一株蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究

低温蛋白酶产生菌的筛选及其酶学性质的初步研究莫清珊;张会图;田耀;孙同韦;冯士元;孙军;路福平【摘要】从南印度洋深海沉积物中筛选获得1株产低温蛋白酶的嗜冷菌株11815，经16S rDNA鉴定，结合菌株的形态结构特征和生理生化特性分析，确定其为动性球菌属(Planococcus sp.)．该菌株的最适生长温度及最佳产酶温度均为20,℃，经发酵条件初步优化后，48,h内摇瓶水平的蛋白酶产量可达280,U/mL；酶学性质分析结果显示：该菌株所产蛋白酶的最适作用温度为37,℃，最适pH为8.0，30,℃条件下可保持最高催化活力的80%以上，而在25～30,℃仍具有较高的催化活力(保持最高催化活力的50%以上)．该菌株所产蛋白酶属于典型的低温蛋白酶，在常温下具有较好的催化活性，因此在食品加工业及冷水洗涤剂开发等方面具有较高的研究价值．%A psychrophilic bacterium 11815 was isolated from the deep sea mud of southern Indian ocean to produce cold-adapted protease and the product was identified asPlanococcussp. according to its morphological and physiochemical char-acteristics as well as 16S rDNA sequence analysis. The optimal temperature for its growth and protease production was 20,℃and the protease production reached 280 U/mL after 48 h fermentation in shake flask. The optimal pH and temperature for producing protease were 8.0 and 37,℃. At 30,℃,the relative activity reached 80% of the highest activity. Even at lower tem-peratures from 25,℃ to 30,℃,the relative activity still reached more than 50% of the highest activity. These enzymatic prop-erties indicate that the protease producedby the newly isolated psychrophilic strain belongs to the class of cold-adapted pro-teases and possesses a high application potential in food processing and cold-water detergents.【期刊名称】《天津科技大学学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P19-23)【关键词】低温蛋白酶;动性球菌;分子鉴定【作者】莫清珊;张会图;田耀;孙同韦;冯士元;孙军;路福平【作者单位】天津科技大学生物工程学院，天津 300457;天津科技大学生物工程学院，天津 300457;天津科技大学生物工程学院，天津 300457;天津科技大学生物工程学院，天津 300457;天津科技大学生物工程学院，天津 300457;天津科技大学海洋科学与工程学院，天津 300457;天津科技大学生物工程学院，天津300457【正文语种】中文【中图分类】Q786低温蛋白酶是指最适催化温度在40,℃以下，并且在20～30,℃仍能保持较高酶活(50%以上)的一类蛋白水解酶[1].由于其最适催化温度接近自然环境中的温度，因此在应用过程中可省去加热或冷却过程，与中高温蛋白酶相比具有节能、省时等特点，在食品及洗涤行业具有广泛的应用前景.低温蛋白酶多数来源于冰川、极地、高山、深海等低温环境中的嗜低温或耐低温微生物[2–3].这些低温微生物为了适应其所处的低温环境，常可表达分泌一些在低温条件下仍具有较高催化活性的胞外酶或胞内酶，因此从耐低温或嗜低温微生物中筛选获得低温蛋白酶已成为发掘新型工业用低温酶制剂的主要方法[4].目前已发现的产低温蛋白酶菌株有来源于冰川冻土中的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和短小杆菌(Curtobacterium luteum)、来源于南极地区的梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)和嗜冷杆菌(Psychrobacter proteolyticus)、来源于海洋浮冰中的科尔韦尔氏菌属(Colwellia sp.)