DNS-氨基酸的制备和鉴定——学习指南l 学习重点1. 掌握薄膜层析的基本原理和操作。
2. 学习DNS-标记法在氨基酸、肽和蛋白质分析中的应用。
l 知识要点1. 层析：利用混合物的各组分在固定相和流动相分配系数的差异，从而达到分离的目的。
根据支持介质的不同，层析可分为纸层析、薄膜层析、薄层层析和柱层析等。
本实验采用双向层析法，I 向和II 向展层选用不同的溶剂系统，可获得更好的分离效果。
2. 迁移率R f 值：样品点移动距离与溶剂移动距离的比值。
在同一展层系统中，R f 值差异越大，分离效果越好。
3. 聚酰胺：己二酸和己二胺的高聚物，含有大量酰胺基团，能与多种极性基团，如氨基酸的羧基和侧链基团形成氢键。
化合物中不同分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不同，以达到分离的目的。
(CH 2)6C O(CH 2)4COn4. DNS-Cl ：又称5-二甲氨基-1-萘磺酰氯，是一种荧光试剂。
在弱碱性条件下可与氨基酸的α-氨基反应，生成DNS-氨基酸。
在紫外光照射下，DNS-氨基酸可产生黄绿色荧光，具有很高的检测灵敏度。
黄绿色荧光l 试剂1. 2.5mg/mL DNS-Cl 丙酮溶液。
2. 三种氨基酸混合液（Gly 、Phe 、His ）。
3. 三乙胺。
4. 展层液I ：苯:冰醋酸（V/V ）=9:1； 展层液II ：甲酸:水（V/V ）=1.5:100。
l 仪器聚酰胺薄膜、毛细点样管、旋涡混合仪、层析缸、恒温水浴锅、电吹风、紫外分析仪 l 操作l 注意事项1. 严格控制点样位置以及点样直径，点样点应始终保持在展层溶剂液面以上，点样需少量分次，保证点样点小且圆。
2. I 向层析结束后，注意聚酰胺薄膜转动的方向，便于和标准图谱对照。
3. 苯对人身体有害，实验应在通风橱中进行并保持室内通风良好。
实验四Dansyl—氨基酸的聚酰胺薄膜层析法实验目的1．学习聚酰胺薄膜层析法的原理。
2．学习利用Dansyl—氨基酸分析蛋白质N末端氨基酸及蛋白质组成的原理。
3．掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法。
实验原理聚酰胺是一类化学纤维原料，又称锦纶或尼龙。
它对许多极性化合物有吸附作用，具有特异的分辨性能，可用于柱层析、薄层层析及薄膜层析。
聚酰胺薄膜是将锦纶涂布于涤纶片上，形成质地均匀的紧密的多孔薄膜，层析性能十分优良。
聚酰胺的化学结构如右。
由于聚酰胺的—C=O基及—NH基可与被分离物质形成氢键，因此可以吸附酸类、酚类、醌类、硝基及胺基化合物等。
由于各种物质与聚酰胺形成氢键的能力不同，即聚酰胺对各种物质的吸附能力不同。
而在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。
因此，选择适当的层层溶剂，可使各种待分离物质在聚酰胺表面与溶剂之间有不同的分配系数，经过吸附与解吸附的展层过程，各自按一定次序分离开来。
与纸层析及纸电泳等方法相比，聚酰胺薄膜层析在分析氨基酸衍生物时具有灵敏度高、分辨力强、速度快、操作方便等优点。
除用于氨基酸衍生物的分析外，还可用于碱基、核苷酸、核苷、酚类、酚类糖苷、硝基化合物、杂环化合物、环酮、抗菌素、磺胺、合成染料等十几类化合物。
荧光试剂Dansyl—C1(二甲基氨基萘磺酰氯)可与氨基酸结合成带有荧光的Dansyl —氨基酸。
Dansyl—氨基酸在酸性条件下可被乙酸乙酯萃取出来，经聚酰胺薄膜层析后斑点集中，仅10—9至10—10克分子即可被检识，所以灵敏度很高。
用作蛋白质末端基分析，比DNP氨基酸纸层析法灵敏度高100倍；用于氨基酸组成的微量分析，比茚三酮显色法灵敏度高10多倍。
聚酰胺薄膜层析的展层速度也比纸层析快得多，单向层层7厘米只需15—20分钟。
但用于定量，需要特殊仪器，目前多用于定性鉴定。
Dansyl—C1能与所有的氨基酸作用生成具荧光的衍生物。
第三章层析概论一、层析以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。
目前，这种方法已作为纯化或鉴定各种化合物的一种重要手段。
1903年俄国植物学家茨维特首先将碳酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤发现，各种色层彼此可分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，这就是早期的吸附层析碳酸钙细粉植物色素溶液石油醚洗涤二、层析类型层析方法可根据不同的标准分成若干类型：按流动相分类：液相层析和气相层析；按固定相“床”的形式分类：柱层析、薄板(层)层析、薄膜层析等等，详见表3~1。
三、层析常用术语1．固定相固定相是由层析基质组成的。
其基质包括：固体物质(如吸附剂、离子交换剂)液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。
2．流动相在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。
在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。
在薄层层析时，流动相又称展层剂。
3．操作容量即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量；一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。
(mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml)其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。
4．床体积(Vt)通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。
Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和，即:Vt = V0+ Vi + Vg(详见图3-1)5．外水体积(V0)外水体积指基质颗粒之间体积的总和。
6．内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。
7．基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。
