下载文档原格式
Kupffer 细胞在肝脏NK 细胞亚群稳态维持和分化成熟中的作用探究①张新宇 陈雅雯 陈永艳 田志刚 彭慧 （中国科学技术大学免疫学研究所，合肥 230027）中图分类号 Q28 文献标志码 A 文章编号 1000-484X （2023）05-0897-07［摘要］ 目的：探究Kupffer 细胞对肝脏NK 细胞的调控作用。
方法：利用荧光成像技术分析小鼠Kupffer 细胞和肝脏NK 细胞的位置关系；通过注射氯磷酸盐脂质体构建体内清除Kupffer 细胞模型，流式分选去除肝脏非实质细胞中的Kupffer 细胞进行体外共孵育实验；通过抗生素水饲喂清除小鼠肠道共生菌；利用流式细胞术分析肝脏NK 细胞亚群的比例、数量和成熟状态。
结果：稳态下Kupffer 细胞和肝脏NK 细胞存在共定位，清除Kupffer 细胞后肝脏驻留NK 细胞和经典NK 细胞数量减少；体内清除和体外共培养实验证实Kupffer 细胞可促进肝脏驻留NK 细胞和经典NK 细胞的成熟，而抗生素处理过的小鼠在清除Kupffer 细胞后，肝脏NK 细胞亚群的数量和成熟状态无显著变化。
结论：Kupffer 细胞有利于肝脏NK 细胞的数量维持，且以共生菌依赖的方式促进肝脏NK 细胞的成熟分化。
［关键词］ 肝脏NK 细胞；Kupffer 细胞；共生菌Roles of Kupffer cells in homeostatic maintenance and differentiation and maturation of liver NK cell subsetsZHANG Xinyu ， CHEN Yawen ， CHEN Yongyan ， TIAN Zhigang ， PENG Hui. Institute of Immunology ， University of Science and Technology of China ， Hefei 230027， China［Abstract ］ Objective ：To explore the regulation of liver NK cells by Kupffer cells. Methods ：Fluorescence imaging technology was used to analyze the positional relationship between mice Kupffer cells and liver NK cells. Kupffer cell depletion in vivo was estab⁃lished by injecting clodronate liposomes. The liver non -parenchymal cells without Kupffer cells used in co -culture experiments in vitro were obtained by using fluorescence -activated cell sorting. Mice were fed with antibiotics in the drinking water to deplete microbiota. Theproportion ， number and maturation of liver NK cell subsets were analyzed by flow cytometry. Results ：There is colocalization between Kupffer cells and liver NK cells at steady state ； depletion of Kupffer cells leads to decreased number of liver -resident NK and conven⁃tional NK cells ； Kupffer cells promote the maturation of liver -resident NK and conventional NK cells ， which was confirmed by deple⁃tion experiments in vivo and co -culture experiments in vitro ； however ， depletion of Kupffer cells in antibiotic -treated mice led to no significant changes in the number and maturation of liver NK cell subsets. Conclusion ：Kupffer cells contribute to the maintenance of liver NK cells and promote the maturation of liver NK cells in a microbiota -dependent manner.