、来源于寒漠地区的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)以及来源于其他寒冷环境中的沙雷氏菌(Serratia sp.)、弧菌(Vibrio sp.)、黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)产黄青霉(Penicillium chrysogenum)等.这些菌株所产低温蛋白酶的最适催化温度大部分均在30～40,℃，只有少数几种的最适催化温度低于20,℃，但稳定性很差.国内对低温蛋白酶及其产生菌的研究起步较晚，研究对象多集中在来源于冰川及冻土中的假单胞菌属 (Pseudomonas)、黄杆菌属(Xanthomonas)、产气单胞菌属(Aeromonas)等.本研究则从深海沉积物中分离到1 株产低温蛋白酶动性球菌(Planococcus sp.)，并对该菌株的生长特性、产酶特性及其所产蛋白酶的酶学性质进行了研究.1 材料与方法1.1 菌株来源嗜冷菌株由天津科技大学孙军教授提供的南印度洋的深海沉积物中分离得到.1.2 主要试剂和仪器连接酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP、T 载体、DNA Marker，宝生物工程(大连)有限公司；酪蛋白、琼脂粉、缓冲液试剂，上海生工生物工程有限公司.PCR 仪、凝胶成像仪、电泳系统，美国Bio-Rad公司；1500–201 型全波长酶标仪，美国热电公司.1.3 培养基酪蛋白筛选培养基：酪蛋白20,g，琼脂15,g，人工海水定容到1,L，调节pH 到7.5～8.0.发酵培养基：ZoBell 2216E 培养基.1.4 产低温蛋白酶菌株的分离与鉴定1.4.1 产低温蛋白酶菌株的分离取深海沉积物样品1,g，加入20,mL 生理盐水，涡旋振荡混匀.按10 倍稀释法稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 6 个稀释度的稀释液，每个稀释度各取0.2,mL 稀释液涂布于3 个酪蛋白筛选培养基平板上，并分别于4、20、25,℃培养72,h.选取菌落周围有明显蛋白水解圈的菌落于酪蛋白分离培养平板上进行三区划线纯化培养.根据水解圈直径dH与菌落直径dc的比值确定菌株低温条件下产蛋白酶能力的大小.1.4.2 16S,rDNA 的克隆及系统进化分析菌体基因组提取参照文献[5]进行；以上述基因组为模板，以细菌 16S rDNA 通用引物 27,F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492,R(5'-AGT AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3')对16S rDNA 进行PCR 扩增.PCR 反应条件为：94,℃预变性5,min，然后94,℃ 60,s，55,℃ 90,s，72,℃ 120,s，循环30 次，72,℃ 延伸10,min.扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳回收后克隆至T 载体，并委托北京华大基因公司测序.将所得序列在NCBI 网站进行 Blastn 比对(/BLAST)，确定与其相关的种属特性.1.4.3 菌株形态及生理生化特性鉴定最适生长温度、菌落形态、革兰氏染色、氧化酶活性检测、过氧化氢酶活性检测、明胶液化实验参照文献[6]进行.1.5 蛋白酶粗酶液的制备及酶活测定将种子培养液以2%的体积比接种至50,mL 发酵培养基，分别在不同温度下(15、20、25,℃)，200,r/min振荡培养52,h，定时取样，考察不同培养温度对产酶的影响.收集菌液于4,℃、10,000,r/min 离心30,min，收集上清液.以酪蛋白为底物的酶活的测定方法参照文献[7]进行；根据QB/T 1803—1993《工业酶制剂通用试验方法》，以1,mL 酶液在37,℃、pH 8.0 条件下，每分钟反应产生1,μg 酪氨酸所需要的酶量为1 个酶活力单位(U/mL).粗酶液用缓冲溶液稀释至适当浓度，作为待测酶液.缓冲液配制1%的酪素溶液作为底物并将粗酶液稀释适当的倍数.取1,mL 稀释的酶液，37,℃保温2,min，加入同样温度的底物 1,mL，于37,℃反应10,min，加入2,mL 质量分数10%三氯乙酸终止反应.静置离心，取1,mL 上清液，加入5,mL 0.4,mol/L Na2,CO3溶液、1,mL福林酚试剂，混匀，40,℃保温20,min，测定吸光度A680.