1碱法提取质粒

实验一碱法提取质粒DNA一、目的掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。

二、原理从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。

碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。

首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，再加入溶液II（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主染色体DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。

然后用酚、氯仿多次抽提进一步纯化质粒DNA 。

氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。

再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿。

最后用75％乙醇溶液洗涤沉淀，以去除残留的盐离子。

最后获得的质粒DNA储存在TE溶液中，-20℃保存。

用于下一步凝胶电泳鉴定。

三、仪器设备、材料与试剂仪器设备恒温培养箱恒温摇床台式离心机高压灭菌锅制冰机电子天平pH计量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）一次性手套无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）玻璃棒称量勺微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）酒精灯灭菌的1.5 mL 离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL），相应的吸头盒吸水纸250mL三角瓶材料：含pKS质粒或pUC系列质粒的大肠杆菌。

碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。

以下是具体的实验原理和操作步骤。

实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。

接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。

最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。

操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。

在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。

2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。

使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。

将上清液倒掉，保留菌体沉淀。

3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。

轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。

4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。

这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。

5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。

上清液中含有蛋白质和其他污染物。

6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。

7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。

将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。

8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。

9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。

注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。

2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。

3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。

4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。

总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。

质粒提取原理及碱法质粒提取原理质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。

作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。

在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。

分离质粒DNA 有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。

在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。

所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型。

质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA；松弛开环的OC构型；超螺旋的SC构型。

由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。

道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间。

质粒小量提取之碱裂解法试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。

其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。

十二烷基磺进行质粒的小量制备。

十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

用SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。

由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH 值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。

实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。

下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。

2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。

3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。

通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。

4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。

5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。

6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。

7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。

8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。

9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。

10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。

11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。

12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。

实验一-碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。

质粒是一种裸露的、结构简单的小型环状DNA，它们存在于许多细菌细胞中，可以自主复制和表达。

质粒通常用于克隆和转化实验，是分子生物学实验中常用的工具之一。

一、实验目的通过碱裂解法提取质粒DNA，进一步了解质粒的基本性质和提取过程，为后续的分子生物学实验打下基础。

二、实验原理碱裂解法是一种利用细菌细胞壁和质粒DNA在不同pH值下稳定性的差异，将细胞壁和质粒DNA分离的方法。

在pH值高于7.5的环境下，细菌细胞壁的稳定性降低，而质粒DNA的稳定性相对较高。

通过加入碱液（如NaOH）并加热，可以破坏细菌细胞壁，使细胞内容物释放出来。

在pH值低于7.5的环境下，质粒DNA的稳定性降低，而细菌染色体DNA的稳定性相对较高。

通过加入高浓度的醋酸钾溶液并冰浴，可以沉淀出染色体DNA，而质粒DNA则留在上清液中。

三、实验步骤1.准备所需试剂和器材，包括细菌培养液、NaOH、KAc、冰浴、离心管、移液器等。

2.将细菌培养液倒入离心管中，用移液器加入适量NaOH，搅拌均匀。

3.将离心管放入沸水浴中加热5分钟，使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物。

4.用移液器加入适量KAc，搅拌均匀，使pH值降低至7.5以下。

5.将离心管放入冰浴中冷却10分钟，使染色体DNA沉淀出来。

6.用离心机将上清液和沉淀物分开，收集上清液。

7.在收集的上清液中加入适量的乙醇，放在-20℃冰箱中冷冻1小时，使质粒DNA沉淀出来。

8.用离心机将沉淀物和上清液分开，收集沉淀物。

9.用适量的TE缓冲液溶解沉淀物，得到质粒DNA溶液。

10.用紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度和质量。

四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过紫外分光光度计测定，得到质粒DNA溶液的浓度和质量。

通常，提取到的质粒DNA溶液需要有一定的浓度和质量才能进行后续的分子生物学实验。

2.数据分析：根据实验数据可以分析出提取到的质粒DNA溶液的质量和浓度是否符合要求。

碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。

现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。

在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。

质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。

有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。

目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。

细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。

根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。

每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。

按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。

一般分子量较大的质粒属严紧型。

分子量较小的质粒属松弛型。

质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。

常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。

pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。

如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。