葡萄糖氧化酶酶活测定

邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力1 引言葡萄糖氧化酶是一种绿色饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中可作为抗氧化剂减缓饲料氧化变质[1]，改善动物肠道微生物平衡[2]，提高饲料利用率[3]，促进动物生长，降低中毒反应更在一定程度上替代抗菌药物和抗球虫病药物，具有广泛的应用前景。

由于葡萄糖氧化酶的高度专一性，基于不同的酶活定义而建立的检测方法主要有电化学法、测压法、凝胶电泳法、滴定法、分光光度法和傅立叶变换红外光谱法等[4]。

电化学法、测压法、凝胶电泳法存在方法操作复杂，要求严格，有很强的仪器依赖性；滴定法存在工作量大、样品需要量大、人工读数导致的测量精度低，尤其在混合型饲料添加剂的检测中不能排除酸性、碱性载体干扰的缺点。

傅立叶变换红外光谱法是较新开发的一种检测方法，优点为检测速度快，试剂用量少。

缺点为仪器要求和模型建立需要前期投入太大，限制了其使用范围。

因此寻找一种简便，快捷，灵敏的高的酶活力检测方法很有意义。

本研究采用邻联茴香胺分光光度法测定葡糖糖酶活力。

反应机理为：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。

在一定的pH、温度、浓度及反应时间内通过测定产物吸光度在460nm 波长下的变化速率定量计算出酶活力。

基本反应式为：β-D-葡萄糖+H20+O2 δ-D-葡萄糖基-1，5-内酯+H2OH2O2+邻联茴香胺氧化型邻联茴香胺+2H2O1实验部分1.1仪器设备北京瑞利仪器XX公司UV-2600型紫外可见分光光度计；北京中兴伟业仪器XX公司DZKW-2型电热恒温水浴锅；赛多利斯科学仪器XX公司BSA224S型分析天平。

1.2实验试剂和材料标示含量为40GODU/g的葡萄糖氧化酶饲料添加剂；辣根过氧化物酶（上海蓝季生物）；邻联茴香胺（sigma，D9143）；磷酸二氢钠（国药试剂）；磷酸氢二钠（国药试剂）；葡萄糖（国药试剂）。

测定葡萄糖氧化酶活力的一种简便方法周建芹 , 陈韶华 , 王剑文( 1. 苏州大学医学部药学院 , 江苏苏州215123; 2. 苏州大学医学部实验中心 , 江苏苏州215123 )摘 : 利用靛蓝胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖溶液产生的过氧化氢浓度 , 经过标要准曲线转换得到葡萄糖氧化酶的活力。

研究了缓冲液 pH 值、水浴温度、靛蓝胭脂红用量等对葡萄糖氧化酶活力测定的影响。

结果表明 : 利用靛蓝胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶活力时 , 缓冲液最佳 pH 值为 4、最佳水浴温度为100 ℃、靛蓝胭脂红最佳用量为 1.3 mL。

此方法的重现性较好 , 反应系统较稳定。

葡萄糖氧化酶在自然界中普遍存在 , 在食品、医药和发酵等工业生产及分析检测中用途广泛 , 是高等院校生物化学、酶学和酶工程等相关实验课程中经常选用的一种重要的模式酶。

在有氧情况下 , 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和过氧化氢 : 葡萄糖 + O2 葡萄糖酸 + H2 O2 。

测定葡萄糖氧化酶活力常用的方法有 2 种。

一种是滴定法 , 即用碱滴定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生的葡萄糖酸 , 这种方法误差比较大 , 灵敏度比较低 , 尤其是葡萄糖含量比较低时。

另一种是利用葡萄糖氧化酶—辣根过氧化物酶—苯胺衍生物或染料隐性体偶联反应体系测定。

过氧化物酶在有氧存在时 , 催化葡萄糖氧化、生成的过氧化氢分解 , 分解出的氧又将苯胺衍生物或染料隐性体(如邻 - 联二茴香胺 ) 氧化变成红色或棕色物质 , 颜色深浅与葡萄糖氧化酶活性成线性关系。

这种方法非常灵敏 , 但也存在显色物质不稳定、在 1 m in内有明显褪色、数据重复性不好等不足 , 而且因为要与辣根过氧化物酶联用 , 因此这个方法比较昂贵 , 增加了测定成本。

葡萄糖氧化酶活力测定的困难限制了其在学生实验及课外科研项目中的应用 , 因此寻找一种廉价、简便并且灵敏度高的活力测定方法很有意义。

葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理概述及解释说明1. 引言1.1 概述本文旨在介绍葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理，并对其进行详细的解释和说明。

血糖测定是医学和生物科学领域中非常重要的一项实验技术，用于评估人体内的葡萄糖水平以及相关代谢功能的异常情况。

葡萄糖氧化酶法是一种常用的血糖测定方法，其基本原理是利用特定酶对葡萄糖进行氧化反应并与辅助试剂发生显色反应，从而间接地测定血液中的葡萄糖含量。

1.2 文章结构本文将按照以下结构进行展开：首先，介绍葡萄糖氧化酶的简要概况和血糖测定方法的总体概述；其次，详细讲解葡萄糖氧化酶法测定血糖的基本原理；然后，描述实验步骤并给出操作流程；接着，分析实验结果并讨论其中的意义和影响因素；最后，总结实验结论并展望未来该领域的研究意义和发展方向。