以灭活酶液为空白对照.1.6 酶学性质分析1.6.1 温度对蛋白酶酶活的影响分别将1,mL 粗酶液与1,mL 水解酪蛋白溶液(1%，pH 8.0)混匀，分别在4～50,℃ 测定酶活力，以酶活力最高时为100%，计算其他条件下的相对酶活力.1.6.2,pH 对蛋白酶酶活的影响用不同pH 的乳酸钠缓冲液(pH 2.0、3.0、4.0、5.0)、磷酸盐缓冲液(pH 6.0、7.0、7.5、8.0)、硼砂缓冲液(pH 9.0、10.0)将待测酶液进行适当的稀释，在37,℃及相应pH 条件下测定酶活，酶活数值最大者计为100%，所对应的pH 即为待测酶最适反应pH，其他pH 下的酶活与最高酶活的比值即为其相对酶活.1.6.3 蛋白酶的热稳定性检测将粗酶液分别在10、37、45,℃保温30、60、90、120,min 后测定残余酶活，以未进行保温处理的酶活力值作为对照，设定其相对酶活力为100%，得出酶活力随保温时间变化的曲线.1.6.4 不同金属离子及化学试剂对蛋白酶酶活的影响将待测酶液置于不同浓度(5、1,mmol/L)的Ca2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+缓冲液中，4,℃保温1,h，在pH 10.0、37,℃条件下测定残留的酶活.将待测酶液置于EDTA、PMSF、β-ME 缓冲液中，4,℃保温1,h，在pH 10.0、37,℃条件下测定残留的酶活.2 结果与分析2.1 产低温蛋白酶菌株的筛选低温培养条件下不同菌株的蛋白水解圈形成情况如图1 所示.在低温培养条件下(4～10,℃)，经透明圈筛选以及划线纯化后复筛，共获得3 株具有分泌表达蛋白酶能力的菌株，分别将其编号为11813、11815 以及11816.其中菌株11815 的蛋白酶分泌表达能力较强，在培养温度为10,℃的条件下，24,h 内，其蛋白水解圈直径与菌落直径的比值(dH/dc)最高可达2.77；而在相同条件下，菌株11813 及11816 的dH/dc则分别仅有1.78 和1.60.图1 低温培养条件下不同菌株的蛋白水解圈形成情况Fig.1 Cold protease transparent zone formed by strains在不同培养温度下，分别对上述3 株产蛋白酶菌株进行液体发酵培养，菌株11815 在4～37,℃均可生长，其最适生长温度为20,℃左右，当温度大于等于40,℃时，则生长极为缓慢甚至停止生长；菌株11813及11816 的最适生长温度与菌株11815 相似，因此均属于典型的耐冷菌.由于菌株11815 的产蛋白酶能力较强，因此作为下一步重点研究对象.2.2 菌株11815的分析鉴定菌株11815 属革兰氏阳性菌，呈球形或卵圆形，直径约1.0～1.2,μm，呈双球状或连珠状排列；菌落形态圆形，颜色橙黄色，表面光滑、边缘齐整.该菌属好氧性或兼性厌氧菌，可较好利用葡萄糖、果糖、淀粉等碳源，能够利用硫酸铵、蛋白胨、水解酪蛋白等氮源；具有氧化酶、过氧化氢酶活性，明胶液化实验呈阳性.该菌16S rDNA 全长序列为1,450,bp，与动性球菌(Planococcus antarcticus) DSM 14505 的相似度为99%，结合形态特征和生理生化特性，将其鉴定为动性球菌属.2.3 温度和pH对菌株11815产酶的影响在摇瓶发酵条件下，研究不同培养温度(15、20、25,℃)对菌株11815 产酶的影响，结果如图2 所示.结果表明：该菌株的最佳生长温度与最适产酶温度相一致，均为20,℃，发酵培养48,h 可达到产酶高峰，产酶量约为280,U/mL.在菌体培养的初级阶段，菌体的生长量与产酶量呈正比；当菌体生长达到平衡期后，菌体量不再增加，而粗酶液中的蛋白酶活性则开始下降，这可能与蛋白酶的自身降解有关.从上述实验结果推断：该蛋白酶的表达应为组成型表达，只与菌体量有关，而与其他诱导因素无关.因此在发酵过程中设法提高菌体浓度，同时在发酵液中加入适量蛋白酶抑制剂，可有效提高蛋白酶产量.图2 培养温度对产酶的影响Fig.2 Effect of culture temperature on enzyme productionpH 对菌株产酶的影响较小，初始pH 在6～8 之间，菌株11815 均可稳定生长并产酶.2.4 酶学性质分析2.4.1 酶的最适作用温度及热稳定性检测在不同温度下分别对菌株11815 发酵液中的蛋白酶活性进行了检测，结果如图3 所示.该菌株所产蛋白酶的最适作用温度为37,℃左右，并且在25～30,℃均有较好的催化活性(最高催化酶活的50%以上)，与其他低温蛋白比较发现，蛋白酶SKPB5 以及焦曲霉(Aspergillus ustus)、假单胞菌(Pseudomonas)strain DY-A分泌的蛋白酶等，最适温度在 40～42,℃[8–10]，11815 分泌的蛋白酶的最适作用温度更低.因此，该菌株所产蛋白酶的最适作用温度与自然环境中的温度基本一致，在使用过程中可以省去加热及冷却的过程，具有节能环保等应用属性.