蛋白质电泳相关试剂、缓冲液的配制

蛋白相关试剂、缓冲液的配制方法20% （W/V） Glucose配制量100ml配制方法:1. 称取20 g Glucose置于100～200 ml烧杯中，加入约80 ml 的去离子水后，搅拌溶解。

2. 加去离子水将溶液定容至100 ml。

3. 高温高压灭菌后，4℃保存。

0.5 M EDTA （pH8.0）配制量1 L配制方法:1. 称取186.1 g Na2EDTA•2H2O，置于1 L烧杯中。

2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌。

3. 用NaOH调节pH值至8.0（约20 g NaOH）。

4. 加去离子水将溶液定容至1 L。

5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。

6. 室温保存。

注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。

1 M DTT配制量50ml配制方法:1. 称取7.71g DTT，加入到100ml烧杯中。

2. 加50 ml的0.01 M NaAc（pH5.2），溶解后根据使用情况0.22um滤膜过滤除菌。

3. 适量分成小份后，-20℃保存。

30%丙烯酰胺（29：1）配制量1 L配制方法:1. 量取下列溶液，置于1 L烧杯中。

Acrylamide 290gBisacrylamide 10g2. 向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 加去离子水将溶液定容至1 L，用0.45um滤膜滤去杂质。

4. 于棕色瓶中4℃保存。

注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。

聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液组份浓度 0.125 M Tris, 1.25 M Glycine,0.5%（W/V）SDS配制量 1 L配制方法：1．称量下列试剂，置于1 L烧杯中。

2．取下列溶液，加入烧杯中。

Tris 15.1gGlycine 94gSDS 5g3. 加入约800 ml的去离子水，搅拌溶解。

SDS-PAGE电泳试剂配制SDSPAGE 电泳试剂配制在生物化学和分子生物学的研究领域中，SDSPAGE 电泳是一种常用的技术手段，用于分离和分析蛋白质。

而要成功进行 SDSPAGE 电泳实验，准确配制各种试剂是至关重要的一步。

接下来，让我们详细了解一下 SDSPAGE 电泳试剂的配制方法。

首先，我们来谈谈分离胶缓冲液的配制。

分离胶缓冲液通常使用TrisHCl 缓冲液，其 pH 值一般在 88 左右。

配制时，我们需要称取一定量的 Tris 碱，然后加入适量的浓盐酸进行调节 pH 值。

这个过程需要用到 pH 计来精确测量，以确保 pH 值的准确性。

一般来说，每升分离胶缓冲液中，Tris 的用量约为 1815g，而浓盐酸的用量则需要根据实际测量的 pH 值进行调整。

接下来是浓缩胶缓冲液的配制。

浓缩胶缓冲液的 pH 值通常为 68，同样使用 TrisHCl 缓冲液。

配制方法与分离胶缓冲液类似，但 Tris 的用量和浓盐酸的用量有所不同。

每升浓缩胶缓冲液中，Tris 的用量约为 606g，浓盐酸的用量也需要根据实际 pH 值测量结果进行微调。

然后是 30%丙烯酰胺溶液的配制。

这是 SDSPAGE 电泳中的关键试剂之一。

丙烯酰胺是一种有毒物质，在配制过程中需要特别小心。

我们将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按照 29:1 的比例混合。

称取 29g 丙烯酰胺和 1g 甲叉双丙烯酰胺，加入适量的去离子水，搅拌溶解后，定容至 100ml。

需要注意的是，丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套在通风橱中进行。

SDS 溶液的配制也不能马虎。

SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂。

称取 10g SDS，加入适量的去离子水，加热搅拌溶解后，定容至 100ml。

10%过硫酸铵溶液是引发丙烯酰胺聚合的重要试剂。

称取 1g 过硫酸铵，加入 10ml 去离子水，现配现用。

因为过硫酸铵溶液不稳定，容易分解，所以不宜长时间保存。

电泳缓冲液也是必不可少的。

SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。

(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。

（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。

（4）10% SDS（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。

（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。

c．染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。

1 蛋白质电泳试剂配制1）2M Tris-HCl(pH=8.8) 100ml称24.2gTris-base 加50ml ddH2O,加浓HCl至pH=8.8（约4ml），加ddH2O定容至100ml。

2）1M Tris-HCl(pH=6.8) 100ml称12.1gTris-base 加50ml ddH2O,加浓HCl至pH=6.8（约8ml），加ddH2O定容至100ml。

3）10%（W/V）SDS 100ml称SDS10g，加ddH2O定容至100ml。

4）50%（V/V）甘油100ml量取50ml100%甘油，加ddH2O定容至100ml。

5）4×分离胶缓冲液100ml（B液）75ml 2M Tris-HCl(pH=8.8) 1.5M4ml 10%SDS 0.4%21ml ddH2O4℃保存6） 4×堆积胶缓冲液100ml（C液）50ml 1M Tris-HCl(pH=6.8) 0.5M4ml 10%SDS 0.4%46ml ddH2O4℃保存7) 丙烯酰胺储存液100ml（A液）30%（W/V）丙烯酰胺29.2g0.8% 甲叉双丙烯酰胺0.8g加ddH2O40ml缓慢搅拌至粉末完全溶解，定容至100ml，过滤，4℃保存。

8） 5×样品缓冲液10ml600ul 1M Tris-HCl(pH=6.8) 60mM5ml 50%甘油25%2ml 10%SDS 2%500ul 2-巯基乙醇（DTT）14.4 mM1ml 10%溴酚兰900ul ddH2O4℃保存9）10%过硫酸铵（APS）称0.1294g ddH2O溶解，-20℃保存。

10）5×电泳缓冲液Tris-base 15g 25 mM （1×）甘氨酸94g 192 mM（1×）SDS 5g 0.1% （1×）加ddH2O至1L，pH=8.3左右，室温长期保存。

11）考马斯亮兰染色液考马斯亮兰R-250 1.0g甲醇450mlHAc 450mlddH2O 100ml定容过滤，室温保存。