1.3 目的本文的目的是全面而清晰地介绍葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理，帮助读者了解该方法在实际应用中的作用和意义。

通过本文的阅读，读者可以深入了解葡萄糖氧化酶法的基本理论和操作流程，并对实验结果进行准确而详细的分析与讨论。

同时，本文也旨在提供对该方法局限性和未来发展方向进行探讨，并为相关研究人员提供参考，促进该领域的进一步发展和突破。

2. 葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理：2.1 葡萄糖氧化酶简介：葡萄糖氧化酶是一种存在于细胞内的酶类，在生物体中起到将葡萄糖转化为能量的重要作用。

该酶主要参与细胞内氧化还原反应，并催化葡萄糖与辅酶NAD+之间的反应。

在此过程中，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸，并产生还原型辅酶NADH。

2.2 血糖测定方法概述：血液中的血糖水平是一个重要的生理指标，可以提供人体能量供给的信息。

因此，血糖水平的测定对于诊断和治疗许多代谢性疾病非常重要。

目前，有多种方法用于测定血液中的血糖浓度，其中最常用且最经典的方法就是使用葡萄糖氧化酶法。

2.3 葡萄糖氧化酶法的基本原理：葡萄糖氧化酶法是一种非常敏感和特异性的测定血糖浓度的方法。

该方法基于葡萄糖氧化酶与葡萄糖的特异性反应，通过检测在该反应中生成的还原型辅酶NADH的产生量来间接测定血液中的血糖浓度。

一、实验目的1. 了解葡萄糖氧化酶（GOD）的催化作用原理。

2. 掌握测定葡萄糖氧化酶活性的方法。

3. 分析不同条件下葡萄糖氧化酶活性的变化。

二、实验原理葡萄糖氧化酶（GOD）是一种氧化还原酶，它催化葡萄糖与氧反应生成葡萄糖酸和过氧化氢。

在实验中，通过测定过氧化氢的生成量来间接反映葡萄糖氧化酶的活性。

过氧化氢在特定条件下会分解生成水和氧气，利用氧气的生成量可以计算出过氧化氢的浓度，从而推算出葡萄糖氧化酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 试剂：- 葡萄糖标准溶液- 氧气电极- 氢氧化钠溶液- 酚酞指示剂- 水浴锅2. 仪器：- 721分光光度计- 恒温培养箱- 移液枪- 试管- 烧杯四、实验步骤1. 准备工作：- 将葡萄糖标准溶液配制成不同浓度的系列溶液。

- 配制好氢氧化钠溶液和酚酞指示剂。

2. 实验操作：- 将葡萄糖标准溶液加入试管中，加入适量的氢氧化钠溶液和酚酞指示剂。

- 使用移液枪将氧气电极插入溶液中，开始计时。

- 观察溶液颜色变化，记录溶液从粉红色变为无色所需的时间。

3. 数据处理：- 根据溶液颜色变化所需时间，计算出过氧化氢的生成量。

- 以葡萄糖浓度为横坐标，过氧化氢生成量为纵坐标，绘制标准曲线。

- 根据待测样品的浓度，从标准曲线上查得对应的过氧化氢生成量。

- 计算出待测样品的葡萄糖氧化酶活性。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 以葡萄糖浓度为横坐标，过氧化氢生成量为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 待测样品的葡萄糖氧化酶活性：- 根据待测样品的浓度，从标准曲线上查得对应的过氧化氢生成量。