图3 蛋白酶的作用温度与相对酶活的关系Fig.3 The relationship between protease temperature and the relative enzyme activity酶的热稳定性实验结果如图4 所示.该菌株所产蛋白酶的热稳定性较低，37,℃保温20,min 或45,℃保温60,min 后，酶活仅剩原来的10%；50,℃保温10,min 后，则催化活性完全丧失；该蛋白酶只有在10,℃以下才能保存较长的时间；这一特性与大多数低温蛋白酶[7–9]相似，主要与低温蛋白酶本身较为松散的蛋白结构及其较高的分子柔性有关.图4 蛋白酶的热稳定性Fig.4 Effects of temperature on the stability of protease activity2.4.2 酶的最适作用pH分别在不同pH 条件下测定菌株11815 所产蛋白酶活力，酶活力随pH 变化的曲线如图5 所示.该酶在pH 4.0～10.0 均具有催化活力，其最适作用pH为8.0 左右；当pH 升至9.0 时，其酶活约为最高酶活的70%左右，当pH 升至10.0 时，酶活大幅下降，仅为最高酶活的25%；当pH 降至7.0 时，酶活力约为最高活力的82%.因此，该菌株所产蛋白酶为低温蛋白酶.图5 蛋白酶的作用pH与相对酶活的关系Fig.5 The relationship between pH of protease and the relative enzyme activity2.4.3 不同金属离子及化学试剂对蛋白酶酶活的影响不同金属离子及化学试剂对蛋白酶酶活的影响见表1.表1 不同的金属离子、抑制剂对蛋白酶酶活的影响Tab.1 Effect of various metal ions and inhibitors on protease activity注：空白为最适pH 和最适温度下未添加金属离子及化学试剂情况下的酶活.金属离子Ca2+对该菌株所产蛋白酶有激活作用，Mn2+对其基本没有影响；Mg2+、Ba2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Ni2+则对其有一定的抑制作用，Ni2+对其抑制作用最强，浓度为1.0,mmol/L 的Ni2+可抑制90%以上的酶活，因此组氨酸可能是该酶的活性中心之一；EDTA 对该酶有一定抑制作用，某些金属离子可能对维持酶分子的三维结构有重要作用；另外，该酶被PMSF 强烈抑制，因此该菌株所产蛋白酶的活性位点应包括His、Ser 以及羧基氨基酸.3 结语从南印度洋深海沉积物中分离得到1 株产低温蛋白酶菌株，经菌种鉴定为动性球菌(Planococcus sp.).该菌株的最适生长温度为20,℃左右，可在10～25,℃进行快速生长代谢；并在20,℃以下具有表达分泌低温蛋白酶的能力，最适的培养温度为20,℃，摇瓶发酵条件下，48,h 内的蛋白酶产量可达280,U/mL.酶学性质分析结果显示：该菌株所产蛋白酶的最适作用pH 为8.0，最适作用温度为37,℃，当催化温度降至30,℃时，酶活可保持在80%以上，并且在4,℃条件下仍具有水解蛋白的能力.EDTA 对该酶有一定抑制作用，PMSF 对该酶具有强烈抑制作用，因此该菌株所产蛋白酶的活性位点应包括His、Ser 以及羧基氨基酸.该酶热稳定性较差，50,℃仅保温1.0,min，则酶活完全丧失.由该菌株所产蛋白酶的上述特性表明，该酶属于典型的低温蛋白酶，具有一定的研究及开发价值.本课题组还将对该低温蛋白酶的编码基因进行分离与克隆，并进一步尝试在其他宿主菌中实现其高效异源表达.参考文献：［1］Joshi S，Satyanarayana T.Biotechnology of cold-activeproteases[J].Biology，2013，2(2)：755–783.［2］Pawar R，Zambare V，Barve S，et al.Application of protease isolated from Bacillus sp.158 in enzymatic cleansing of contactlenses[J].Biotechnology，2009，8(2)：276–280.［3］Kuddus M，Ramteke P W.Recent developments in production and biotechnological applications of cold-active microbial proteases[J].Critical Reviews in 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一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建引言蛋白酶是一类能够催化蛋白质降解的酶，广泛应用于食品工业、制药工业以及生物工程等领域。