［Key words ］ Liver NK cells ；Kupffer cells ；Microbiotadoi ：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.05.001①本文为NSFC 重大研究计划项目（92042305）；国家重点研发计划项目（2022YFC2304502，2020YFA0804100）。
大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现毛德文;裴燕燕;王明刚【摘要】枯否细胞(Kupffer Cells,KC)是肝脏免疫防御的第一道防线,其与多种肝脏疾病密切关联.Kupffer细胞分离纯化技术要求较高,且该细胞分化增殖能力极弱,成为开展大规模细胞实验的主要障碍.课题组简化了Kupffer细胞分离纯化步骤,构PDS152_pLenti-GFP-IRES-SV40LT表达载体,包装形成慢病毒颗粒侵染Kupffer 细胞,侵染后细胞生长速度变快,能多次传代,细胞状态稳定,巨噬细胞特异性标志F4/80呈阳性表达.将SV40LT片段导入Kupffer细胞可实现细胞永生化,且转染后的kupffer细胞仍维持巨噬细胞的功能特性.【期刊名称】《大众科技》【年(卷),期】2017(019)012【总页数】3页(P35-37)【关键词】Kupffer细胞;SV40-LT片段;永生化;特性【作者】毛德文;裴燕燕;王明刚【作者单位】广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023【正文语种】中文【中图分类】Q2;R57枯否细胞（Kupffer cells，KC）是定植在肝脏的巨噬细胞，是肝脏非实质细胞的重要组成部分。
Kupffer细胞在肝脏固有免疫系统中发挥关键作者，是肝脏免疫防御的第一道防线。
Kupffer细胞与慢性肝炎、肝硬化及肝癌等多种肝脏疾病密切关联。
有效、快速分离Kupffer细胞，针对性开展功能与机制研究是探明不同致病因素对 Kupffer细胞影响及其与疾病相关性的基石。
但Kupffer细胞分离纯化技术要求较高，且关键在于Kupffer细胞分化增殖能力极弱，成为开展大规模细胞实验的主要障碍，课题组在实验中分离纯化了Kupffer细胞，且构建了一种永生化的细胞模型。
相关报道如下。
Wistar大鼠，SPF级，雄性，200～250g购于广西医科大学动物实验中心提供（SCXX桂2003-0001）。
Kupffer细胞标签一、Kupffer细胞简介Kupffer细胞是肝脏内最大的巨噬细胞裙，起着维护肝脏内稳态、清除血液中有害微生物和代谢产物等重要作用。
Kupffer细胞表面上的标签物质能够帮助识别这些细胞，进而对其功能进行研究，这些标签通常包括对细胞表面特异抗体的染色等。
二、Kupffer细胞标签的种类1. CD68标签：CD68是一种已知的巨噬细胞特异性标记物，在研究Kupffer细胞时常用于标识细胞的存在和数量。
2. F4/80标签：F4/80是巨噬细胞的一种细胞表面抗原，也是Kupffer 细胞的特异性标记物质之一。
3. CD163标签：CD163是单核-巨噬细胞的特异性表面标记，在进行Kupffer细胞相关研究时也常作为标签使用。
三、Kupffer细胞标签在研究中的应用Kupffer细胞标签的运用能够帮助科研人员迅速、准确地定位和识别Kupffer细胞，从而更好地开展相关研究工作。
利用CD68标签可以帮助研究者检测和定量Kupffer细胞的数量变化，进而观察其在肝脏疾病中的变化规律；而借助F4/80标签则可以更好地观察Kupffer细胞在肝脏免疫反应中的作用。
四、Kupffer细胞标签在临床中的意义Kupffer细胞在肝脏疾病的发生和发展中扮演着重要角色，因此对其进行研究不仅有助于从分子水平揭示疾病发生的机制，还可为相关疾病的临床治疗提供依据。
Kupffer细胞标签的运用所得到的研究结果可以为实验室与临床间的桥梁，为肝脏病变的诊断与治疗提供新思路和方法。