- 计算出待测样品的葡萄糖氧化酶活性。

3. 不同条件下葡萄糖氧化酶活性的变化：- 在不同温度、pH值和酶浓度下，观察葡萄糖氧化酶活性的变化。

六、实验结论通过本实验，我们成功测定了葡萄糖氧化酶的活性，并分析了不同条件下葡萄糖氧化酶活性的变化。

实验结果表明，葡萄糖氧化酶活性受温度、pH值和酶浓度等因素的影响。

葡萄糖氧化酶质量标准
葡萄糖氧化酶质量标准是指用于评估葡萄糖氧化酶的纯度、活性和稳定性的一系列参考标准。

以下是一些可能的葡萄糖氧化酶质量标准：
1. 纯度：确定葡萄糖氧化酶中是否存在杂质或其他蛋白质。

可以通过比色法、电泳法或质谱法等技术进行检测。

2. 活性：评估葡萄糖氧化酶在特定条件下的催化能力。

常用的方法是测定其催化单位（1U定义为将1微摩尔葡萄糖氧化为-
D-葡萄糖的酶幅度）。

3. 组合特性：确定葡萄糖氧化酶的催化速度、温度和pH的依
赖关系。

这些特性可以通过实验室条件下的酶反应速率研究来确定。

4. 稳定性：评估葡萄糖氧化酶在储存和使用过程中的稳定性。

可以通过长时间储存酶样品，并定期检测其活性和纯度来评估。

葡萄糖氧化酶的质量标准通常是根据国际或行业标准进行制定和评估的。

如需准确的质量标准信息，建议参考葡萄糖氧化酶的制造商提供的相关文件和技术资料。

葡萄糖底物UV分光光度法是一种用于测定酶活的常见方法。

本文将介绍葡萄糖底物UV分光光度法的原理、步骤及其在生物化学和生物医学研究中的应用。

一、原理1. 葡萄糖酶（也称葡萄糖氧化酶）能够催化葡萄糖与氧气在水溶液中发生氧化反应，生成葡萄糖内酯和过氧化氢。

这个氧化反应是可以通过UV分光光度法测定的。

2. 葡萄糖底物UV分光光度法的原理是通过测定在酶催化下葡萄糖与氧气反应所产生的过氧化氢的浓度变化来间接测定酶的活性。

二、步骤1. 样品处理：将待测样品中的葡萄糖与底物混合，使底物的浓度在一定范围内，以确保底物的过量不会影响酶的活性测定。

2. 加入酶液：将一定量的葡萄糖酶加入混合液中，并在一定温度下孵育一段时间，使酶与底物发生反应。

3. 反应停止：加入一种化学试剂使反应停止，同时转化过氧化氢形成一种有色产物。

4. 测定吸光度：使用紫外-可见分光光度计测定产生的有色产物的吸光度，根据标准曲线计算出反应体系中的过氧化氢的浓度。

5. 计算酶活：根据过氧化氢的浓度变化和所加的酶的蛋白质含量等数据，计算出酶的活性。

三、应用1. 生物化学研究中的应用：葡萄糖底物UV分光光度法广泛应用于酶动力学研究中，可以用来测定各种酶的活性及其对底物的亲和力。

2. 生物医学研究中的应用：在生物医学研究中，葡萄糖底物UV分光光度法可以用来研究酶与疾病的关联性，例如糖尿病患者血清中的葡萄糖酶活性与血糖水平的关系。

结论葡萄糖底物UV分光光度法是一种简单、敏感、精确的酶活测定方法，具有广泛的应用前景和重要的科研意义。

通过对葡萄糖底物UV分光光度法的原理、步骤及应用进行了解和掌握，可以更好地指导实验操作并推动生物化学和生物医学领域的研究进展。

近年来，随着生物技术的不断发展，葡萄糖底物UV分光光度法在生物医学研究中的应用越发广泛。

除了用于酶动力学研究和疾病相关性分析外，葡萄糖底物UV分光光度法还在其他领域展现出了巨大的潜力。

1. 新药研发在新药研发过程中，葡萄糖底物UV分光光度法被用于筛选潜在的药物候选化合物。

Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdTel: 400-968-6088葡萄糖氧化酶（GOD）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0695规格：100T/96S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体110 mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体15 mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体3 mL×1瓶2-8℃保存试剂三液体1 mL×1支-20℃保存溶液的配制：1、工作液的配制：取15 mL试剂一和3 mL试剂二混匀（现配现用）；2、试剂三：融化后可分装-20℃保存。

产品说明：GOD（EC 1.1.3.4）广泛存在于动物和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并产生H2O2，是生物体中产生活性氧的代谢途径之一。

GOD催化葡萄糖产生H2O2，过氧化物酶在有氧存在时催化H2O2分解产生的氧又将邻联茴香胺氧化生成有色物质，颜色深浅与葡萄糖氧化酶活性成线性关系。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）（1）组织处理：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

（2）细菌、细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎（功率200w，超声3s，间隔10s，重复30次）。

8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

B I O F N O R N O O N葡萄糖氧化酶检测方法1.1 酶活力1.1.1 原理葡萄糖和氧反应，在葡萄糖氧化酶的作用下，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化氢酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。

1.1.2 试剂和溶液特殊说明，所用的试剂均为分析纯，水均符合GB/T 6682中规定的三级水。

1.1.2.1 磷酸盐缓冲溶液，pH 为6.0。

称取二水磷酸二氢钠16.61g 和十二水磷酸氢二钠35.82g ，溶于无二氧化碳的水中，稀释至1000mL 。

1.1.2.2 邻联茴香胺甲醇缓冲溶液。

称取邻联茴香胺1g 加入100ml 甲醇中搅拌溶解备用。

临用时现配，取0.1ml 加入到上述缓冲溶液12mL 中混匀。

1.1.2.3 葡萄糖水溶液，浓度为180g/L 。

称取葡萄糖18g ，加水溶解，定容至100ml 。

1.1.2.4 辣根过氧化物酶液,浓度为0.033%。

称取辣根过氧化物酶（HRP ，美国Ameresco 公司）10mg ，溶于30ml 蒸馏水。

1.1.3 仪器与设备a) 分析天平：感量0.0001 g 。

b) pH 计：精确至0.01。

c) 磁力搅拌器：附加热功能。

d) 电磁振荡器。

e) 离心机：4000 r/min 。

f) 恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。

g) 秒表：每小时误差不超过5s 。

h) 可见分光光度计：能检测350—800nm 的吸光度范围。

i) 移液器：精度为1uL 。

1.1.4 实验方法1.1.4.1 反应用酶液的制备固态产品用万分级天平称取样品1g （精确至0.0001g ），用磷酸盐缓冲溶液（2.7.2.1）定容至100mL 。