本文旨在通过对一株蛋白酶产生菌的鉴定和酶性质研究，以及构建合适的表达载体,为进一步研究和应用提供理论和实验基础。

1.蛋白酶产生菌的鉴定为了找到适合产生目标蛋白酶的菌株，我们采用了一系列的方法进行菌株的筛选和鉴定。

11样品采集和处理从不同环境中采集样品，如土壤、水样、废弃物等。

样品收集后，使用适当的稀释液或生理盐水进行稀释，并进行菌落分离，得到单菌株。

1.2形态学鉴定通过观察菌株的菌落形态、菌落色素、胶质酶分解等特征进行初步鉴定。

1.3生理生化鉴定通过生理生化指标的测定，如代谢产物的产生、碳源利用和氮源利用等，对菌株进行进一步鉴定。

1.4分子生物学鉴定通过16SrRNA基因序列分析或其他分子鉴定方法，对菌株进行进一步确认，并与已知菌株进行比对和分类。

2.蛋白酶性质研究对已鉴定的产生蛋白酶的菌株进行酶性质研究，包括底物特异性、反应条件优化、酶活验证等。

2.2底物特异性研究通过对不同底物进行酶促反应,观察蛋白酶对不同底物的催化效果,确定其底物特异性。

2.3反应条件优化通过调整反应系统中的PH值、温度、底物浓度等条件，优化蛋白酶的酶活和稳定性。

2.4酶活验证采用适当的酶活测定方法，如比色法、荧光法等，对蛋白酶的酶活进行定量测定。

3.表达载体构建为了进一步研究蛋白酶的性质和应用,需要构建合适的表达载体，实现目标蛋白的高效表达。

3.2载体选择选择适合目标蛋白表达的载体，考虑载体的复制起点、选择标记等因素。

3.3基因克隆将目标蛋白酶的基因克隆到选择的表达载体上，使用适当的限制性内切酶进行连接和酶切。

3.4转化和筛选将表达载体输送到宿主菌中，通过转化和筛选得到表达目标蛋白的菌株。

3.5表达条件优化通过调整培养基成分、培养条件等因素，优化目标蛋白的表达水平。

结论通过对一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建,我们为进一步研究W应用蛋白酶提供了理论和实验基础。

对于一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建，以下是一般的步骤和方法：1. 鉴定：使用适当的鉴定方法对分离得到的菌株进行鉴定。