五、结语Kupffer细胞标签的使用在相关研究和临床中具有重要意义，它为科研人员提供了更多的研究方法和手段，有助于更好地了解Kupffer细胞的生物学特性、功能以及在疾病发生发展中的作用，其应用前景广阔，也为相关临床治疗提供了新的研究思路。
希望未来能够有更多的相关研究者投入到这一领域的工作中，为Kupffer细胞及其相关疾病的研究和临床治疗做出更大的贡献。
kupffer细胞培养注意事项1. 注重无菌操作：在进行kupffer细胞的培养过程中，保持实验环境的无菌状态是非常重要的。
使用无菌操作技术，如穿戴无菌手套、操作在无菌工作台下进行，以避免细菌和真菌的污染。
2. 选择合适的培养基和补充物：选择适合kupffer细胞生长的培养基，并根据实验需求添加适当的补充物，如生长因子、血清等。
培养基和补充物的选择将直接影响到细胞的生长和功能。
3. 细胞的处理和传代：处理kupffer细胞时，要避免对细胞造成过度机械和化学刺激，以免影响细胞的功能。
同时，在进行传代时，注意细胞的浓度和细胞悬液的稀释比例，以确保细胞的正常生长和传代效果。
4. 适当的温度和湿度：细胞培养的温度和湿度对细胞的生长和代谢具有重要影响。
维持适当的培养温度（一般为37°C）和湿度（通过培养皿内添加适量的水）有助于提高细胞的生存率和生长速度。
5. 注意培养皿的处理：培养皿的表面应保持洁净，避免污染细胞培养。
在进行细胞移植或处理时，避免过度摇动或振动培养皿，以减少细胞的机械损伤和静电影响。
6. 定期检测细胞污染：在培养过程中定期检测细胞的纯度和污染情况，避免细菌、真菌或其他污染物的存在。
使用合适的方法如细胞培养物中添加抗生素等，以确保细胞培养的质量和纯度。
7. 注意培养液的更换和配制：定期更换培养液，并遵循合适的配制方法和储存条件。
避免使用过期的培养液和补充物，以免影响细胞培养。
8. 增加培养时间的控制：根据实验需要，控制kupffer细胞的培养时间。
过长的培养时间可能会引起细胞的老化或功能的改变，因此及时收取和处理细胞培养物是重要的。
9. 严格遵守实验守则：在进行任何实验操作之前，首先熟悉并遵守实验守则和操作规程。
不得盲目进行实验操作，保证自己和他人的安全。
注意：本回答仅供参考，具体操作应根据实验室和研究要求进行，并按照相应实验守则和机构的规定进行操作。
1、小鼠肝脏Kupffer 细胞分离、纯化参照Tetsuya Abe等的方法并加以改进。
腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/kg），沿腹部正中做一约2cm 的切口，完全暴露门静脉，经门静脉置入18G 套管针，置入位置约距离肝门1cm，插入约0.8cm，4-0 丝线固定后，立即剪开下腔静脉，用无钙灌注液进行灌注，灌注速度约为10ml/min,同时剪开上腔静脉，灌注过程见图 1.1、图1.2。
灌注5min，共灌注无钙灌注液50ml/只，灌注后肝脏体积膨大、颜色变浅，解剖剪分离取下肝脏，去除结缔组织及胆囊，在75%的酒精里漂洗5s，然后用PBS 漂洗三次，以防污染。
放到盛有PBS 的50ml 无菌瓶中，每批细胞需要灌注3-5 只小鼠。
待所有小鼠肝脏灌注好之后，一起放到细胞培养皿中，用眼科剪剪碎，加入0.1% 四型胶原酶，每只约需5ml，放至37℃CO2培养箱，消化一小时，摇匀一次/15 min，并用移液枪轻轻吹打1min。
待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液后，过350 目滤网2 次，以去除未消化的组织块和结缔组织。
用15ml 离心管收集细胞悬液，300 rpm×3 min，离心两次，收集上清，可以去除大部分的小鼠肝脏细胞。
然后，1500 rpm×5 min，弃上清，收集沉淀，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 培养基悬浮细胞沉淀。
Percoll不连续密度梯度离心，2000g×20min，4℃；各层为上：细胞悬液2ml，中：25%Percoll 3ml，下：50%Percoll 3ml（用15ml 离心管，2-3 管/只）。
先将50%的Percoll液3ml 置于离心管底部，再沿着离心管管壁缓慢加入25%Percoll3ml在50%Percoll 液上面，最后沿着管壁缓慢加入细胞悬液2ml 于最上层，见图1.3 。
离心后可见四层区带：最上一层为细胞碎片；第二层为富含肝窦内皮细胞的区带；第三层为富含Kupffer 细胞的区带；第四层为积于管底的沉淀，主要是红细胞，见图1.4 。
