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灯盏细辛等8种中药对人醛糖还原酶的抑制作用目的：观察灯盏细辛等8种中药对人醛糖还原酶(aldose reductase，AR)活性的影响。
方法：在体外模型下用酶法对8种中药的AR活性抑制率进行了测定。
结果：8种中药对人AR均有不同程度的抑制作用，其中灯盏细辛有较强的活性，强于阳性对照药槲皮素。
结论：从中药中寻找高效低毒的醛糖还原酶抑制剂具有很大优势。
标签：醛糖还原酶；抑制作用；灯盏细辛高血糖引发的糖尿病(中医称为“消渴病”)慢性并发症(DCC)诸如神经、肾脏、视网膜病变和白内障等，极大地增加了心脏病、中风、失明、截肢和。
肾衰竭的危险性。
现代医学研究证明DCC与多元醇通路相关，醛糖还原酶(aldosereduc－tase，AR)作为多元醇通路的限速酶，就成了延缓和防治DCC的关键因素，寻找有效、低毒的醛糖还原酶抑制剂对防治糖尿病并发症具有重要意义，为此笔者研究观察了灯盏细辛等8种常用于治疗消渴病中药对人AR的抑制作用。
结果表明，这8种中药对人AR均有不同程度的抑制作用。
1材料与方法1.1仪器与试剂UV－1600 SHIMADZU紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，NADPH，DL－甘油醛，槲皮素，人AR(日本大阪和光药业公司)，其余试剂均为日本产分析纯。
中药购自云南省药材公司。
1.2提取各种中药材10g，70％(体积百分数)乙醇100mL回流提取4h，2次，真空干燥后用DMSO配成3.3mg／mL的样品溶液。
1.3实验方法酶活性测定，反应液包括pH6.2的0.2mol／L磷酸盐缓冲液700μL，1.5mmol／LNADPH 100μL，100mmol／L的DL－甘油醛100μL，3×102-unit／mL的人AR100μL。
25℃混匀20s后反应180s，340nm处吸光值(AAbs)的下降值表示人AR活性，各个样品测定2次取平均值。
中药对人AR的抑制率是指在上述反应体系中加入3μL样品后酶活性的降低程度。
第３４卷，第２期 光谱学与光谱分析Ｖｏｌ畅３４，Ｎｏ畅２，ｐｐ４５５‐４５９２０１４年２月 ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄＳｐｅｃｔｒａｌＡｎａｌｙｓｉｓＦｅｂｒｕａｒｙ，２０１４ 荧光光谱法测定生物炭／秸秆输入土壤后酶活性的变化张玉兰１，陈利军１倡，段争虎２，武志杰１，孙彩霞３，王俊宇１１畅中国科学院沈阳应用生态研究所森林与土壤生态国家重点实验室，辽宁沈阳 １１００１６２畅中国科学院寒区旱区工程与环境研究所，甘肃兰州 ７３０００９３畅东北大学理学院，辽宁沈阳 １１０００４摘 要 土壤α‐葡萄糖苷酶、β‐葡萄糖苷酶直接参与土壤有机物质的矿化过程，对维持生态系统碳和养分的循环起重要作用。
秸秆或者秸秆炭化物还田是提高碳储量的一种有效措施，输入到土壤后对生物学活性产生一定影响，对碳库转化具有直接或者间接作用。
采用荧光物质作为底物，将９６微孔板和荧光检测法结合，利用多功能酶标仪测定生物炭／秸秆（２畅５ｇ／５０ｇ干土）添加条件下黑土中α（β）葡萄糖苷酶活性。
结果表明，秸秆添加到土壤后，土壤α（β）葡萄糖苷酶活性增强，水稻秸秆处理β‐葡萄糖苷酶活性高于玉米秸秆处理，４０天后仍然保持较强活性，说明秸秆的输入有助于土壤碳素转化。
可能是因为秸秆炭添加提高土壤中养分含量，促进微生物活性，使得土壤酶活性提高，水稻秸秆添加增强土壤酶活性，而玉米秸秆没有促进作用，可能与材料来源不同有关，材料来源与添加效应的关系有待进一步研究。
而生物炭添加对黑土中α（β）葡萄糖苷酶活性影响不大，这与生物炭含速效养分少、自身难降解特性有关。
与传统的分光光度法相比，微孔板荧光法可以灵敏的检测到土壤悬液中的酶活性，可批量检测样品，是一种快速、准确、简便的土壤酶活性测定方法。
关键词 荧光方法；土壤酶活性；生物炭添加；秸秆添加中图分类号：Ｓ１５３畅６ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０畅３９６４／ｊ畅ｉｓｓｎ畅１０００‐０５９３（２０１４）０２‐０４５５‐０５ 收稿日期：２０１３‐０４‐０７，修订日期：２０１３‐０７‐１５ 基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费项目（２０１３０３０９５‐９），国家“十二五”科技支撑项目（２０１２ＢＡＤ１４Ｂ０４，２０１１ＢＡＣ０７Ｂ０４）资助 作者简介：张玉兰，女，１９７４年生，中国科学院沈阳应用生态研究所副研究员 ｅ‐ｍａｉｌ：ｙｌｚｈａｎｇ＠ｉａｅ畅ａｃ畅ｃｎ倡通讯联系人 ｅ‐ｍａｉｌ：ｌｊｃｈｅｎｃｈｉｎａ＠ｈｏｔｍａｉｌ畅ｃｏｍ引 言 土壤α（β）‐葡萄糖苷酶直接参与土壤有机物质的矿化过程，对维持生态系统碳和养分的循环起重要作用。
