SDSPAGE电泳试剂配制

SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。

(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。

（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。

（4）10% SDS（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。

（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。

c．染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。

SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。

在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。

由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。

蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。

基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。

二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。

分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。

SDS-PAGE超详细实验步骤1定义SDS-PAGE：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中SDS为十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate），PAGE为聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electropheresis）；该电泳用于分离蛋白质和寡核苷酸。

1.1试验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质的静电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。

1.2试验相关设备与试剂配制1.2.1相关设备(1)电泳仪(2)凝胶成像仪(3)干浴器(4)微型离心机(5)电泳槽1.2.2试剂配制(1)染色液：用量筒分别量取250ml甲醇或乙醇、80ml乙酸；用电子天平称取考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml蓝盖瓶中（加入顺序为考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸），用纯化水补足至1000ml，充分混合均匀后进行用滤纸过滤，收集滤液备用。

（当过滤速度变慢时及时更换滤纸，快速过完，不可隔夜以免影响染色效果）(2)脱色液：用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml纯化水加入烧杯中，待溶液混合均匀后加入蓝盖瓶中。

(3)1X电泳缓冲液：分别用量筒量取10X电泳缓冲液100ml、900ml纯化水加入烧杯中，混合均匀既得。

（注：以上甲醇、乙醇、乙酸均用分析级试剂，纯度>95.0%）1.3电泳试验步骤1.3.1电泳胶配制（配方如表1）：表1分离胶浓度(10ml) 6%(ml) 8%(ml) 10%(ml) 12%(ml) 15%(ml) 去离子水 5.4 4.7 4.1 3.4 2.4 30%Acrylamide mix 2.0 2.7 3.3 4.0 5.04X Resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 10%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.110%APS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1TEMED 0.008 0.006 0.004 0.004 0.004 表2堆积胶(ml) (ml)去离子水 6.930%Acrylamide mix 1.78X Stacking-gel buffer 1.2510%SDS 0.110%APS 0.1TEMED 0.01按照表1配方将所需浓度的分离胶配置好（加入顺序由上到下），加入到电泳胶配胶板中（约3/4配胶版高度），加入5mm高的纯化水，等待30-60min使分离胶凝固（可微微倾斜看胶面是否凝固聚合）。

SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。

二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。

三. 职责：质量控制部。

四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。

tube、tip一次性使用。

六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。

八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。

贴上标贴，4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。

贴上标贴，4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。

贴上标贴，避光4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。

贴上标贴，-20℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。

Tricine-SDS-PAGE 实用方案Tricine-SDS-PAGE是用于分离分子量在1-10kD的肽类用的。

一、 试剂配配制：1．Low Bis acrylamide（49.5% T, 3% C）Acylamide 48.0gBis 1.5gWater make up to 100ml2.High Bis acrylamide (49.5% T, 6% C)Acrylamide 46.5gBis 3.0gWater make up to100ml3.Gel Buffer (3M Tris/cl, PH8.45, 0.3% SDS)SDS 0.3gTris 36.4gWater make up to 100mlPH to 8.45 with HCL注: 3M Tris 配制时不容易溶解,因此配制时我配制了2M Tris,配方如下:Tris 36.4gSDS 0.3gWater make up to 150ml4.Anode (Lower) buffer 阳极缓冲液 (0.2M Tris/cl, PH8.9)Tris 12.11gWater make up to 500mlPH to 8.9 with HCL5.Cathode (Upper) buffer 阴极缓冲液 (0.1M Tris/cl, 0.1M Tricine, 0.1% SDS, PH 8.25)Tris 6.06gTricine 8.96gSDS 0.5gWater make up to 500ml注:不用调PH值6.4×Tricine SDS Sample buffer 4×上样缓冲液(Final concentration: 0.05M Tris/cl, 4% SDS, 12% glycerol, 200mM DTT, 0.01%8×Tris.cl/SDS PH 6.8 2mlGlycerol 4.8mlSDS 1.6gCommasie Blue G 250 4mgWater make up to 10ml注:8×Tris.cl/SDS PH 6.8配方Tris 6.05gSDS 0.4gWater make up to 100mlPH to 6.8 with HCL二、 胶的配制1.16.5% T 6% C separating gel 30ml49.5% T 6% C 10mlGel buffer 15mlGlycerol 3.2mlWater 1.8ml2. 10% T 3% C spacer gel 30ml49.5% T 3% C 6.1mlGel buffer 15mlWater 8.9ml3. 4% T 3% C stacking gel 12.5ml49.5% T 3% C 1mlGel buffer 4.65mlWater 6.85ml注: 用Bio-Rad系统, 0.75mm的胶,separating gel 配3ml, 加2.5ml; Spacer gel 配1ml,加0.7ml;Stacking gel 配1.25ml. 灌胶前临时加10%AP（过硫酸铵）和TEMED.胶配制的通用配方:16.5% T , 6% C separating gel (ml)30 6 8 1049.5% T 6% C 10 2 2.6667 3.3333Gel buffer 10 2 2.6667 3.333350% Glycerol 6.4 1.28 1.7067 2.1333water)3.6 0.72 0.96 1.2DTW(distilled0.02670.03330.0210%AP 0.10.00330.0027TEMED 0.010.00210% T 3% C Spacer gel (ml)51.66671.333313%C 1.05 0.21 0.28 0.35T49.5%buffer 1.65 0.33 0.44 0.55Gel0.76670.6133DTW 2.30.46AP 0.0165 0.0033 0.00440.005510%TEMED 0.00165 0.0003 0.0004 0.00064% T 3% C Stacking gel (ml)2.08331.66676.251.2549.5% T 3% C 0.5 0.1 0.1333 0.1667Gel buffer 1.55 0.31 0.4133 0.5167DTW 4.2 0.84 1.12 1.40.01330.01670.0110%AP 0.050.00170.0013TEMED 0.0050.001三、 电泳参数及染色脱色1.用Bio-Rad mini 电泳装置进行电泳. 30V 电泳1hr, 100V至电泳结束2.固定, 染色及脱色: 小分子量肽类在SDS-PAGE胶中容易扩散,因此电泳结束后, 有时需要固定20min (固定液乙醇), 再进行染色20-30min (染色液: 50%甲醇, 10% 乙醇在脱色液 (45% 甲醇, 10% 冰醋酸)脱色20-30min; 脱色完毕,把胶放在水中或10%甘油中.四、 电泳示例照片。

SDS-PAGE电泳的操作规程一、样品处理取适量体积的样品溶液（样品含约为0.5-5ug），加入5×样品缓冲液，用振荡器混匀，于95℃水浴中煮5分钟，并于离心机中12000r/min离心5分钟待上样用，煮完后室温冷却。

非还原不用煮。

二、配制凝胶溶液和灌胶A、预先计算好所需浓度胶的体积及配胶所需要的各种试剂的体积，按这些数据依次加入试剂并混匀，然后灌入预先装好并且用双蒸水试漏过的板层中（先是分离胶），在胶的上面加一小层水饱和的异丁醇，置于平整的桌面让其自然凝固。

B、待分离胶凝固后（以胶与异丁醇界面有折射为准），到掉上层的异丁醇，用双蒸水冲洗三次并用吸水纸吸干。

然后灌入预定浓度的、按步骤A配制的浓缩胶，插入加样梳（注意赶走气泡），平置于水平桌面，自然凝固。

C、待凝固后，放置1小时使胶充分交联凝固。

三、电泳1、拔掉梳子，用双蒸水冲洗加样孔，去除杂质及未凝固的胶溶液，然后装好电泳装置，加入电泳缓冲液（如阴阳极缓冲液不同，需要分别加入相应的缓冲液，另外，阴阳极电泳缓冲液不要混在一起）2、用20ul的微量加样枪上样。

3、电泳开始时，恒压模式下用80V的电压电泳，待指示剂溴酚蓝进入分离胶时，把电压提高到130-150V左右，直到溴酚蓝快走出分离胶时，终止电泳，切断电源，拆下凝胶分别切下上、下角标记胶的方向及区别是哪一块胶。

4、清洗胶架、玻璃及其他附件。

四、染色、脱色及结果的分析与保存1、把剥下的胶浸入染色液中，放在脱色摇床上摇1小时。

2、取出凝胶块，用蒸馏水冲洗干净，然后置于脱色液中脱色，摇荡脱色直到底色基本脱完。

3、脱完色的胶用凝胶成像系统照相并进行数据分析处理。

一、试剂的使用与管理1、30%的丙烯酰胺贮存液（棕色瓶中保存）、pH8.8的缓冲液、PH6.8的缓冲液、10%的AP、TEMED用完后请放回4℃冰箱。

2、2×上样缓冲液，用完后请存放于-20℃冰箱的指定位置。

3、中分子量marker请按照说明书配制，配制后于95℃水浴中煮5分钟，冷却后离心，分装到eppendorf管中，每管10 U L。

试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml）(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。