－８８４・药学学报ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａＳｉｎｉｃａ２００８，４３（９）：８８４—８８９Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞在肝纤维化形成与转归中的作用吴俊烯＋，刘耕陶（中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所，北京１０００５０）摘要：肝纤维化是由于反复肝损伤引起持续性炎症反应、瘢痕组织形成，导致正常组织结构破坏甚至器官衰竭的一类疾病。
临床研究和动物实验均证实，肝脏内慢性长期炎症是导致过量瘢痕形成的主要诱因。
在肝损伤期，Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞快速激活并释放大量可溶性调节因子（包括过氧化物、细胞因子和蛋白酶等），刺激肝星状细胞增殖、迁移和活化。
另一方面，有研究显示，Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞还参与肝纤维化转归，其功能可能与调节星状细胞的生物学活性及促进细胞外基质的降解有关。
因此，深入研究Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞的生物学特性以及在细胞因子环境下与星状细胞间的相互作用，对于理解肝纤维形成的病理学过程和肝纤维化转归的生理学机制具有重要的指导意义。
关键词：肝纤维化；Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞；肝星状细胞中图分类号：Ｒ５７５．２文献标识码：Ａ文章编号：０５１３—４８７０（２００８）０９—０８８４—０６ＴｈｅｒｏｌｅｓｏｆＫｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓＷＵＪｕｎ・ｙｕ＋，ＬＩＵＧｅｎｇ－ｔａｏ（／ｎｓｔ／ｔｕｔｅｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌ＆ｉｅｎｅｅｓａｎｄＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｎｇ１０００５０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｉｔｅｒａｔｉｖｅｈｅｐａｔｉｃｉｎｊｕｒｙｗｉｔｈｓｕｓｔａｉｎｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｃａｒｔｉｓｓｕｅ，ｌｏｓｓｏｆｔｉｓｓｕｅａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅａｎｄｏｒｇａｎｆａｉｌｕｒｅ．Ｔｈｅｒｅｉｓｎｏｄｏｕｂｔ，ｆｒｏｍｂｏｔｈｈｕｍａｎａｎｄａｎｉｍａｌｓｔｕｄｉｅｓ，ｔｈａｔｔｏｏｍｕｃｈｏｒｔｏｏｐｒｏｔｒａｃｔｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒｌｅａｄｓｔｏｅｘｃｅｓｓｓｃａｒｒｉｎｇ．Ｄｕｒｉｎｇｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙ，Ｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓｃａｎｑｕｉｃｋｌｙｆｌｏｏｄｔｈｅｈｅｐａｔｉｃｍｉｌｉｅｕｗｉｔｈｓｏｌｕｂｌｅｍｅｄｉａｔｏｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｏｘｉｄａｎｔｓ，ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ｗｈｉｃｈＣａｌｌａｆｆｅｃｔｓｔｅＨａｔｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｏｎｔｈｅｏｔｈｅｒｈａｎｄ，ｔｈｅｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＫｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓｔｏｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓｈａｓｂｅｅｎｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ．Ｔｈｅｓｅｆｉｎｄｉｎｇｓｕｎｄｅｒｓｃｏｒｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｈｅｐａｔｉｃｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｂｏｔｈｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｅｒｉａｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＫｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓ，ｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈｓｔｅＨａｔｅｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｃｙｔｏｋｉｎｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｅｘｃｅｓｓｉｖｅｓｃａｒｒｉｎｇｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｌｉｖｅｒｆｏｒｔｉｓｓｕｅｒｅｐａｉｒａｎｄｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓ；Ｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌ；ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌ人肝纤维化是各种慢性肝脏疾病的共同终末途径，主要病理特征表现为胶原基质过量沉积、正常肝组织结构破坏和血液循环紊乱。
小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨【摘要】目的探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。
方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。
结果 3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106 g-1；细胞纯度分别为(93.2±1.7)％，(90.7±1.5)％，(94.5±1.9)％。
结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。
【关键词】肝；枯否细胞；离心法，梯密度；小鼠，近交BABLc ；细胞分离肝Kupffer细胞（Kupffer cell，KC）为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80％～90％。
肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。
近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。
如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究其在机体中作用机制的首要条件。
而传统的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结果。
本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物 BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供（许可证号：046）。
试验前禁食12 h，自由饮水，随机分为3组。
1.1.2 主要试剂和仪器Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES （美国Sigma公司）；兔抗人溶菌酶（lysozyme，美国DAKO公司）；链霉蛋白酶E（瑞士Roche公司）；RPMI��1640培养基（美国Gibco公司）。