磁力搅拌30min ，上离心机6000r/min,离心5 min 。

取上清液，再用磷酸盐缓冲溶液（2.7.2.1）做适当稀释。

液态产品用移液枪吸取1.00mL ，用磷酸盐缓冲溶液（2.7.2.1）做适当稀释。

葡萄糖氧化酶法测血糖实验报告葡萄糖氧化酶法测血糖实验报告引言：血糖是人体内能量的重要来源之一，它对人体的正常运作至关重要。

因此，准确测量血糖水平对于疾病的诊断、治疗以及健康管理具有重要意义。

本实验旨在通过葡萄糖氧化酶法测量血液中的葡萄糖含量，以了解该方法的原理和应用。

实验步骤：1. 实验前准备：准备好实验所需的血糖试纸、葡萄糖标准溶液、葡萄糖氧化酶试剂等。

2. 取一滴指尖血：使用消毒棉球清洁手指，用无菌针刺破手指的一侧，轻轻挤压手指，使血液形成一滴。

3. 涂抹血液：将取得的血液滴在血糖试纸上，确保试纸完全吸收血液。

4. 加入试剂：将葡萄糖氧化酶试剂滴在试纸上，与血液充分混合。

5. 反应时间：根据试纸说明书上的时间要求，等待一定时间，让试剂与血液中的葡萄糖发生氧化反应。

6. 读取结果：将试纸放入专用的血糖仪中，等待仪器显示血糖浓度。

实验结果：通过实验测量，我们得到了不同血液样本的血糖浓度。

根据实验数据，我们可以得出以下结论：1. 血糖水平与时间的关系：我们发现血糖水平在不同时间段内有所变化。

通常情况下，饭后血糖浓度会升高，而空腹时血糖浓度较低。

这与人体对葡萄糖的代谢过程有关。

2. 血糖水平与饮食的关系：我们还观察到不同饮食对血糖水平的影响。

高糖饮食会导致血糖浓度升高，而低糖饮食则相对较低。

这提示我们在日常生活中要注意饮食结构的合理安排。

3. 血糖水平与运动的关系：运动对血糖水平也有一定影响。

剧烈运动会使血糖浓度下降，而适量运动则有助于维持血糖水平的稳定。

这表明运动对于血糖控制的重要性。

实验原理：葡萄糖氧化酶法是一种常用的测量血糖浓度的方法。

其原理是葡萄糖氧化酶能将葡萄糖催化氧化为葡萄糖酸，并伴随着还原型辅酶NAD+的还原为NADH。

通过测量NADH的光学密度变化，可以间接地测量血液中的葡萄糖浓度。

该方法的优点是操作简单、结果准确可靠。

然而，也存在一些局限性，如对于血液中其他物质的干扰较为敏感，需要进行进一步的校正和排除。

葡萄糖氧化酶一、酶的简介葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD)能够在有氧气的条件下专一性催化β-D- 葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢,高纯度GOD的制剂为淡黄色粉末、易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、甘油和乙二醇[1]。

50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀。

它广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源，微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉。

葡萄糖氧化酶是用黑曲霉等发酵制得的一种需氧脱氢酶，对人体无毒、副作用，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功能，它广泛应用于食品、饲料、医药等行业中，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。

【2】二、菌种及培养基2.1 菌种：以黑曲霉H1-9b为菌种，在发酵罐中装入培养基2.2 发酵培养基(g/L)：蔗糖80、蛋白胨3、KH2PO4 2、MgSO4·7H2O 0.7、KCl 0.5、NaNO3 4，pH5.5；斜面培养基(g/L)：蔗糖30、NaNO32、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO4 0.5、FeSO40.01、琼脂20，pH5.5【3】。

发酵条件为：26～29摄氏度，pH值自然，通风量0．3m3／(m3·min)，搅拌速度400r／min。

发酵液离心分离得菌丝体，经研磨(因葡萄糖氧化酶是一种胞内酶，提取时首先必须先研磨破壁)后过滤，得到含葡萄糖氧化酶的滤液即酶液。

[4]三、工艺流程葡萄糖氧化酶制备流程图原料预处理培养基配制灭菌无菌空气制备发酵产品的分离纯化菌种的制备和种子培养葡萄糖氧化酶下游工艺流程图3.1葡萄糖氧化酶的发酵3.1.1种子液培养在斜面培养基上接种黑曲霉H1-9b 孢子，28℃培养4 ～5 d 。

3.1.2摇瓶发酵250mL 锥形瓶中分装50mL 发酵培养基，121℃灭菌20min，接种黑曲霉H1-9a 孢子浓度为104个/mL，28℃、200r/min 摇床培养80h 即达产酶高峰。

葡萄糖氧化酶酶活定义葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）是一种重要的酶类，它在生物体内起着关键的催化作用。

葡萄糖氧化酶酶活是指该酶在特定条件下催化葡萄糖氧化反应的能力。

本文将介绍葡萄糖氧化酶的酶活定义以及其在生物学和工业领域的应用。

一、葡萄糖氧化酶酶活的定义葡萄糖氧化酶酶活是指在一定的温度、pH值和底物浓度条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化反应的速率。

酶活的高低可以通过测定单位时间内产生的产物量或底物消耗量来评估。

葡萄糖氧化酶酶活的测定方法多种多样，常用的方法包括比色法、电化学法和荧光法等。

二、葡萄糖氧化酶的生物学意义葡萄糖氧化酶在生物体内广泛存在，特别是在真菌和细菌中较为常见。

它能催化葡萄糖的氧化反应，将葡萄糖转化为葡萄糖酸，并释放出氧气。

这个反应对于生物体的能量代谢非常重要，能够提供细胞所需的能量。

三、葡萄糖氧化酶在工业领域的应用由于葡萄糖氧化酶具有高效催化葡萄糖氧化反应的能力，因此在工业领域有着广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：1. 食品工业：葡萄糖氧化酶可以用于食品加工中，例如面包、饼干和啤酒等的生产过程中。

