实验一 碱法提取质粒DNA

实验一质粒DNA的制备一、实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

二、实验原理碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三、实验材料:大肠杆菌 DH5ɑ pET HIS四、仪器与主要试剂(一)仪器设备1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．台式离心机 4．高压灭菌锅(二)器材1． 1.5mL 离心管 2．枪头、枪三)试剂溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA 、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS（新鲜配制：0.8ml ddH2O,0.1ml 2mol/LNaOH,混匀，0.1ml 10% SDS混匀）溶液III： 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5、1 mmol/L EDTA五、实验步骤1.取DH5ɑ pET HIS大肠杆菌菌液于LB（含Amp）平板上37℃过夜培养；2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min 过夜培养；3.吸取1.5 ml菌液，12000 g离心5分钟，去上清（尽量将上清倒干净），收集菌体；4 加入100 μl溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；（剧烈）5.加入200 μl溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；6.加入150 μl溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；（温和）7.12000 g离心10分钟；取上清液400 μl（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf 管中8.加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，-20度2小时（或2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟）；9.12000 g 常温离心15分钟；10 倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；11.室温放置或超净台上风干DNA；12. 加20 μl灭菌超纯水或TE溶解；13.质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。

实验一碱法提取质粒DNA一、目的掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。

二、原理从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。

碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。

首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，再加入溶液II（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主染色体DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。

然后用酚、氯仿多次抽提进一步纯化质粒DNA 。

氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。

再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿。

最后用75％乙醇溶液洗涤沉淀，以去除残留的盐离子。

最后获得的质粒DNA储存在TE溶液中，-20℃保存。

用于下一步凝胶电泳鉴定。

三、仪器设备、材料与试剂仪器设备恒温培养箱恒温摇床台式离心机高压灭菌锅制冰机电子天平pH计量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）一次性手套无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）玻璃棒称量勺微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）酒精灯灭菌的1.5 mL 离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL），相应的吸头盒吸水纸250mL三角瓶材料：含pKS质粒或pUC系列质粒的大肠杆菌。

碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。

以下是具体的实验原理和操作步骤。

实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。

接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。

最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。

操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。

在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。

2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。

使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。

将上清液倒掉，保留菌体沉淀。

3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。

轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。

4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。

这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。

5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。

上清液中含有蛋白质和其他污染物。

6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。

7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。

将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。

8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。

9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。

注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。

2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。

3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。

4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。

总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。

质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。

三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。

2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。

3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。

5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。

6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。

实验一质粒DNA碱变性法小量提取南京大学生命科学院一、实验目的1、学习和掌握碱变性法快速提取质粒DNA的原理和方法2、学习如何用琼脂糖凝胶电泳法鉴定质粒DNA的纯度3、学习有关琼脂糖凝胶电泳的技术4、熟悉核酸染色的方法和DNA条带的观察二、实验原理质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。

天然的质粒都是环状双链DNA，大小从5kb到400kb不等。

质粒虽然独立于染色体外自主复制和遗传，但其复制又依赖于宿主编码的酶和蛋白质复制因子。

质粒按照其稳定拷贝数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒在每个细菌细胞中有1～5拷贝，松弛型质粒在每个细菌细胞中可达10～200个，甚至更多拷贝。

强碱性条件下，宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不易被破坏。

当条件恢复正常时，质粒DNA迅速恢复天然状态。

离心除去变性沉淀物，质粒DNA留在上清液中，用乙醇或异戊醇沉淀质粒即可得到较纯的质粒DNA。

琼脂糖凝胶电泳是基因工程最常用的技术，主要用于分离、鉴定和纯化DNA分子。

带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，成为电泳。

以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳方法已广泛用于核酸的研究中，DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及分子形态有关。

由于带电分子的分子量差异或分子形态不同，电泳时呈现迁移位置的差异。

电泳后用核酸染料染色，形成一种荧光络合物，凝胶中含有的DNA即可直接用254nm紫外线分析仪观察到绿色荧光条带。

三、实验仪器和试剂一）仪器：1、台式高速离心机2、漩涡振荡器3、低压电泳仪4、水平电泳槽及梳齿5、紫外投射仪二）药品：1、STET 溶液2、RNase A (10mg/ml)3、酚4、氯仿5、NaAc(pH 5.2)6、无水乙醇7、75％乙醇8、RNase A (2mg/ml)9、TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA pH8.0,10、溶液I ：50 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTA ，25 mM Tris-HCl pH8.011、溶液II: 0.2mol/L-NaOH, 1%SDS12、溶液III:乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)：60mL 的5mol/L KAc,11.5ml 冰醋酸，28.5mL O H 213、电泳级琼脂糖：1％琼脂糖凝胶14、电泳缓冲溶液（1×TAE）15、染料：GoldView 5μL/100mL凝胶四、操作步骤质粒提取1.取过夜培养的细菌液1.5ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100μl溶液I，10μL的RNase A 充分混匀；2.加入200μl新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（溶液II ），加盖颠倒6次使之混匀动作不可太大；3.加入150 μl乙酸钾溶液(溶液III)，加盖后颠倒6次混匀，动作不可以太大；4.12000rpm离心10min，将上清液转移至新的eppendorf管中，加入700μl无水乙醇；5.上清液中加酚抽提，振荡后10000rpm离心1min，吸300μL上清至新管中；同法用氯仿抽提一次，吸300μL上清至新管中，不足300μL加氯仿补足；6.上清中加2.2倍体积的无水乙醇，混匀后－20℃保存；7.12000rpm离心5min，弃去上清液，用1ml75％乙醇洗涤沉淀；8.12000rpm离心2min，弃去上清液，真空抽干后溶于30μLTE溶液。