小鼠肝Kupffer细胞小鼠肝Kupffer细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠肝Kupffer细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠肝Kupffer细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠肝Kupffer细胞产品简介：产品名称：小鼠肝 Kupffer 细胞（Mouse Hepatic Kupffer Cells）组织来源：小鼠肝组织产品规格：5×105cells/25cm2 培养瓶小鼠肝Kupffer细胞细胞简介：小鼠肝 Kupffer 细胞分离自小鼠肝脏组织，细胞呈圆形或多角形。
Kupffer 细胞是位于肝窦内表面的吞噬细胞，能够清除血液中的外来抗原、抗原－抗体复合物和细胞碎片等物质。
Kupffer 细胞是全身单核-吞噬细胞系统的重要组成部分，也是肝脏防御系统主要成员，在全身和肝脏疾病发生发展中起到重要作用。
Kupffer 细胞起源及其免疫学功能的研究进展郭世朋;张文锋;龚建平【期刊名称】《生理科学进展》【年(卷),期】2016(047)001【摘要】Kupffer 细胞（Kupffer cells，KCs）主要存在肝血窦中，是机体单核巨噬细胞系统的重要组成部分。
传统观点认为肝脏的 KCs 来是由单核巨噬细胞系统分化而来，但是新近研究发现具有分化潜能的造血干细胞能被诱导分化为具有KCs 功能的巨噬细胞。
KCs 通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）识别外源和内源的危险信号，激活后分化为 M1型和 M2型。
在体内，硅化合物、脂质体封装混合物以及氯化钆类可以特异性消除 KCs 和（或）阻断 KCs 的功能。
KCs 的基本功能包括：吞噬清除病原；抗原递呈，启动适应性免疫；促进肝细胞再生等。
【总页数】4页(P57-60)【作者】郭世朋;张文锋;龚建平【作者单位】重庆医科大学附属第二医院肝胆外科，重庆 400010;重庆医科大学附属第二医院肝胆外科，重庆 400010;重庆医科大学附属第二医院肝胆外科，重庆 400010【正文语种】中文【中图分类】Q256【相关文献】1.酚氧化酶及其酶原的研究进展(Ⅱ)——免疫学特性、细胞定位及其功能 [J], 庞秋香;庞书香;赵博生2.Kupffer氏细胞功能研究进展 [J], 杨尚琪;蔡访勤3.肝星状细胞的免疫学功能研究进展 [J], 王付强;尹震宇4.人干细胞样记忆性T细胞的免疫学特征及功能研究进展 [J], 盛思源;刘慜婧;杨志英5.Kupffer细胞免疫学功能研究进展 [J], 廖朝兴;赵敏杰;龚建平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Kupffer 细胞Kupffer 细胞（Kupffer cells，KC）是位于肝血窦内的巨噬细胞,寄居于肝血窦内皮细胞之间或之上,是体内固定型巨噬细胞中最大的群体。
约占巨噬细胞总数的80%。
KC体积较大，呈阿米巴状，有多个膜性突起，并可通过突入内皮细胞下Disse间隙的突起与肝细胞直接接触；细胞核大而圆；胞浆丰富，内含大量核糖体和吞噬体，有发达的内质网、高尔基体和分泌型囊泡。
激活的KC变圆，去极化，细胞表面皱缩，脱颗粒，失去伪足，胞内出现许多吞噬溶酶体和透明的空泡。
一些激活的KC内还含有致密物质。
随KC激活后吞噬功能的增强，胞内还会出现一些碎片和破损的红细胞。
一、KC的表面受体和标志人类和小鼠的KC的表面受体和标志同一般单核巨噬细胞的表面标志基本一致，每一种表面受体均与其功能密切相关：1．甘露糖受体（mannose receptor）：能与微生物表面的糖蛋白或类似酵母颗粒样物结合，促进胞吞作用；2．脂多糖（LPS）/LPS结合蛋白（LPS binding protein）复合物受体（CD14）：能够与革兰氏阴性细菌表面物质LPS或与LPS结合蛋白组成的复合物相结合，在LPS的信息传递中起启动作用，与KC的激活及对细菌的清除能力有关；3．三种不同IgG的Fc受体，FcγⅠR（CD64），FcγⅡR（CD32），FcγⅢR（CD16）：在启动细胞外杀伤、调理素化和胞吞中发挥作用；4．补体受体-1（CR1，CD35），补体受体-3（CR3，C3biR，CD11b）：CR1与细胞吞噬微生物有关；CR3与LFA-1（CD11a）和CD11c 一起在细胞的粘附中发挥作用；5．其他表面分子：如CD13、CD15、CD68和VLA-4（CD29/CD49d）等；6．KC表面还带有Ia抗原，因而具有抗原呈递作用。
二、KC主要的生物学功能1．胞吞作用：由于KC所处的解剖位置，使其能够与许多经过门静脉而来的潜在有害物直接接触，如微生物、内毒素、衰老或破裂的细胞等。