它能够将葡萄糖转化为葡萄糖酸，起到增酸、防腐和改善口感的作用。

2. 医药工业：葡萄糖氧化酶可以用于医药领域的生产过程中。

例如，它可以用于制备葡萄糖酸盐，作为药物的原料或辅料。

3. 生物传感器：葡萄糖氧化酶可以用于生物传感器的制备中。

通过将葡萄糖氧化酶固定在传感器表面，可以实现对葡萄糖浓度的快速检测，广泛应用于血糖监测和生物医学研究领域。

4. 环境保护：葡萄糖氧化酶可以用于环境监测和废水处理中。

它能够催化有机物的氧化反应，将有机废物转化为无害的产物，起到净化环境的作用。

葡萄糖氧化酶酶活是指葡萄糖氧化酶在特定条件下催化葡萄糖氧化反应的能力。

葡萄糖氧化酶在生物学和工业领域有着广泛的应用，包括食品工业、医药工业、生物传感器和环境保护等领域。

随着科学技术的不断发展，葡萄糖氧化酶的应用前景将更加广阔。

各种酶活性测定方法酶活性测定方法是用来测量酶的活性水平和酶催化反应速率的实验方法。

酶活性测定是生物化学研究中的重要内容之一，能够帮助研究人员了解酶的特性和功能，并对酶的应用提供指导。

目前，常用的酶活性测定方法有以下几种。

1.酶动力学实验法酶动力学实验法是通过调整底物浓度、酶浓度和其他反应条件，绘制酶活性与反应速率之间的关系曲线，以了解酶的动力学特性。

常用的酶动力学实验方法包括酶动力学参数的测定、酶标曲线的绘制和酶动力学模型的拟合等。

2.酶活性基质法酶活性基质法是一种通过检测酶对特定底物的催化反应来测定酶活性的方法。

常用的酶活性基质法包括比色法、荧光法、放射性测定法等。

比色法是通过测量产生的产物颜色的变化来间接测定酶活性，如川氏法、本氏法和丙二醛法等；荧光法是通过测量产生的荧光强度的变化来间接测定酶活性，如ATP酶活性测定法；放射性测定法是通过放射性同位素的标记来直接测定酶活性，如液闪测定法。

3.酶活性电位法酶活性电位法是一种通过测量酶催化反应中的电势差变化来测定酶活性的方法。

常见的酶活性电位法有葡萄糖氧化酶活性电位法、酶反应连续监测法等。

葡萄糖氧化酶活性电位法是通过测量葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化反应产生的电势差变化来间接测定酶活性；酶反应连续监测法是通过测量酶催化反应中产生的电势差变化来直接测定酶活性。

4.酶活性蛋白质法酶活性蛋白质法是一种通过测定酶在反应条件下形成的酶-底物或酶-产物复合物的含量来测定酶活性的方法。

常用的酶活性蛋白质法包括凝胶酶体增活法、凝胶电泳法和酶免疫测定法等。

凝胶酶体增活法是通过测定酶在凝胶中形成的酶-底物或酶-产物复合物的含量来间接测定酶活性；凝胶电泳法是通过测定酶在凝胶中的迁移速度来间接测定酶活性；酶免疫测定法是通过测定酶的特异性免疫反应来直接测定酶活性。

5.酶活性循环法酶活性循环法是一种通过测定酶催化反应中剩余底物或消耗产物的浓度变化来测定酶活性的方法。

常见的酶活性循环法有连续监测法和衍生物测定法等。

葡萄糖氧化酶酶活测定
1 酶活单位与定义
pH6.0、30℃的条件下，每分钟能把 1.0μmol 的β-D-葡萄糖氧化成 D-葡萄糖酸和 H2O2 的酶量为一个单位。

2 测定原理
葡萄糖和氧反应，在葡萄糖氧化酶的作用下，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。

3 试剂和溶液
3.1 磷酸盐缓冲液（pH6.0）
称取 16.61g 磷酸二氢钠（ NaH2PO4·2H2O ）和 35.82g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），溶于无 CO2 的水中，稀释到 1000ml。

3.2 邻联茴香胺甲醇缓冲液
1g 邻联茴香胺加在 100ml 甲醇中搅拌溶解备用。

临用时现配，取 0.1ml 加入到上述缓冲液 12ml 中混匀。

3.3 180g/l 葡萄糖水溶液
18g 葡萄糖加适量水溶解，并定容至 100ml。

3.4 0.03%辣根过氧化物酶液
称取辣根过氧化物酶（HRP,美国 Ameresco 公司）10mg，溶于 30ml 蒸馏水。

4 仪器设备
721-分光光度计、恒温水浴、秒表
5 分析步骤
5.1 待测酶样品的处理将待测酶样做适当稀释后进行试验，使得测定△A 值在 0.25～0.4。

5.2 测定
2 支干净试管，按顺序分别加入以下试剂
6 结果表示与计算
X=[△A÷（11.3×t×0.1）] ×n
t—测定时间，min
0.1—样品体积，ml
11.3—消光系数
n—稀释倍数
所得结果表示至整数。