可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。

过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液。

6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

器材电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。

样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。

放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样。

电泳1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddHO冲洗数次，再用乙醇擦2拭，晾干；2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；3. 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；O 3.0 ml ddH21.0 mol/LTris-HCl pH=8.82.1 ml30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul10%AP 56 ul TEMED 6 ul4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；5. 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；O 2.0 ml ddH21.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 400 ul30% Acr-Bis 600 ul 10% SDS 36 ul10%AP 24 ul TEMED 4 ul6. 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;8. 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr；9. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm 脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。

SDS-PAGE 测量蛋白分子量所需试剂及仪器：试剂：丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris-base，TEMED，SDS，过硫酸铵，甘油，溴酚兰，甘氨酸，DTT，考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker5只（50ul装），小牛血清白蛋白10mg。

仪器设备：电泳仪、槽、板5套；10ml小烧杯10只，微量移液器5把，普通移液器5套，足量滤纸，0.45μm滤器。

母液：1、2M Tris-HCL (pH8.8)100ml：24.2g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH8.8，最后定容至100ml。

高压灭菌处理。

2、1M Tris-HCL (pH6.8)100ml：12.1g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH6.8，最后定容至100ml。

高压灭菌处理。

3、10%SDS100ml：10gSDS，加入70ml蒸馏水在60℃搅拌溶解，待泡沫消失后，定容至100ml。

4、50%（w/v）甘油100ml：50ml甘油，50ml蒸馏水，混匀即可。

5、1%（w/v）溴酚兰10ml：100mg溴酚兰，蒸馏水定容至10ml。

6、0.01mol/L乙酸钠溶液100ml：0.139g乙酸钠溶于100ml蒸馏水中，调pH至5.2。

7、1M DTT20ml：20ml0.01mol/L乙酸钠溶液溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml/份，-20℃保存。

工作液：1、30%聚丙酰胺母液（A液）实际需要250ml100ml：丙烯酰胺29g，双丙烯酰胺1g，去离子水在37℃溶解，定容到100ml。

0.45μm滤器过滤除菌，棕色瓶保存。

pH≤7.0。

2、4×分离胶缓冲液（B液）100ml： 75ml 2M Tris-HCL (pH8.8)4ml 10%SDS21ml蒸馏水4℃存放。

3、4×浓缩胶缓冲液（C液）100ml： 50ml 1M Tris-HCL (pH6.8)4ml 10%SDS46ml蒸馏水4℃存放。

实验十一SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子质量一、目的要求学习和掌握采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子质量的基本原理和方法。

二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合交联形成的三围网状结构。

通过改变单体Acr浓度或单体与交联剂的比例可以控制凝胶孔径的大小，这取决于两个重要的参数T和C，其中T是两个单体（Acr和Bis）的总百分浓度，C是与总浓度有关的交联百分浓度。

T=（a+b）/m×100(%) C=b/(a+b)×100(%)式中，a为Acr质量（g）；b为Bis质量（g）；m为水或缓冲液的终体积（mL）。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续系统两种。

在连续系统中，电泳槽中缓冲液的pH与凝胶中一致，而在不连续系统中上述两者的pH不相同，不连续系统的分辨率较高。

从凝胶形式上可分为柱式或板式。

将凝胶装于垂直的玻璃管中进行电泳分离称柱式电泳，此法制备凝胶方便，样品需要量少，凝胶条便于长期保存；板式电泳的优点是可以在同一凝胶板上同时检测盒比较多个样品，在平板电泳的基础上还建立了分辨率更高的双向电泳。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统具备三种效应，因此大大提高了分辨率。

(1)浓缩效应：在电泳开始时，样品在浓缩胶与分离胶界面上形成了高度压缩的薄层，作为在分离胶中进一步分离的起始样层，有时甚至能浓缩几百倍。

(2)电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带。

由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的蛋白质区带。

(3)分子筛效应：当蛋白质分子通过浓缩胶进入分离胶时，颗粒小、呈球形的样品分子移动快，柯利达、形状不规则的分子在通过凝胶空洞时的阻力大，移动就缓慢。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质分子的主要极力为上述的电荷效应和分子筛效应，即这些分子所带净电荷的差异和分子质量大小的不同。