KC通过细胞表面的受体识别各种配体表位，并通过特异传导途径激活KC的胞吞机制。
吞噬的异物被吞噬体内的水解酶消化。
除吞噬作用外，KC也可表现出对可溶性物质的胞饮作用，这种作用多数由细胞表面的受体介导，即受体介导的内吞作用。
2．分泌前列腺素类(PG)和反应性氧类物质（reactive oxygen species，ROS）：某些物质与KC接触时可激发其产生前列腺素类，主要是前列腺素D2、E2和血栓素（thormboxane，TX），反应性氧类物质，如超氧化物阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、一氧化氮（NO）等[1]。
O2-还可与活性NO结合产生更具毒性的活性基团过氧亚硝酸盐。
ROS可与细胞膜表面多不饱和脂肪酸结合，产生多脂肪酸过氧基。
这些过氧基可通过电子传递的级联放大效应与蛋白质、脂质和核酸等物质反应，导致这些结构的氧化失活，并使结构蛋白和酶蛋白变性，引起细胞膜通透性增加直至细胞溶解死亡。
同时线粒体膜也因氧化受损而引起氧化磷酸化功能障碍，ATP合成减少[2,3]。
3．分泌细胞因子：KC可分泌多种细胞因子参与免疫调节、炎症反应、调控组织和基质修复、肝细胞和肝星状细胞的增生及合成细胞外基质，清除衰老与变形的血细胞和肿瘤细胞。
合成和分泌的细胞因子主要有：⑴肿瘤坏死因-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），①通过与细胞膜TNF受体结合，激活细胞自杀程序，导致细胞凋亡,并与肿瘤患者晚期的恶病质有关；②可激活T、B淋巴细胞并增强其细胞毒作用，与肝窦内的NK细胞激活有关；③可诱导和上调细胞间粘附分子（intercellular adhesion molecule-1 ，ICAM-1）和血管细胞粘附分子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），促进白细胞与血管内皮细胞的粘附；加强内皮细胞MHC-1类抗原的表达，促进血管内皮细胞产生血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、IL-1等炎症介质，并激活白细胞，促进血栓形成[4]。
TNF-α还可使白细胞表达CR1和CR3，加强内皮细胞和白细胞的粘附。
⑵IL-1、IL-6, 激活的KC分泌IL-1α增加，IL-1α是参与调节免疫和炎症反应的重要细胞因子，还可促进白细胞与肝窦壁粘附，激发窦内皮细胞的胞吞作用；TNF-α、IL-1又可刺激KC合成IL-6。
⑶TGF-β，可刺激肝星状细胞和成纤维细胞活化增生。
三、KC与肝脏肿瘤KC在抑制肝脏肿瘤的形成、生长和转移中发挥着重要作用。
其主要机制有：1．吞噬作用：研究发现在循环血液中标记荧光素的肿瘤细胞很快（24hr内）被KC吞噬，且标记的荧光素出现在KC的溶酶体中。
表明KC可通过吞噬作用清除肿瘤细胞，并释放水解蛋白酶直接导致肿瘤细胞溶解。
并非所有KC都有均一的吞噬活性，小叶周边区KC 数量多，吞噬功能比中央区强。
KC的这种天然抗肿瘤作用与不断从门静脉接受来自肠道的细菌内毒素（LPS）刺激有关[5]。
2．分泌TNF-α：体外研究发现TNF-α对肿瘤细胞有直接溶解和抗增殖作用，在体内可引起肿瘤坏死；TNF-α对毛细血管内皮细胞有直接的细胞毒作用，可造成肿瘤组织局部血流阻断而发生缺血坏死；TNF-α能增强局部单核巨噬细胞系统活性，增强NK细胞的细胞毒作用，协同发挥抗肿瘤作用。
3．分泌氧类物质：NO与KC引起的肿瘤细胞毒作用密切相关。
在体外，KC与AH70细胞共同培养可抑制AH70细胞的线粒体功能，而培养介质中亚硝酸盐、硝酸盐产物增多，KC中诱生型一氧化氮合酶（INOS）增高。
加入ICAM-1或CD18单克隆抗体或TMB-8钙离子抑制剂后，上述反应被阻断。
说明由KC介导的肝肿瘤细胞损伤很大程度上依赖由INOS 产生的NO，且NO的产生由CD18/ICAM-1介导的KC与肿瘤细胞的相互作用激发，其中也包括Ca2+的修饰[6]。
但也有研究认为KC的氧化产物是过氧化增生因子诱发肝癌的关键[7]。
4．KC表面存在Fc受体，可通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）直接溶解肿瘤细胞。
