反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定

青岛农业大学毕业论文题目：反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定姓名：学院：动物科技学院专业：动物医学班级： 1001学号：20105254指导教师：温建新2014年6月5日反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定动物医学专业袁如意指导教师温建新摘要：从健康荷斯坦成年奶牛新鲜粪便中分离纯化出1 株疑似芽孢杆菌属菌株，编号为K。

对该菌株进行形态学观察、生化试验、药敏试验及安全性试验等。

试验结果表明，该菌菌体革兰氏染色阳性，芽孢染色为绿色，呈长杆状，芽孢中生，椭圆；能发酵糖醇，吲哚试验阳性，触媒试验阳性，能产生淀粉酶，并且可以液化明胶，生化试验结果表明K菌为枯草芽孢杆菌；该菌对链霉素、青霉素、诺氟沙星、四环素耐药性强，而对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星等抗生素表现敏感；动物安全试验表明，灌服浓度为1011cfu/mL菌液的小鼠精神状态良好，无死亡现象。

本试验为获得反刍动物的有益菌种及研制反刍动物微生态制剂奠定基础。

关键词：反刍动物；枯草芽孢杆菌；分离；鉴定Isolation and Identification of Bacillus subtilis Strains fromRuminantsStudent majoring in veterinary medicine Yuan RuyiTutor Wen JianxinAbstract：One bacillus strain was isolated and purified from the faeces of healthy Holstein named K. Morphological observation, biochemical tests, chemosensitivity test and security experiment were conducted. Experimental results showed that strain K Gram stain was positive, spore staining was green. Its shape was a long rod-shaped bacteria, and spores was oval . Common sugar alcohols could be fermented; Indole test was positive; Catalyst test was positive; It could produce amylase; It also could liquefy gelatin. Susceptibility testing showed that the bacteria strongly resisted to streptomycin, penicillin, norfloxacin,and tetracycline and that it was sensitive to gentamicin, kanamycin and ciprofloxacin. Animal safety trials showed that Mice fed bacterias 1011cfu/mL were in good condition and no mortality. therefore, the K was identified as Bacillus subtilis strain. So it provided theoretical basis for developing probiotic preparations.Key words: ruminants; Bacillus Subtilis; isolation; identification引言枯草芽孢杆菌是存在于动物肠道中的非致病需氧菌[1]，可降低肠道内氧浓度，产生的枯草菌素、多粘菌素、短杆菌肽等活性物质能显著降低肠道内大肠杆菌、沙门氏菌的数量，减少机体内致病菌[2]，改善了乳酸杆菌等厌氧菌的生长环境，增加有益菌，以此来保持肠道菌群的平衡，提高动物机体抗病能力。

微生物设计性实验枯草芽孢杆菌的分离及筛选第二小组组长：杨泽升组员：***叶宁霍克枯草芽孢杆菌的分离和筛选1 实验目的掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。

了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。

根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。

2 实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

需氧菌。

有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。

广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。

利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。

然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。

再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。

3实验材料3.1选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基，配方：牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g可溶性淀粉10.0g琼脂 20g蒸馏水 1000ml调整pH至7.2配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。

3.2溶液或试剂牛肉膏 1.25g蛋白胨 2.5g氯化钠 1.25g可溶性淀粉 2.5g琼脂 5g碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。

3.4仪器或其他用品平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。

枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，具有重要的应用价值，被广泛应用于农业生产中的抗病、增产、改善土壤等方面。