实验一碱裂解法抽提质粒DNA[实验原理]质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。

宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。

质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（氨苄青霉素、四环素等抗性），利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。

质粒作为基因工程载体必须具备以下条件（1）复制子（ori）：一段具有特殊结构的DNA序列；（2）有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；（3）有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插入；（4）适当的拷贝数。

制备质粒载体是分子生物学的常规技术。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

[实验目的]1、掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。

2、掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。

[实验步骤]1、试剂配制（1）LB培养液10 g Tryptone，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。

实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。

下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。

2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。

3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。

通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。

4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。

5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。

6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。

7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。

8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。

9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。

10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。

11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。

12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。

实验一-碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。

质粒是一种裸露的、结构简单的小型环状DNA，它们存在于许多细菌细胞中，可以自主复制和表达。

质粒通常用于克隆和转化实验，是分子生物学实验中常用的工具之一。

一、实验目的通过碱裂解法提取质粒DNA，进一步了解质粒的基本性质和提取过程，为后续的分子生物学实验打下基础。

二、实验原理碱裂解法是一种利用细菌细胞壁和质粒DNA在不同pH值下稳定性的差异，将细胞壁和质粒DNA分离的方法。

在pH值高于7.5的环境下，细菌细胞壁的稳定性降低，而质粒DNA的稳定性相对较高。

通过加入碱液（如NaOH）并加热，可以破坏细菌细胞壁，使细胞内容物释放出来。

在pH值低于7.5的环境下，质粒DNA的稳定性降低，而细菌染色体DNA的稳定性相对较高。

通过加入高浓度的醋酸钾溶液并冰浴，可以沉淀出染色体DNA，而质粒DNA则留在上清液中。

三、实验步骤1.准备所需试剂和器材，包括细菌培养液、NaOH、KAc、冰浴、离心管、移液器等。

2.将细菌培养液倒入离心管中，用移液器加入适量NaOH，搅拌均匀。

3.将离心管放入沸水浴中加热5分钟，使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物。

4.用移液器加入适量KAc，搅拌均匀，使pH值降低至7.5以下。

5.将离心管放入冰浴中冷却10分钟，使染色体DNA沉淀出来。

6.用离心机将上清液和沉淀物分开，收集上清液。

7.在收集的上清液中加入适量的乙醇，放在-20℃冰箱中冷冻1小时，使质粒DNA沉淀出来。

8.用离心机将沉淀物和上清液分开，收集沉淀物。

9.用适量的TE缓冲液溶解沉淀物，得到质粒DNA溶液。

10.用紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度和质量。

四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过紫外分光光度计测定，得到质粒DNA溶液的浓度和质量。

通常，提取到的质粒DNA溶液需要有一定的浓度和质量才能进行后续的分子生物学实验。

2.数据分析：根据实验数据可以分析出提取到的质粒DNA溶液的质量和浓度是否符合要求。

姓名系年级学号科目分子生物学实验题目质粒DNA的提取——碱变性提取法组别周一一、实验目的1．掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。

2．掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

二、实验原理碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分解和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。

在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。

当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。

这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。

溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。

由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。

质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

三、实验仪器和材料试剂仪器：恒温振荡培养箱，高温冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，不同型号吸头，微量移液管，三角瓶等菌体：含质粒puc19菌株 E.coli DH5α受体菌试剂：LB培养基，氨苄青霉素AP，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液1X，上样缓冲液。