常用的鉴定方法包括形态学观察、生理生化试验和分子生物学特征分析。

分子生物学特征分析可以利用16S rRNA序列或其他保守基因序列进行比对和系统发育分析，以确定该菌株的分类地位。

2. 酶性质研究：对蛋白酶产生菌株的酶性质进行研究，包括酶的底物特异性、最适pH和温度、热稳定性、抗蛋白酶等特性的测定。

这可以通过酶活性测定、底物降解实验和相关酶学实验方法来完成。

3. 表达载体构建：如果希望进一步研究蛋白酶的功能、机制和应用，通常需要将其基因克隆到适当的表达载体中。

以下是一般的表达载体构建步骤：a. 基因克隆：提取菌株的基因组DNA或RNA，通过PCR或其他方法扩增目标蛋白酶基因。

b. 限制性内切酶切割：将扩增得到的基因与目标表达载体进行限制性内切酶切割，生成互补的黏性末端。

c. 连接：使用DNA连接酶将蛋白酶基因与表达载体进行连接。

连接后，可以使用大肠杆菌等常见宿主细胞进行转化。

d. 筛选和验证：筛选含有目标蛋白酶基因的正向克隆子，并通过DNA测序验证插入序列的正确性。

e. 表达：将正向克隆子转化至合适的宿主细胞，如大肠杆菌，利用诱导剂（如IPTG）诱导目标蛋白酶的表达。

f. 纯化与鉴定：利用相关的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析等，纯化表达的蛋白酶，并对其进行酶学特性和功能的进一步研究。

通过以上步骤，可以对蛋白酶产生菌株进行鉴定、研究其酶性质，并构建表达载体，进一步研究蛋白酶的功能和应用。

这些工作有助于深入了解蛋白酶产生菌株及其蛋白酶的特性，并为后续的蛋白酶应用和工业化生产提供基础。

《一株产普鲁兰酶菌的筛选鉴定及其酶学活性研究》一、引言普鲁兰酶是一种重要的工业酶制剂，广泛应用于淀粉糖、酿酒、生物能源等工业领域。

近年来，随着生物技术的不断发展，对普鲁兰酶的来源和性质研究越来越深入。

本文旨在筛选一株高产普鲁兰酶的菌株，并对其进行鉴定和酶学活性研究，为普鲁兰酶的工业化生产提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料（1）样品来源：从不同环境样品中采集菌种样本。

（2）培养基：采用淀粉培养基、酵母膏蛋白胨培养基等。

（3）试剂：包括酶活性检测试剂、DNA提取试剂等。

2. 方法（1）菌种筛选：通过平板划线法、富集培养法等方法，从样品中筛选出产普鲁兰酶的菌株。

（2）菌种鉴定：采用形态观察、生理生化试验、分子生物学方法等对筛选出的菌株进行鉴定。

（3）酶学活性研究：通过测定酶活性、酶动力学参数等，研究普鲁兰酶的酶学性质。

三、实验结果1. 菌种筛选结果经过多次筛选和纯化，从采集的样品中成功筛选出一株高产普鲁兰酶的菌株，命名为“XX菌”。

该菌株在淀粉培养基上生长良好，产酶能力强。

2. 菌种鉴定结果通过形态观察、生理生化试验和分子生物学方法对XX菌进行鉴定。

结果显示，XX菌属于一种革兰氏阳性菌，具有较好的耐热性和耐酸性。

通过16S rRNA基因序列比对，发现XX菌与某已知菌种具有较高的相似性，但存在一定的差异。

综合分析表明，XX菌是一种新型的产普鲁兰酶菌株。

3. 酶学活性研究结果通过测定普鲁兰酶的活性、最适pH值、最适温度等参数，发现XX菌产生的普鲁兰酶具有较高的活性，最适pH值为5.0~6.0，最适温度为50℃左右。

此外，该酶的动力学参数Km值和Vmax值也表明其具有较高的催化效率。

四、讨论本研究成功筛选出一株高产普鲁兰酶的菌株XX菌，并对其进行了鉴定和酶学活性研究。

结果表明，XX菌具有较好的产酶能力和酶学性质，为普鲁兰酶的工业化生产提供了新的资源。

同时，对普鲁兰酶的性质研究有助于进一步了解其催化机制和工业应用价值。

一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建是一个涉及微生物学、生物化学和分子生物学等多个领域的综合性实验。