因此，对枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法进行研究具有重要意义。

以下将介绍枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法。

一、枯草芽孢杆菌分离方法：1. 样品采集：根据研究需要，选择合适的样品，如土壤、植物组织、水等。

采集样品时要注意避免外源性污染，尽量避免使用过多的抗生素。

2. 样品处理：将采集到的样品进行处理，如土壤样品需要经过悬浮液稀释法进行样品制备，植物组织需要进行消毒处理等。

3. 分离培养基选择：根据枯草芽孢杆菌的生长特性，选择合适的分离培养基。

通常可以选用液体培养基（如TSA、LB培养基）或固体培养基（如TSA、PDA培养基）。

固体培养基还可以添加适当的抑菌剂来抑制其他细菌的生长。

4. 分离培养：将样品制备好后，均匀涂布在选择的培养基上，然后进行培养。

液体培养基需要在适当的温度和速度下进行摇床培养，固体培养基需要静置培养。

培养时间一般为24-48小时。

5. 子培养：在培养基上出现孤立的菌落后，用离心管吸取菌落，再划线接种到新的培养基上，进行连续传代培养。

一般选择形态特征明显、菌落形状规则的菌落进行子培养。

6. 纯化：通过连续传代培养，最终获得纯种的枯草芽孢杆菌。

纯化的细菌可以通过形态观察、生理生化特性检测等方法进行初步鉴定。

二、枯草芽孢杆菌鉴定方法：1. 形态观察：观察菌落形态、色素、菌体形态等。

枯草芽孢杆菌的菌落通常呈乳白色或灰白色，形状为圆形或不规则形。

2. 胞内酶活性检测：通过检测枯草芽孢杆菌的胞内酶活性来鉴定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。

常用方法为利用不同培养基的酶基质进行相关酶活性检测。

3. 生理生化特性检测：包括对枯草芽孢杆菌的耐温、耐酸碱性、氧化还原反应等生理生化特性的检测。

4. 分子生物学鉴定方法：利用分子生物学方法，如PCR、16S rRNA基因测序等来鉴定枯草芽孢杆菌。

枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定方案3班第3组周三15:30-17:00周四08:30-09:50组长：刘晨阳组员：吕宛容，韩晴，董春燕，邢爽，高倩倩，薛琳琳，邵宇婷，吴子侥枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定一、目的要求1、掌握分离、纯化枯草芽胞杆菌的方法。

2、掌握如何鉴别所得菌是否为枯草芽胞杆菌的方法。

二、实验原理芽孢杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。

单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽胞0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽胞形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。

其分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。

由于其能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。

但是许多芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。

例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。

又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。

芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。

其菌落变化很大，芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。

在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。

菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。

芽孢杆菌能产生芽孢，芽孢具有较强的抗高温能力在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离纯化及生理生化鉴定得到芽孢杆菌。

猪源枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其生物特性研究袁林; 涂熠坤; 曾静; 郭建军【期刊名称】《《中国兽医杂志》》【年(卷),期】2019(055)005【总页数】5页(P9-13)【关键词】枯草芽孢杆菌; 分离; 鉴定; 16S rRNA; 菌株特性; 酶系分布【作者】袁林; 涂熠坤; 曾静; 郭建军【作者单位】江西省科学院微生物研究所江西南昌330096; 南京工业大学化学与分子工程学院江苏南京210000【正文语种】中文【中图分类】S852.42含有益生菌的微生态制剂能够改善因长期使用抗生素药物所带来的副作用,微生态制剂由于具有无药物残留、无毒副作用、细菌不产生耐药性等特点[1],且可以调节肠道微生态环境,防治动物肠道疾病,提高动物的抗病能力和生产性能[2],因此,在养殖行业具有广阔的应用前景。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一,因具有改善消化道内环境、促进动物生长、提高动物机体免疫力及产生多种酶类、提高消化酶活性等功能[3],故具有广阔的发展前景,并在饲料添加剂、生物农药、污水处理、疫苗载体等[4]各方面已经得到了广泛的应用。

枯草芽孢杆菌是一类好氧产芽孢的革兰阳性杆状细菌,无荚膜,有鞭毛,能运动,广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的体表,无致病性[5]。

