确病原，应考虑检查的项目包括（）A. 抗HA V-IgMB. 抗HA V-IgGC. HCV-RNAD. HCV-DNAE. HBV-DNAF. 抗HDVG. 抗HEV3. 男性，54岁，因1周以来发热2天，伴乏力，纳差，眼黄，尿黄入院。

化验：ALT860IU/L，AST620IU/L，TBil260μmol/L，DBil160μmol/L。

小儿巨细胞病毒感染的研究进展巨细胞病毒（cytomegaIovirus，CMV）感染是婴幼儿最常见感染之一，可导致生殖泌尿、中枢神经、肝脏等各系统感染，从无症状感染直到严重缺陷或死亡。

本文主要对CMV的临床表现，发病机制，检测方法，动物模型以及疫苗的研发等方面进行综合阐述。

标签：巨细胞病毒；pp65抗原检测；动物模型；巨细胞病毒疫苗巨细胞病毒（cytomegaIovirus，CMV）感染又称巨细胞包涵体病，是由人巨细胞病毒（human cytomegalovirus ，HCMV）感染所导致的一种先天性或后天性全身感染性疾病。

CMV是一种疱疹病毒，为双链DNA病毒，引起以生殖泌尿系统，中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。

巨细胞感染可发生于先天，产后或任何年龄，但大多数是发生在幼年时期。

我国是巨细胞病毒感染高发区，有报道，我国成人CMV-IgG阳性率为90%，儿童至12岁时已高达80%。

所以，要控制和降低CMV感染率，婴幼儿时期的监测与防范就显得尤为重要。

本文就近年来有关小儿巨细胞病毒感染的研究状况进行归纳总结，为临床合理的诊疗提供科学依据。

1 传播途径和发病机制CMV通过血液、体液和移植器官传播，感染可发生于移植时或出生时。

感染时CMV能经吞噬细胞在体内扩散，同时与内皮生长因子受体结合进入宿主细胞。

病毒的DNA片段组合到人体血管细胞的DNA中，改变其基因功能和脂质代谢，并激活凝血系统以及细胞因子和生长因子基因，促进血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）的表达，促使白细胞和血小板黏附，损伤内皮细胞[1]。

巨细胞病毒侵入人体后，大多表现为亚临床感染，主要潜伏于血管平滑肌细胞和内皮细胞中。

CMV基因组含有其他辅助基因，可以参与免疫逃避或者抑制细胞死亡，致使病毒和宿主共生。

机体中T细胞、NK细胞等介导的细胞免疫起到重要的预防和控制作用，可是也不能完全清除病毒，使大部分人成为隐性或潜伏感染[2]。