以下是该实验的详细步骤：一、蛋白酶产生菌的鉴定1.观察菌落的形态和颜色：将待鉴定菌株接种在固体培养基上，观察菌落的形状、大小、隆起程度、颜色等特征。

与已知蛋白酶产生菌的菌落特征进行比较，初步判断待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌。

2.显微镜观察：将待鉴定菌株进行显微镜观察，观察其细胞形态、大小、排列方式等特征。

与已知蛋白酶产生菌的显微镜特征进行比较，进一步确定待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌。

3.生理生化实验：进行一系列的生理生化实验，包括碳源利用实验、氮源利用实验、生长曲线测定、氧化还原实验等，进一步确定待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌，并对其生长特性和代谢特性进行研究。

4.分子生物学鉴定：提取待鉴定菌株的基因组DNA，进行PCR扩增和序列分析，与已知蛋白酶产生菌的基因序列进行比对，确定待鉴定菌株的分类地位和系统发育关系。

二、蛋白酶性质研究1.蛋白酶的分离纯化：从待鉴定菌株中提取蛋白酶，通过离子交换层析、凝胶过滤等手段进行分离纯化。

2.酶活性检测：设置合适的底物浓度和反应条件，测定蛋白酶的活性，包括最适pH、最适温度、动力学常数等。

3.酶稳定性研究：在不同温度、pH等条件下，检测蛋白酶的稳定性，确定其应用范围和使用条件。

4.底物特异性分析：通过蛋白质印迹实验、底物特异性分析等方法，研究蛋白酶的底物特异性，为其应用提供依据。

三、表达载体构建1.目的基因获取：通过PCR扩增或基因组测序等方法，获取蛋白酶基因。

2.载体选择：根据目的基因的特点和应用需求，选择合适的表达载体，如质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。

3.载体构建：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。

可以采用DNA重组技术、定向进化技术等方法，对目的基因进行改造和优化。

4.转化宿主细胞：将重组表达载体转入合适的宿主细胞中，常用的宿主细胞包括细菌、酵母、昆虫细胞等。

一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定随着全球气候变化和人类活动的影响，盐碱化和荒漠化的问题日益严重。

盐碱土壤中的高盐浓度不但对植物生长带来影响，也对微生物生长带来极大的压力。

而在这样的环境中，若能筛选出一些耐盐菌株，对维护土壤生态平衡和提高农业生产力都有着积极的意义。

本研究采用土壤样品培养菌株与测序分析相结合的方法，筛选出一株耐盐蛋白酶高产菌，并对其进行初步鉴定和评价。

1、筛选菌株从渭南市半夏沟盐碱土壤中挖取样品，使用平板法选取耐盐菌。

筛选条件为：15%NaCl、pH=8.0、温度为37°C。

经过3个孔眼培养基的筛选后，获得了一株能够在高盐高碱环境下生长的菌株。

2、16S rRNA测序分析使用菌落PCR方法提取该菌株的基因组DNA，将其16S rDNA片段扩增并纯化，测序结果表明该菌株属于葡萄球菌属。

经过BLAST比对分析，其与NCBI数据库中的Staphylococcus arlettae的同源性可达到99.67%。

3、蛋白酶高产能力评价培养该菌株于含有1.5%NaCl的LB培养基中，经过48小时后采集细胞沉淀并测定其蛋白酶活性水平。

结果表明，该菌株可产生100U/mL的蛋白酶活性，具有良好的蛋白酶高产能力。

4、耐盐性评价在不同浓度的NaCl中对该菌株进行耐盐性评价。

结果表明该菌株最大耐盐浓度为18%NaCl，具有较强的耐盐能力。

5、蛋白酶酶学性质研究将该菌株的蛋白酶纯化并研究其酶学性质。

结果表明，该蛋白酶在pH=9.0~10.0和温度为50℃时具有最高酶活性，属于碱性蛋白酶。

综合上述结果可知，本研究筛选出一株具有较强耐盐能力和蛋白酶高产能力的Staphylococcus arlettae，对于盐碱土壤的改良和农业生产都具有重要的潜在应用前景。