由于枯草芽孢杆菌具有生长速度快、营养简单以及耐热、可产抗逆芽孢等突出特征,在微生态制剂生产加工等环境中的易存活、定殖与繁殖,成本较低,施用方便,储存期长[6],现作为一种无毒、无害、无残留、无抗药性的绿色饲料添加剂重要菌种之一。

但目前市场上大多数商品化的作为猪饲料添加剂的枯草芽孢杆菌都是从泥土和草地等自然环境中分离出来的,要想筛选出作为猪的饲料添加剂理想的菌种,应优选来源于猪肠道,经过与猪共生长期驯化的枯草芽孢杆菌,才能够更好地适应猪体内环境、发挥更好的效果[7]。

芽孢杆菌的筛选和鉴定的一般流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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枯草芽孢杆菌的分离及筛选微生物设计性实验枯草芽孢杆菌的分离及筛选1 实验目的掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。

了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。

根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。

2 实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

需氧菌。

有的菌株是α -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。

广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。

利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。

然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。

再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。

3 实验材料3.1 选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。

配方：牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g可溶性淀粉 10.0g琼脂 20g蒸馏水 1000ml调整 pH 至 7.2配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。

3.2 溶液或试剂牛肉膏 1.25g蛋白胨 2.5g氯化钠 1.25g可溶性淀粉 2.5g琼脂 5g碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克，100毫升0.01NHCL。

3.4 仪器或其他用品平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。

实验题目枯草芽孢杆菌的分离、纯化和鉴定一、实验目的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）广泛存在于土壤、植物根际体表等，其好氧、嗜温，极易分离与培养。

由于枯草芽孢杆菌生长快，具有广谱抗菌活性和很强的抗逆能力，并且对人畜无毒，不污染环境，因此已作为一种理想的生防菌广泛应用于多种植物病害的防治且备受关注。

本实验通过温度筛选法和选择性培养基筛选法分离枯草芽孢杆菌，并针对其生理生化特征进行纯化和鉴定及16S rDNA基因序列进行分析。

二、实验原理枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。

单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆倒柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

需氧菌。

可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。

广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。

枯草芽孢杆菌的分离方法：（1）温度筛选法：枯草芽孢杆菌能产生芽孢，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟，利用枯草芽孢杆菌的这一特性，可利用高温水浴使不能产生芽孢的细菌失去活性，得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。

（2）选择性培养基筛选法：枯草芽孢杆菌培养基的组分是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、碳酸钙等5种原料构成,将5种原料作为枯草芽孢杆菌培养有影响的因素,通过试验数理统计的直观和理论分析,对其配方进行优化，当培养基的配方为无水葡萄糖3.50g/L、蛋白胨0.83g/L、酵母膏0.50g/L、磷酸二氢钾0.35g/L和碳酸钙0.25g/L,温度(34±2)℃时,培养16h即可达到生长峰值。

枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的益生菌，具有广泛的应用前景。

为了进一步研究枯草芽孢杆菌的特性和应用价值，需要进行有效的分离和鉴定方法的研究。

本文将介绍一种常用的枯草芽孢杆菌分离与鉴定方法，以供参考。

一、枯草芽孢杆菌的分离方法1. 采集样品：选择环境中富含枯草芽孢杆菌的样品，如土壤、植物根际土壤等。

使用无菌采样器具采集样品，并尽量避免外界污染。

2. 处理样品：将采集得到的样品（如土壤）样品称重，加入适量的无菌生理盐水中，进行悬浮液的制备。

通过振荡或搅拌等方式使样品充分悬浮。

3. 稀释样品：将制备好的样品悬浮液进行适度的稀释，以获得合适的菌落形成数量。

常用的方法是制备10^-1至10^-6的稀释液，通过分别取不同稀释液进行接种。

4. 铺平培养：将适量的稀释液取出，均匀地涂布在菌落计数板上或含有适宜培养基的琼脂培养基平板上。

用冷热板或菌液器辅助涂布，注意避免产生气泡。

5. 培养条件：将铺平的培养板放入恒温培养箱，温度设定为适宜的生长温度，一般为30-37摄氏度，培养时间一般为24-48小时。

6. 菌落取样：在菌落形成后，使用无菌物质（如铂丝、无菌酒精灯火焰炙烧的铁丝等）挑选出单个菌落，并将其转移到新的琼脂平板上。

重复此操作，直到获得纯种的枯草芽孢杆菌。

二、枯草芽孢杆菌的鉴定方法1. 形态学观察：采用显微镜观察培养得到的枯草芽孢杆菌菌落和孢子的形态特征。

枯草芽孢杆菌形成的菌落通常为凹陷型或突起型，孢子则呈椭圆形，具有芽胞的特征。

2. 细胞染色：将培养得到的枯草芽孢杆菌菌落取出，进行细胞染色。

常用的方法是使用革兰氏染色和孢子染色。

革兰氏染色可用于观察细菌细胞的染色性质和形态特征，孢子染色则可用于观察细菌芽胞的形态特征。

3. 生理生化特征检测：通过生理和生化实验，检测枯草芽孢杆菌的一些代谢特征。

包括对碳源的利用情况、产酶的能力、乳酸发酵能力等。

常用方法包括碳源利用试验、酶活性测试、氧化还原试验等。

一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化一、引言枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的芽孢形成细菌，广泛存在于土壤、水体、植物表面等环境中。

枯草芽孢杆菌具有良好的免疫调节、抗菌、促生长等生物学特性，被广泛应用于农业、食品、医药等领域。

针对不同用途的需求，分离鉴定枯草芽孢杆菌并优化其发酵条件，能够提高其生物活性和产量，为其在实际应用中发挥更好的效果。

二、枯草芽孢杆菌的分离鉴定1.样品采集与处理首先，从自然环境、农田土壤或其他植物表面等样品中采集含有枯草芽孢杆菌的样品。

将样品带回实验室后，进行分离和处理，避免混杂其他细菌或真菌。

2.菌株分离将处理后的样品进行稀释，接种于富含培养基中，利用传统分离方法（如平板分离法、稀释平板法等）进行分离。

通过观察不同菌落形态和颜色，筛选出枯草芽孢杆菌单菌株。

3.生理生化鉴定对分离到的枯草芽孢杆菌进行生理生化鉴定，包括形态学观察、生长特性、氧化还原反应、产酶活性等。

利用生化试剂盒进行相关检测，确定菌株的生物学特性。

4.分子鉴定通过16SrRNA序列分析或蛋白质质谱鉴定等分子生物学方法，确认所分离到的枯草芽孢杆菌的属种分类，并与数据库中的已知菌株进行比对验证。

5.枯草芽孢杆菌存取将鉴定完成的枯草芽孢杆菌单菌株保存在甘油保存流质中，存放在-80°C低温冰箱中备用。

1.发酵基质的选择选择适宜的发酵基质对枯草芽孢杆菌的生长和代谢具有重要影响。

常用的基质包括葡萄糖、大豆粉、玉米粉等，可以根据具体需求进行配比调整。

2.发酵菌种培养条件通过扩种培养，将枯草芽孢杆菌预培养至指数生长期，然后接种至发酵罐中，保持较高的菌液浓度，有利于产酶和生长。

3.发酵条件的控制在发酵过程中，通过控制温度、pH值、通气速率、发酵时间等因素，调节菌体生长、产酶效率和产物生成速率。

通常，较适宜的发酵条件为温度37°C-42°C，pH值6.0-8.0，通气速率1.0-2.0L/min。

枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定一、目的：掌握芽孢杆菌属常见种的分离，鉴定方法和技术。

将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。

二、原理：芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。

，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。

三、材料和器皿：显微镜、培养皿（12个）、试管（12个）、三角瓶（5个）、烧杯、移液管（）、涂布棒（6个）、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、v.p.实验培养基、肉汤琼脂培养基孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇四、操作步骤菌种的分离和纯化（1）土壤的采集：取土壤表层5~10厘米下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋中带回实验室分离。