SDS-PAGE配胶试剂盒使用说明书Cat.No：Lot No：原理：本技术中，待分离的样品在有SDS-PAGE和还原剂的存在下通过加热而变性并被去污剂所包被。

SDS可使蛋白质带上大量的负电荷，其带电荷的多少正好与多肽的长度成正比。

聚丙烯酰胺凝胶上样后，在高电压的作用下，蛋白组分向正极（阳极）迁移。

由于所有的蛋白所带的负电荷与其分子大小成正比，因而蛋白就仅仅根据其分子量的大小不同而被分离—凝胶的分子筛效应。

蛋白质的分子量就可以通过与标准蛋白的凝胶迁移率进行比对而得到。

凝胶电泳后，特定的凝胶条带可以通过染色而观察到，并且可通过被动扩散或电洗脱从凝胶上进行回收。

两种最常用的染色方法是考马斯亮蓝法和银染法，这两种方法的蛋白条带检测灵敏度可分别达到50ng和5ng。

由于考马斯亮蓝法使用简便，并可以对收集的蛋白带作进一步分析，因而较为常用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳应用范围：1）蛋白质纯度的分析；2）蛋白质分子量的测定；3）蛋白质浓度的测定；4）蛋白质水解的分析；5）免疫沉淀蛋白的鉴定；6）免疫印迹的第一步；7）蛋白质修饰的鉴定；8）分离和浓缩用于产生抗体的抗体的抗原；9）分离放射性标记的蛋白质。

试剂盒组成：1．30%预制聚丙烯酰胺胶（4℃保存）200ml2．1.5M TrisCl（PH=8.8）200ml3．1.0M TrisCl（PH=6.8）50ml4．10%SDS 30ml5．10%过硫酸铵（4℃保存）30ml6．去离子水250ml7．TEMED（4℃闭光保存！）1ml8．5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液250 ml9．考马斯亮蓝染色剂50ml10. 考马斯亮蓝脱色剂250ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液用时以去离子水1：4稀释，配成1×-甘氨酸电泳缓冲液工作液。

凝胶的配制：（1）将玻璃板安装固定好切误把玻璃弄坏（2）进行分离胶的配制（3）加入TEMED后立即混匀内容物倒入到固定好的玻璃板中，同时留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm）再在胶液面上小心注入一层水（约2—3mm高）以排除气泡和阻止氧气进入凝胶溶液。

SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

.SDS-PAGE1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围胶6%50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD胶12%12-60kD15%胶10-40kD.'.成分分离胶所需各成分的体积（毫升）配制不同体积SDS-PAGE胶。

即可配制成非变性注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDSPAGE 冰箱放两周，但是最好新鲜配置效果好。

10%过硫酸铵配好后可以在4D ：(也称堆积胶、积层胶或上层胶)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶1)1L电泳缓冲溶液5XTris-Glycine0.5% W/V SDS ，1.25M Glycine 0.125M Tris，Tris 15.1 gGlycine 95 gSDS 5.0 g.'.5X SDS-PAGE 加样缓冲液：5ml250mM Tris-HCl (pH6.8), 10% SDS, 0.5% BPB, 50% glycerol, 5% 2-ME 1M Tris-HCl (pH6.8): 1.25 mLSDS：0.5 gBPB: 25mgGlycerol: 2.5ml2-ME: 使用时加入小份（25微升），新鲜使用。

TBST 缓冲液每2L体积中含：1M TrisHCL(pH7.5) 100mLNacl 16g0.4g KCL1ml吐温1)抗体去除液50mL抗体去除液中含：每6.25mL pH6.80.5M TrisHCL（）10mL 10%SDS0.175mL Beta-ME33.75mL 水.'.SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

sdspage蛋白电泳实验报告SDSPAGE 蛋白电泳实验报告一、实验目的本实验旨在通过SDSPAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）技术，对蛋白质样品进行分离和分析，以确定样品中蛋白质的分子量大小、纯度及相对含量。

二、实验原理SDSPAGE 是一种基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，能够根据蛋白质分子的大小进行分离。

SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，它能够使蛋白质分子变性并带上大量负电荷，从而消除蛋白质分子的电荷差异，仅依据分子量大小进行分离。