利用生物传感分析仪快速测定葡萄糖氧化酶的酶活周清华;王卫军;钱伟;魏胜华【摘要】建立了采用生物传感分析仪快速测定葡萄糖氧化酶酶活的新方法.通过外加过氧化氢酶去除酶反应液中的过氧化氢,排除了其对测定的干扰;酶活测定的最佳条件:取质量浓度为15 mg/mL的葡萄糖氧化酶稀释液0.5 mL加入5 mL质量浓度为3 mg/mL的葡萄糖溶液中,在36℃ 的水浴中反应10 min,然后加入过氧化氢酶去除H2 O2.在此条件下同一批样品测定8次,其RSD为1.14％,与液相色谱法测定的结果相比较,相对误差为1.65％,较其他几种方法更为快捷、精确.【期刊名称】《安徽工程大学学报》【年(卷),期】2017(032)005【总页数】5页(P1-4,50)【关键词】生物传感分析仪;葡萄糖氧化酶;酶活;测定【作者】周清华;王卫军;钱伟;魏胜华【作者单位】安徽工程大学生物与化学工程学院 ,安徽芜湖 241000;安徽工程大学生物与化学工程学院 ,安徽芜湖 241000;安徽工程大学生物与化学工程学院 ,安徽芜湖 241000;安徽工程大学生物与化学工程学院 ,安徽芜湖 241000;安徽工程大学微生物发酵安徽省工程研究中心 ,安徽芜湖 241000【正文语种】中文【中图分类】Q554+.2葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,E.C.1.1.3.4,简称GOD)能够在有氧的条件下专一性地催化β-D-葡萄糖生成过氧化氢和葡萄糖酸，该酶广泛地分布于动物、植物和微生物体内，在生物体的新陈代谢过程中起着重要的作用．微生物因其具有生长繁殖速度快、来源广以及易培养等特点成为葡萄糖氧化酶的主要来源[1]．GOD应用于食品、饲料、医药等行业中，起到去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用[2-3]．在生物催化领域，联合使用GOD与CAT(过氧化氢酶)是目前生物法制备葡萄糖酸最高效的方法[4]．在酶的生产和应用方面，酶活的检测是首先要解决的问题．建立一种快速、简便、灵敏和准确的检测方法是提高生产水平的前提．目前，葡萄糖氧化酶酶活的测定方法主要有直接的Underbofler滴定法[5]、间接的靛蓝胭脂红退色法[6]和Keston 法[7]等．这些方法有的误差较大，灵敏度低；有的测定时间长，成本较高且操作复杂，难以测定大批样品．生物传感分析仪是酶反应在仪器分析领域的典型应用，该仪器的关键设备是电极复合传感器，其工作原理是利用设备自带的固定化酶膜，通过酶反应放出H2O2，随后H2O2失去电子生成H2O，铂电极获得电子产生电流信号，这种电流信号的强度与H2O2的浓度成比例，而H2O2浓度与底物浓度成线性比例关系．通过比较被测物和标准样品产生的H2O2量，就可计算出被测样品中底物的含量．通过更换不同的固定化酶膜，可以测定葡萄糖、谷氨酸、乙醇和乳酸等化合物．采用生物传感分析仪测定样品具有快速、准确、使用方便和可以大批测定的优点，在一定条件下可以实现在线的检测，因此在检测方面应用较广[8]．采用生物传感分析仪测定GOD的酶活时，由于GOD在转化葡萄糖的过程中会产生H2O2，因此需要去除H2O2的干扰，研究利用过氧化氢酶CAT去除酶反应液中的H2O2，并优化酶活测定反应条件，最后将其与其他几种测定方法进行了对比．目前还未发现关于采用生物传感分析仪在酶活分析中应用的报道，研究不仅提供了一种新的测定GOD酶活的方法，还大大拓宽了生物传感分析仪的用途．1.1 试剂与仪器GOD和CAT(郑州中成化工有限公司)；其它试剂购自国药集团上海试剂公司，均为分析纯；SBA-40D生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)；Beckman Allegra 64R离心机；AS1201型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)．1.2 实验方法GOD酶液的制备.准确称取3 gGOD固体粉末，充分溶解于20 mL的pH=5.0的0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液中，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，然后取上清液置于冰箱冷藏保存备用，使用时适当稀释．生物传感分析仪测定GOD酶活.取GOD酶液0.5 mL，加入5 mL的3 mg/mL的葡萄糖溶液，在36 ℃的水浴中振荡反应10 min后煮沸灭酶终止反应，冷却到室温后，加入0.4 mL的CAT，在30 ℃下反应10 min，然后加热煮沸，4 ℃下10 000 r/min离心10 min后准确吸取上清液20 μL，注射入生化分析仪，测得葡萄糖的含量，计算与初始葡萄糖浓度对比得到所消耗的葡萄糖的含量．酶活计算按照国际单位所定义的每分钟转化1 μmol葡萄糖所需的单位酶量为1个酶活单位．滴定法测定GOD酶活.取GOD酶液1.0 mL，加入质量浓度为3 mg/mL的葡萄糖溶液25 mL，置于36 ℃的水浴中振荡反应60 min，此后依次加入20 mL的0.1 mol/L的NaOH溶液使得反应终止，用0.1 mol/L的盐酸滴定剩余的NaOH，通过记录消耗的盐酸的含量推算出所产生的葡萄糖酸的含量，从而最终计算出酶活．靛蓝胭脂红退色法测定酶活.取GOD酶液1.0 mL，加入质量浓度为3 mg/mL的葡萄糖溶液5 mL，在36 ℃的水浴中振荡反应10 min后终止反应，得到酶反应液．在25 mL的具塞比色管中，分别加入pH 4.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液3.0 mL 和1.3 mL的靛红溶液，再加入1 mL的上述酶反应液，于沸水浴中加热13 min 后，取出冰水浴冷却5 min，终止反应，在615 nm波长下测定吸光度值．每分钟转化葡萄糖反应产生1 μmolH2O2所需的酶量定义为1个酶活单位．Keston法测定酶活.配置质量浓度为0.66 mg/mL邻联茴香胺溶，吸取1.0 mL，用pH=5.0的0.05 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释到100 mL，在比色杯中分别加入2.4 mL邻联茴香胺溶液、0.5 mL的1 mg/mL的葡萄糖溶液和0.1 mL质量浓度为0.1 mg/mL的HRP(辣根过氧化物酶)溶液，摇匀，于35 ℃的水浴中振荡反应5 min后加入0.1 mL的葡萄糖标准溶液或样品，快速混匀并立即置于分光光度计中在500 nm下记录不同时间的吸光度值，将吸光度值对时间作图，求得酶活．葡萄糖酸的测定.采用HPLC测定，分析柱为C18反向色谱柱，测定的条件为：柱温30 ℃，洗脱剂为甲醇：水(V∶V)=5∶95，NaH2PO4 3.2×10-3 mmol/L，磷酸调节pH值到2.7，流速为1 mL/min，检测波长为254 nm．2.1 CAT去除酶反应液中的H2O2生物传感分析仪的工作原理在于自身所带有的固定在膜上的GOD氧化葡萄糖时产生H2O2，H2O2失去电子产生电流，通过间接测定H2O2的量而得到葡萄糖的含量．