（2）平板的制备：融化三角瓶中的牛肉膏蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒入6个平板上。

（3）稀释分离法：秤取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15分钟，而后静止5分钟。

吸取上层液0.5ml加入到含有4.5ml的无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后分别吸取10-2和10-3土壤悬浊液个0.1ml滴加到上述牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每种稀释2皿，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1~2天。

（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部分菌落，然后在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是否是芽孢杆菌纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，置37℃培养1~2天备用。

菌种的鉴定1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）（1）单个菌种的形态（2）菌种形态的观察2.革兰氏染色3.芽孢染色4.菌体大小测验5.枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定一、淀粉水解一、原理许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将淀粉培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

枯草芽孢杆菌的分离及筛选枯草芽孢杆菌是一种常见的土壤细菌，广泛存在于自然环境中，可发酵多种有机物，在生物降解、环境清洁等方面有广泛应用。

本文将介绍枯草芽孢杆菌的分离及筛选方法。

一、土样采集与处理选择土壤样品时应注意，最好是新鲜土壤，不含过多杂质和残留农药、化学物质等。

首先，将土壤样品放入干净无菌试管中，并加入生理盐水，与搅拌器进行搅拌，使土壤悬浮于生理盐水中。

然后将其过滤，再将过滤液离心，离心后上清液即处理好的样品。

取样品1ml加入小培养皿中，加入适量的20%固体土壤样品，混匀后将其平均涂布于营养琼脂平板上，再进行孵育。

通常，孵育温度为30-37℃，培养基的选择可根据实验需要进行不同的调配。

通过枯草芽孢杆菌的鉴定，可判断其种类和特性。

可采用革兰染色法、形态学观察法、生理生化测定法等多种方法进行鉴定。

1. 革兰染色法：将菌落划入微滴水中，然后将其固定，加入革兰染色液，约定时间后用水冲净，用镜片沥干，用显微镜观察。

2. 形态学观察法：通过对菌落的形态、色素、形状、运动方式等特征进行观察，再与已知菌株进行对照，确定其种类和特性。

3. 生理生化测定法：可通过测定该菌株的生理生化特性，如酸碱反应、氧需求等，进一步确定其种类和特性。

1. 抗生素筛选：将分离得到的枯草芽孢杆菌接种于含有不同抗生素的墨汁琼脂平板上进行筛选，观察不同菌落的生长情况并记录，最终确定其抗性水平。

2. 发酵产物筛选：通过枯草芽孢杆菌的发酵产物、酶活性等特性，进行筛选。

将菌株接种于适当的发酵培养基中，培养一定时间后采集发酵产物进行分析。

3. 生化代谢产物筛选：通过分离并鉴定菌株代谢产物，确定其产物种类和达到的水平，寻找有价值的代谢产物。

综上所述，枯草芽孢杆菌的分离和筛选具有重要的应用价值，为生物降解、环境治理等领域开拓了新的途径。

希望本文对有关人员能够提供一些参考和帮助。

枯草芽孢杆菌的分离与鉴定枯草芽孢杆菌是一种常见的芽孢杆菌，广泛分布于土壤、水体等环境中。