一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定随着生物技术的不断发展，酶工程在生物技术领域中扮演着重要的角色。

蛋白酶是一类具有广泛应用价值的酶类，在生物工程、医药、食品加工等领域具有重要的应用价值。

目前市场上大多数的蛋白酶都是来源于微生物，因此寻找高产、耐盐蛋白酶的菌株成为了当前的研究热点之一。

本研究旨在筛选出一株耐盐蛋白酶高产菌，并对其进行初步鉴定和研究。

一、菌株的筛选1. 样品的采集样品是研究的基础，本研究选择了海水作为原料，海水中的微生物菌落丰富，是寻找耐盐菌株的理想来源。

在采集海水样品时，需要避免外界的污染，同时要选择距离海岸较远的地点进行采样。

2. 耐盐菌的筛选在采集得到的海水样品中，我们采用平板和液体培养的方法进行菌株的筛选。

首先将样品进行稀释，之后在含有不同盐浓度的琼脂平板上进行培养。

经过一段时间的培养后，观察并挑选出耐盐能力较强的细菌菌落进行复苗。

接着将耐盐菌菌液接种到含有不同盐浓度的液体培养基中，再次筛选出最适合耐盐性能力的菌株。

3. 蛋白酶产生菌株的筛选得到耐盐菌株后，我们将其进行蛋白酶产生能力的筛选。

将筛选得到的菌株分别接种到富含蛋白质的培养基中，之后进行培养和振荡，并使用凝胶电泳和光谱法检验菌株的蛋白酶产生能力。

二、菌株的初步鉴定1. 形态学鉴定接下来，我们对耐盐蛋白酶高产菌进行初步的形态学鉴定。

首先观察菌落的形态、颜色等特征，然后将其进行革兰氏染色和酸性染色等基本染色实验。

2. 生理生化特性鉴定在对菌株进行了形态学鉴定后，我们还需要对其进行生理生化特性鉴定。

菌株的氧气需求情况、产酶酶素的特性、温度和酸碱度的耐受能力等。

3. 分子生物学鉴定我们还将对该菌株进行分子生物学鉴定。

利用PCR扩增技术对其进行16S rDNA序列的测定和分析。

通过与NCBI数据库中已知菌株的16S rDNA序列进行比对，最终确定该菌株的属属和种属。

三、结论与展望经过以上几个步骤的研究和实验，我们筛选出了一株耐盐蛋白酶高产菌，并对其进行了初步的鉴定和研究。

一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定
盐渍化是困扰全球农业持续发展的问题之一。

在高盐环境下，微生物为了适应环境，
往往会产生一些耐盐酶，这些酶具有广泛的应用前景，目前对这类酶的研究越来越受到关注。

本研究通过对芽孢杆菌菌株进行耐盐蛋白酶的筛选及鉴定，旨在找到一株高产耐盐蛋
白酶的菌株，为该类酶的产业化应用提供基础资料。

研究中使用了来自不同环境中的细菌菌株作为研究对象，经过耐盐筛选和试验验证，
筛选出一株产酶菌株。

该菌株的形态特征和生化特性表明，它属于芽孢杆菌属。

为了进一步了解筛选出的菌株的耐盐蛋白酶的生化特性，对该菌株产酶条件的影响进
行了初步研究。

结果表明，最佳的产酶条件为温度37℃，pH值为8.0，盐度为12%。

在此
条件下，该菌株耐盐蛋白酶的相对酶活达到了最高值。

此外，研究还分别分析了该菌株产酶过程中酶活力与时间、碳源和氮源等因素的关系，并对其酶解产物进行了初步的质谱分析。

结果表明，该菌株的耐盐蛋白酶主要是以胶原蛋
白为底物，可将胶原蛋白降解成小分子多肽和氨基酸。