在二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DENA)诱发试验性肝癌的形成过程中,KC增多,特别是在分化异常结节和癌变结节的周围,偶可见于分化异常的肝细胞之间;且常伴有活化的α-SMA阳性肝星状细胞(hepatic stellate cell ,HSC)增多,.出现于分化异常肝细胞之间的肝窦中。
KC、HSC的增多是机体局部对异常分化肝细胞的反应，与DENA引起的炎性坏死无关[8]。
进一步的研究证明KC具有抑制实验性肝癌形成的作用，并可促进实验性肝癌细胞凋亡[9,10]。
在正常和硬化的大鼠肝脏中分别植入大鼠肝细胞肝癌细胞，植入的癌细胞在硬化肝脏中生长得比在正常肝脏中要快得多。
因为KC在硬化肝脏中极度减少，吞噬功能显著削弱，且KC相关的细胞因子产物如：IL-1β、TNF-α也相应显著减少。
肝硬化是肝细胞肝癌（HCC）的首要促发因素，在其中KC活性的显著减低起着重要作用[11]。
近年来在肿瘤综合治疗中进行了一些激活KC功能抑制肝脏肿瘤生长、抑制肿瘤转移的研究。
经粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor GM-CSF）预处理的大鼠KC在体外细胞毒作用增强，在体内抑制肿瘤扩散的能力增强[12]。
γ-干扰素（gamma interferonγ-IFN）可通过激活KC减缓肝转移性肿瘤的生长。
用含有GM-CSF、IL-2基因的疱疹病毒转染的肝癌细胞免疫大鼠并合用γ-IFN，可同时激活KC和淋巴细胞，明显减少甚至完全抑制肝转移性肿瘤的形成[13]。
最近的研究表明胸腺刺激素（thymostimulin，TP-1）对人肝细胞肝癌细胞的细胞毒作用并非直接或间接通过肝细胞介导，而是通过激活KC、释放TNF-α[14]。
四、KC与肝纤维化肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经过程,以细胞外基质(ECM)在肝窦周间隙过渡沉积为特征。
近年的研究表明激活后的HSC具有生成ECM，分泌细胞因子以及收缩等多种功能，在肝纤维化的发生发展中起关键性作用[15]。
HSC的激活过程十分复杂，受到KC、肝细胞、肝窦内皮细胞以及自身分泌的多种细胞因子的旁分泌和自分泌调节，而KC作为一种炎症细胞在其中起着重要作用。
在实验性肝纤维化模型中，KC的浸润总是先于HSC的激活[16]。
无论是从正常大鼠还是从肝纤维化大鼠中分离出来的KC的条件培养液，都能促进HSC的激活。
KC条件培养液中起促进HSC激活作用的是KC分泌的多种细胞因子，其中TGFα和β起主要调节作用，且与TGF-β/TGF-α的比值密切相关。
TGF-α可诱导HSC表达血小板源性生长因子（PDGF）受体而促进HSC增殖。
KC分泌的TGF-β主要以潜伏状态存在，HSC能激活TGF-β，这可能与HSC胰岛素样生长因子（IGF）II表达的上调有关，激活后的TGF-β能抑制HSC的增殖，促进蛋白多糖合成[17,18]。
由KC分泌的TNF-α、IL-1等也具有促进HSC激活的作用[19]。
因此，抑制KC分泌细胞因子将有助于抑制HSC的活化和肝纤维化的发展。
但迄今为止，尚未发现一种能应用于临床、对肝纤维化有可靠疗效的药物。
新近发现的一种炎症抑制因子IL-10给人们带来了希望，在多种实验性肝损伤模型中，均发现内源性IL-10有明显的抑制肝脏炎症，减轻肝损伤的作用[20]。
比较用敲除IL-10基因的小鼠和用正常小鼠制作的CCL4肝损伤模型，结果发现前者肝纤维化程度明显重于后者[21]。
IL-10可能是通过抑制KC 分泌细胞因子而抑制HSC的激活，在减轻肝纤维化中发挥作用[22]。
五、KC与移植肝再灌注损伤原发性移植肝无功能及移植肝原发性功能紊乱都与移植肝冷冻保存后KC的激活所引起的再灌注损伤有关。
移植肝再灌注后KC的激活主要与细菌内毒素作用有关。
由于移植肝冷冻保存时肝能量代谢受损，A TP合成减少、分解加强；再加上因无氧糖酵解和乳酸积聚所至的组织酸性环境和细胞内Ca2+的增加而使KC处于预激活状态[23,24]。
同时由于移植时需阻断门静脉，使肠管淤血、通透性增加，细菌内毒素进入并积聚在门静脉系统。
当血流重性开放后门静脉血中的内毒素就可使处于预激活状态的KC活化[25]。
移植肝再灌注15分钟后几乎所有的KC都被激活。
激活的KC吞噬功能增强并产生多种生物活性物质，如ROS和水溶性酶类。
这些物质可对进入肝脏的细菌、病毒、内毒素和许多毒性物质进行代谢解毒，对移植肝起一定保护作用。
但同时ROS和水溶性酶类又协同KC激活后分泌的促炎性细胞因子，如TNF-α、PAF 、TX 、白三烯（leukotriene ，LT）等一起介导移植肝的再灌注损伤[25,26]。