四、实验步骤1.含质粒puc19菌株的培养及收获E.coli DHSα（puc19）→LB培养基+AP→37°c 12~16h→LB培养基+AP→37°c 4~6h→500μl管称重(14.239g) →取菌液300μl→配平离心6000转5min→弃清→加5ml Sol I混匀→6000转5min→弃清→称重(菌体与离心管总重量为14.425g)→菌体称重（0.187g）2. 细胞裂解提取质粒DNA加Sol I 2ml 菌体漩涡混匀，冰浴5min加Sol II 2ml 轻柔颠倒混匀，冰浴5min加Sol III 1.5ml轻柔颠倒混匀，冰浴5min平衡，12000转15min→转上清至新50ml管（V1=8.8ml）加（2V1=17.6ml）冰乙醇，颠倒混匀→-20°c 30min12000转15min→弃上清→5ml 70%乙醇洗涤12000转2min→弃上清→重复洗涤一次→37°c 5min1mlTE溶解→粗提物3.质粒DNA的纯化1.0ml粗提物+100μg RNaseA→37°c 1~2h→等分500μl x2份→加等体积分液，混匀→12000转姓名系年级学号科目分子生物学实验题目质粒DNA的提取——碱变性提取法组别周一5min→转上清至新管→加等体积酚，氯仿异戊醇→12000转5min→转上清至新管→加等体积氯仿异戊醇混匀→12000转5min→转上清于新管→加1/10体积=22.0μl 3M NaAc，混匀，此时两管中液体体积均为242μl→加2倍体=484μl的积冰乙醇混匀→-20°c 30min→12000转15min→弃上清→70%乙醇500μl洗涤→12000转2min→弃上清→重复洗涤一次→37°c 5min→25μl TE管溶解→共50μl质粒DNA/组4. 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA五、实验结果1.本次试验电泳条带还算清晰，点样处有亮带，说明有杂蛋白2.染色体DNA条带比较暗，说明含量很低，提取样品纯度还算理想3.与marker比较我们提出的质粒分子量在范围之内4.与未添加RNase相比较，我们未出现模糊条带，证明RNase效果明显且操作方法正确5.出现RNA条带可能的原因是RNase反应时间不够或者反应混合不充分造成六、注意事项1.酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。

一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和操作步骤。

2. 熟悉实验过程中所使用的仪器和试剂。

3. 学习质粒DNA的纯化和检测方法。

二、实验原理碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法，其原理基于质粒DNA与染色体DNA在变性和复性过程中的差异。

在强碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

而质粒DNA由于具有共价闭合环状结构，其氢键断裂后，两条互补链仍保持一定程度的结合。

当pH值调节至中性时，质粒DNA能够迅速复性，而染色体DNA则不能复性，形成缠连的网状结构。

通过离心，可以将复性的质粒DNA与未复性的染色体DNA及其他杂质分离开。

三、实验材料1. 仪器：恒温摇床、台式离心机、微量离心管、移液器、电泳仪、凝胶成像系统等。

2. 试剂：LB液体培养基、含质粒的大肠杆菌、溶液I（50 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2 mg/mL溶菌酶）、溶液II（200 mmol/L NaOH、1% SDS）、溶液III（3 mol/L NaAc，pH 4.8）、TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L EDTA）、无水乙醇、70%乙醇、琼脂糖、溴化乙锭（EB）等。

四、实验步骤1. 将含质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养。

2. 取适量菌液，8000 rpm离心2分钟，收集菌体。

3. 将菌体沉淀用溶液I重悬，加入溶菌酶溶液，室温放置10分钟。

4. 加入溶液II，混匀，65℃水浴10分钟。

5. 加入溶液III，混匀，室温放置5分钟。

6. 12,000 rpm离心10分钟，收集上清液。

7. 向上清液中加入等体积的无水乙醇，混匀，室温放置15分钟。

8. 12,000 rpm离心10分钟，收集沉淀。

9. 用70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm离心5分钟。

10. 弃去洗涤液，将沉淀溶解于TE缓冲液中。

实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测一、实验目的与原理简介实验背景：质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。

质粒作为载体应具备下列四个特点：①有足够的容纳目的基因的幅度,并且对于携带的目的基因能够借助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。

②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选。

③与宿主细胞有相同一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等).④拷贝数多，易于宿主细胞的DNA分开,便于分离提纯。

分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤:培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

实验原理：碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。

在强碱性pH时,染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构,经过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。

实验目的：提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。

二．实验试剂1，SolⅠ100ml: 1M Tris-HCL（pH8。

0）2.5ml，0.5M EDTA 2ml， DDW 91ml， 20％葡萄糖4。

5ml( 葡萄糖单独灭,灭完后加入Sol I中)，高压灭菌，4°保存。

2,SolⅡ100ml：（新鲜配制，常温使用)10% SDS 50ml， 2M NaOH 50ml。

使用前将两种溶液混合。

3，SolⅢ 500ml：KAc 147g， HAc57。

5ml，加300mlDDW搅拌，定容至500ml。

高压灭菌，4°保存。

4，70%乙醇无菌水DDW5，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫.酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套.三、实验步骤按1/100的比例接种保存的9K质粒大肠杆菌克隆菌种到3 mL的含有适当抗生素LB培养基，37℃、180rpm培养过夜或培养12小时以上,活化菌种(至对数生长期)。

质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。

通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。

此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。

这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。

7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。