由于在测定GOD的酶活时，反应液中产生了H2O2，这样在仪器上会显示葡萄糖的含量偏大，会对测定产生误差，因此，在测定葡萄糖的含量时，其体系中不能有H2O2.在测定酶活之前，首先要去除酶反应液中的H2O2，这一点有别于使用生化分析仪测定其它样品中葡萄糖的含量．去除H2O2最有效的方法是采用CAT去除，该酶是催化过氧化氢分解成氧和水的专一性的酶，相比较化学催化剂，其反应条件温和，对环境没有污染．最为关键的一点是CAT催化效率极高，在一定的条件下，1 mol铁离子每分钟可催化10-5 mol的H2O2分解；在相同的条件下，1 mol的CAT在1 min可以催化105 mol的H2O2分解，催化效率是铁离子的1 010倍[9]．考察了在酶反应液中添加CAT的量以及反应时间对葡萄糖测定的影响．CAT的加入量和反应时间对于分析仪测定葡萄糖含量的影响分别如图1、图2所示.当葡萄糖的测定曲线趋于平稳时，说明此时酶反应液中所产生的过氧化氢已经被去除，采用过氧化氢试剂盒测定，也证实其中的过氧化氢检测不到．因此，在使用生物传感分析仪测定样品之前，样品中需要加入0.4 mL的CAT，在30 ℃下反应10 min，达到去除酶反应液中的H2O2的目的．2.2 酶活测定反应条件的建立在已有的文献报道中，在GOD酶活测定时，其反应条件的描述都有不同，即使是同一种方法，反应的条件也有所不同，并且生物传感分析仪分析葡萄糖的浓度范围是0～1 mg/mL，因此需要根据酶活的定义及仪器本身的特点，设定酶反应的最适条件，才能反应酶的基本性质和准确测定出酶的活力．(1)底物浓度对酶活测定的影响.酶活测定的实质是测定反应的初速率，因此底物的浓度必须满足酶反应的需要，且要保证底物在过量的情况下对反应没有抑制作用．将0.5 mL酶液加至5 mL葡萄糖溶液，葡萄糖质量浓度从1 mg/mL到5mg/mL，pH值为5.5，反应温度35 ℃．结果如图3所示.由图3可知，底物质量浓度为3 mg/mL时，酶活值达到最大并趋于平稳．在实验中，由于酶活在正常的范围之内，所以测定的剩余的葡萄糖的含量在分析仪的读数范围之中．(2)反应温度对酶活测定的影响.温度是影响酶促反应的重要因素之一．在适宜温度范围内，酶才能进行催化反应；在最适的温度条件下，酶的催化反应速度才能达到最快．考察了不同反应温度对酶活测定的影响，在其它条件不变的情况下，反应温度从30 ℃到40 ℃，实验结果如图4所示.由图4可以看出，酶活测定最适反应温度是36 ℃，在此条件下GOD催化反应的初速度达到最大，从而体现在酶活测定上其酶活值达到最大．(3)pH值对酶活测定的影响.在酶催化反应时，pH发生改变，酶蛋白分子和底物分子中基团的解离状态也会随之改变，从而影响酶分子的空间构象以及酶与底物的结合能力和催化能力，进而对酶的活力产生影响．考察了从4到6.5之间不同的pH 值对酶活测定的影响，实验结果如图5所示.由图5可知，最适pH为5.0．2.3 应用按照以上所获得的条件，对所购买的GOD进行了测定，同一批样品测定8次，实验结果如表1所示.由表1可知，8次测定的RSD为1.14%，说明该方法精密度良好．同时，为了考察该方法的稳定性，按照1.2所示的实验方法，分别在0 h、1h、2 h、3 h、4 h、5 h检测样品的酶活，其酶活值分别为54.8、54.6、55.0、55.3、55.2和55.9，其RSD为1.5%，说明供测试的样品在5 h内基本保持稳定．2.4 对比实验为了考察本方法的准确性，将之与滴定法、靛蓝胭脂红退色法和Keston法做对比实验.因为在所有的检测方法中，液相色谱法最为精确，所以以高效液相色谱测定产物中的葡萄糖酸的含量推算出的酶活作为标准.每个样品检测3次，取平均值，不同测定方法的检测结果如表2所示．以HPLC法测定的酶活为54.3 U/g，由表2可以看出，采用生物传感分析仪测定的酶活为55.2 U/g，与HPLC法测定酶活的相对误差为1.65%，是这几种方法中误差最小的．同时，该方法具有简便、快速、一次性可以大量测量的优点．通过检测葡萄糖含量的减少建立起GOD酶活的检测方法．利用外加过氧化氢酶CAT去除酶反应液中的H2O2，排除了其对测定的干扰.通过反应条件的优化，建立了最适酶活测定条件．利用该方法可以准确、快速和大批量地测定GOD的酶活．如果采用不同的酶膜就可以测定不同的物质，相应地也可以测定谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶等酶的活力．研究不仅提供了一种新的测定GOD酶活的方法，还大大拓宽了生物传感分析仪的用途．【相关文献】[1] M V Sukhacheva,M E Davydova,A I Netrusov.Production of Penicillium Funiculosum 433 Glucose Oxidase and its Properties[J].Applied Biochemistry andMicrobiology,2004,40(1): 25-29.[2] D G Hatzinikolaou,O C Hansen,B J Macris,et al.A New Glucose Oxidase from Aspergillus Niger:Characterization and Regulation Studies of Enzyme and Gene[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1996,46(4):371-381.[3] 郝杰清,王帅坤,师慧,等.重组毕赤酵母葡萄糖氧化酶的纯化和性质[J].食品科学,2013,34(9):159-163.[4] S Crognale,M Petruccioli,M Fenice,et al.Fed-batch Gluconic Acid Production from Penicillium Variabile P16 Under Different Feeding Strategies[J].Enzyme and Microbial Technology,2008,42(5):445-449.[5] L A Underkofler.Properties and Applications of the Fungal Enzyme GlucoseOxidase[J].Enzyme Chemistry,1957(2):486-490.[6] 周建芹,陈韶华,王剑文.测定葡萄糖氧化酶活力的一种简便方法[J].实验技术与管理,2008,25(12):58-60.[7] F M Bautista,J M Campelo,A Garcia,et al.Properties of a Glucose Oxidase Covalently Immobilized on Amorphous ALPO4 Support[J].Journal of Molecular CatalysisB:Enzymatic,2001,11(4):567-577.[8] 李宪民,丁芳,樊伟丽,等.生物传感分析仪测定葡萄糖和L-乳酸的影响因素研究[J].食品工业科技,2009，30(2):289-291.[9] 郭勇.酶工程:第四版[M].北京:科学出版社, 2016.。