在电泳过程中，蛋白质分子在电场的作用下向正极移动，分子量小的蛋白质移动速度较快，分子量大的蛋白质移动速度较慢，从而实现分离。

通过与已知分子量的标准蛋白进行对比，可以确定待测蛋白质的分子量。

三、实验材料与设备1、材料蛋白质样品：＿____标准蛋白：＿____丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺SDSTris（三羟甲基氨基甲烷）过硫酸铵（APS）TEMED（N,N,N'，N'四甲基乙二胺）考马斯亮蓝 R-250 染色液脱色液2、设备电泳仪垂直电泳槽移液器离心机恒温水浴锅脱色摇床四、实验步骤1、凝胶的制备安装好垂直电泳槽，确保密封良好。

配制分离胶：根据所需浓度，计算出丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TrisHCl（pH 88）、SDS、APS 和 TEMED 的用量。

将上述成分依次加入到一个小烧杯中，充分混匀后，迅速灌注到电泳槽的两玻璃板之间，留出灌注浓缩胶的空间，然后在胶面上轻轻覆盖一层水，以促使凝胶聚合。

待分离胶聚合完成（约 30 分钟），倒掉覆盖的水，用滤纸吸干残留的水分。

配制浓缩胶：同样计算好各成分的用量，混匀后灌注到分离胶上方，并插入梳子，等待浓缩胶聚合（约 30 分钟）。

2、样品处理取适量的蛋白质样品，加入上样缓冲液（含SDS、β巯基乙醇等），在沸水浴中加热 5 分钟，使蛋白质变性。

离心去除沉淀，取上清液备用。

3、电泳将电泳槽放入电泳仪中，加入电泳缓冲液（Tris甘氨酸缓冲液，pH 83），使缓冲液没过凝胶。

SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤1.名称：SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳2.原理：此项技术的原理，是根据样品中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。

不同的蛋白质在不同的pH值下表现出不同的电荷，同时蛋白质具有不同的大小和形状。

为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理。

上样缓冲液由Tris-HCl （pH6.8）、甘油，10％SDS、β-巯基乙醇、0.1％溴酚蓝以及蒸馏水组成。

其各自的作用如下述：SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。

由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或者单个肽链，因此测定结果只是亚基或者单个肽链的分子量。

同时，SDS与蛋白质结合引起蛋白质的构象改变，形成长椭圆棒状，不同蛋白质短轴长度都一样，长轴随蛋白分子量不同而不同，这样就消除了性状的影响。

另外，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

甘油用以增大样品液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。

样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。

样品液和浓缩胶中Tris-HCl均为pH6.8,上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3）,分离胶含Tris-HCl(Ph8.8).电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。

产品说明书凝胶配制试剂盒SDS-PAGE（任意浓度）产品货号：P80111-KIT产品规格：50块胶（0.75mm）产品组分：组分编号试剂A试剂B试剂C试剂D试剂E试剂F试剂G名称上层胶缓冲液下层胶缓冲液30%Acr-Bis(29:1)10%SDSPAGE胶凝固剂PAGE胶促凝剂储存缓冲液（5×）含量50mL100mL100mL5mL0.5g0.6mL100mL储存条件4℃避光保存，有效期见外包装。

PAGE胶凝固剂（粉剂）：4℃保存时需拧紧瓶盖注意防潮，受潮后会很快失效。

PAGE胶凝固剂（粉剂）用水配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，半年内有效；配制好的凝胶请浸没在1×储存缓冲液（凝胶保存液）中，室温保存，6个月保质期。

产品介绍本产品采用Tris-甘氨酸凝胶体系，按照使用说明书操作，只需自备制胶器具和蒸馏水，加入促凝剂即可配成任意浓度的SDS PAGE凝胶。

操作简单，成本低。

本试剂盒约可配制50块常规大小的（0.75mm）SDS-PAGE凝胶。

具体可以配制的凝胶数量与凝胶厚薄、大小有关。

产品特点保质期长：改良配方，制备的SDS PAGE凝胶可在室温下保存半年以上；上样方便：可制备有颜色的上层胶，点样孔清晰易辨，方便点样；效果优秀：跑胶条带清晰，敏锐，蛋白分辨率高。

高效兼容传统的电泳/转膜液。

使用方法1.准备工作PAGE胶凝固剂（粉剂）溶于5mL蒸馏水中，将溶液分装为10管，0.5mL/管，于-20℃长期保存。

10%PAGE胶凝固剂（粉剂）溶液可在4℃保存一周。

2.分离胶的配制（1）根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶（即下层胶）：不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范SDS-PAGE分离胶浓度6%胶8%胶10%胶12%胶15%胶最佳分离范围50-150kD30-90kD20-80kD12-60kD10-40kD 如果样品蛋白分子量范围较广，建议使用梯度预制胶。