该菌具有极强的抗逆性，可以在高温、低温、酸碱等各种恶劣环境下存活和繁殖。

此外，枯草芽孢杆菌还具有很高的代谢活性和生物学特性，被广泛应用于食品、医药、化工等领域。

枯草芽孢杆菌的分离和鉴定是研究其生物学特性和应用价值的重要步骤。

下面介绍一种常规的分离和鉴定方法。

1. 选择适宜的培养基和培养条件枯草芽孢杆菌是一种厌氧菌，通常需要选择富含营养物质和适宜的pH、温度等培养条件的培养基来进行分离和培养。

常用的培养基包括厌氧培养基、肉汤培养基、营养琼脂培养基等。

在选用培养基时，需根据研究对象和实验要求进行选择。

2. 样品处理和接种将样品收集到无菌容器中，并在避光下尽快送到实验室进行处理。

将样品加入适量的生理盐水或其他缓冲液中，进行适当的稀释后，从中取出一定量的液体或固体，接种到培养基上。

3. 培养和观察将接种好的培养基放置在适当的环境中进行培养，观察菌落的生长情况、形态特征等。

枯草芽孢杆菌通常在48小时内开始生长，生长后的菌落大小通常为1-3mm，形态呈不规则的肉眼可见点状或细菌丝状，表面为平滑或粗糙，颜色从白色到灰色等不等。

根据菌落的形态特征和大小、颜色等可初步判断是否为枯草芽孢杆菌。

4. 鉴定针对初步判断为枯草芽孢杆菌的菌株，需进行进一步的鉴定和鉴别。

常用的鉴定方法包括生理生化检测、生化反应检测、DNA序列分析等。

其中，生物化学检测可通过对菌落的形态、营养物质的利用情况、代谢产物等进行分析来进行鉴定。

在实验设计过程中，应该根据样品来源、实验需求来设计相应的检测方式，保证分离和鉴定的可靠性和准确性。

综上所述，枯草芽孢杆菌的分离与鉴定是菌类学研究和应用中的重要步骤。

只有凭借可靠的实验方法和技术流程，才能保证研究成果的准确性和可靠性。

基金项目：绿色环保型猪用饲料添加剂的研发与应用（2011-Y05）；吉林省现代农业产业技术体系建设专项；吉林省安全优质肉猪现代生产关键技术的研究（09ZDGG008）；吉林省科技厅项目（20140204069NY ）*通讯作者益生芽孢杆菌可产生脂肽、肽、磷脂、多烯、氨基酸、核酸等多种抑菌物质（Tan 等，2013；Chan -draleka 和Ramya ，2011；吕艳艳等，2011），具有广谱抑菌活性，且无毒、无副作用、无残留、无耐药性（Jacquet 和Grimal ，2012；Huyghebaet 等，2011）。

基于仔猪腹泻的病原性细菌以革兰氏阴性菌为主、发病率和死亡率较高的生产实际，本研究从健康仔猪肠道内分离拮抗革兰阴性菌的芽孢杆菌，经抑菌试验，耐受人工胃、肠液试验和安全性试验，获得了一株益生芽孢杆菌，为其生产应用奠定了基础。

1材料与方法1.1材料1.1.1菌种解淀粉芽孢杆菌（TR ）、大肠杆菌（CVCC200）、大肠杆菌（AT52）、大肠杆菌（JMS ）、金黄色葡萄球菌（K88）、白葡萄球菌（AK2）、耻垢分枝杆菌（mc2155）、新金分枝杆菌（NC18-1）、偶发分枝杆菌（NC19-2）、母牛分枝杆菌（NH55-2）、金新分枝杆菌（NC56-2）、黏质沙雷菌（jn01）、链球菌（CVCC100）、多杀性巴氏杆菌（CVCC500）、多杀性巴氏杆菌（PmA ），均为吉林农业大学预防兽医学实验室保存。

1.1.2主要试剂NaCl 、MgSO 4·7H 2O 、NH 4H 2PO 4、柠檬酸钠、酚红、猪胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶、KH 2PO 4、NaOH 、10%盐酸，均购自上海生工生物工程股份有限公司；DNA 凝胶回收纯化试剂盒，购自北京鼎国生物有限责任公司；质粒小提试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司。

人工胃液和人工肠液配制参考曹钰等（2006），略有改动。

1.1.3培养基LB 固体、LB 液体培养基和柠檬酸盐培养基按常规方法配制（周德庆，1986）。