实验血糖测定（葡萄糖氧化酶法）【目的】体外测定血清或血浆中葡萄糖含量。

【临床意义】葡萄糖的正确测定对于诊断高血糖症是十分重要的。

平时在查找这些病症的来由时，还将各种耐量试验和控制试验与葡萄糖测定一同进行。

葡萄糖含量增高见于：糖尿病、葡萄糖摄入过分、柯兴氏综合症、脑血管不测。

葡萄糖含量减少见于：胰岛瘤、胰岛素过分、先天性碳水化合物代谢阻挡。

【原理】样本中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将还原性 4- 氨基安替比林与酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。

【器材】紫外分光光度计，恒温水浴箱，移液器（枪），枪头，试管【药品】葡萄糖测定试剂盒，试剂盒主要成分与浓度：试剂主要成分实验浓度R1葡萄糖氧化酶（ GOD）≥ 13000U/L过氧化物酶（ POD）≥ 900U/LR2磷酸缓冲液（）100mmol/L酚11mmol/L4- 氨基安替吡啉L葡萄糖标准液L(100mg/dl)【样本】新鲜无溶血血清。

【步骤】将10ml R1与90ml R2混杂均匀，即为工作液。

空白管校准管样品管工作液ml ml ml蒸馏水ml————校准液——ml——样品————ml 分别混杂均匀， 37℃水浴 10～15分钟（防备太阳光直射），用波长505nm、比色杯光径，用空白管调“零”点测定各管的吸光度（A）值。

【计算】【参照值】血清 / 血浆：— mmol/L (70 —110 mg/dl) 。

此范围仅供参照，各实验室须建立本室的参照值范围。

【参照文件】1．全国临床检验操作规程（第二版），主编：叶应妩，王敏三， 1997，P616.2．Trinder P. Ann Clin Biochem，1969，6: 24-27.血糖测定实验所需器材：1.紫外分光光度计（比色杯光径），2.恒温水浴箱（能调温度的， 37℃），3.移液器（枪）（规格 6 个， 20μl 6 个），枪头各 100个4.试管 50支， 6个试管架5.烧杯 100ml一个， 50ml（或 25ml） 6个6.记号笔 6支7.蒸馏水 1瓶。