醛糖还原酶抑制剂的作用原理和应用 盛凯丽（浙江工业大学药学院生物制药1001班 201018360314） 摘要：糖尿病慢性并发症的发生和恶化与糖代谢多元醇通路异常有关，醛糖还原酶是此多元醇通路中的关键限速酶。
多元醇通路中的关键限速酶。
因此，因此，醛糖还原酶抑制剂成为公认的预防、醛糖还原酶抑制剂成为公认的预防、改善和治疗糖尿病改善和治疗糖尿病并发症的有效对策。
并发症的有效对策。
一．醛糖还原酶抑制剂及其作用：它是抑制醛糖还原酶（EC1,1,1,21）活性的化合物。
（醛糖还原酶是哺乳动物体内催化葡萄糖向山梨醇的转化的一种酶，这个过程是糖尿病并发症如白内障和神经疾病的主要起因。
因。
）醛糖还原酶抑制剂可有效抑制糖尿病病人许多器官中山梨醇含量的异常升高，因此这类抑制剂，如Thiazocin A 和B 等可作为糖尿病并发症的防治药。
等可作为糖尿病并发症的防治药。
二．醛糖还原酶(ALR2)与糖尿病并发症葡萄糖代谢的葡萄糖代谢的PP 由ALR2与山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)共同调控共同调控,,此通路不依赖胰岛素。
其中ALR2以还原型辅酶Ⅱ(NADPH)为辅酶为辅酶,,是 PP 的关键限速酶的关键限速酶,,可催化葡萄糖还原为山梨醇萄糖还原为山梨醇,,山梨醇再在山梨醇再在 SDH 的作用下的作用下,,以氧化型辅酶Ⅰ(NAD +)为辅酶为辅酶,,进一步氧化为果糖。
在正常情况下为果糖。
在正常情况下,, ALR2与葡萄糖的亲和力较低与葡萄糖的亲和力较低 (Km >100mmol/L), ALR2并不被激活，葡萄糖转化为山梨醇很少；而在糖尿病所致的高血糖状态下活，葡萄糖转化为山梨醇很少；而在糖尿病所致的高血糖状态下, , , 催化葡萄糖转化为催化葡萄糖转化为6-6-磷磷酸葡萄糖的己糖激酶饱和，细胞内高浓度的葡萄糖通过化学修饰ALR2和诱导ALR2 mRNA 的表达的表达,,使ALR2激活激活,,导致山梨醇大量产生导致山梨醇大量产生;;山梨醇的增多使得果糖也随之增多山梨醇的增多使得果糖也随之增多,,果糖的聚集继而抑制集继而抑制 SDH 的活性的活性,,使山梨醇分解减少。
研究报告Research Report醛还原酶的原核表达、纯化及活性测定周小芬1王华倩1*王真史1林卫萍1杜志云1**张焜1,2**1广东工业大学轻工化工学院,广州,510006;2五邑大学,江门,529020*同等贡献作者**通讯作者,zh iy u nd u@gdu ;kzhang@gdu 摘要醛还原酶(aldehyde reductase AKR1A1,EC1.1.1.2)是醛酮还原酶家族成员，能将有毒醛还原成相应的醇。
构建含有组氨酸标签、肠激酶切位点与AKR1A1基因的原核重组表达载体pET-22b-(His)6-DDDDK-AKR1A1。
将该质粒转化至Rosetta 宿主菌中，通过对表达条件的优化，确定表达条件为0.25mmol/L IPTG 、16℃、80r/min 诱导14h ，重组蛋白以可溶形式表达。
采用亲和纯化得到纯度为90%的pelB-(His)6-DDDDK-AKR1A1融合蛋白。
重组蛋白用肠激酶特异性剪切，经过Ni-NTA 、Sephadex G-75再次纯化，得到纯度为98%的野生型AKR1A1蛋白。
使用Western blotting 和蛋白质序列分析对蛋白质进行鉴定。
利用体外酶动学方法测定(His)6-DDDDK-AKR1A1的比活力为(41.3依0.1)U/mg 、AKR1A1比活力为(79.4依0.15)U/mg 。
使用该蛋白建立醛还原酶抑制剂筛选方法，对已上市的13种非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)的抑制活性进行测定。
结果表明奥沙普秦、酮基布洛芬、托芬那酸、氟灭酸等对AKR1A1有很高抑制作用。
本研究表达纯化了高比活力的野生型醛还原酶，并应用该酶研究已上市的非甾体抗炎药对AKR1A1的抑制活性，所获得结果为非甾体抗炎药的副作用提供了参考。
关键词醛还原酶,原核表达,非甾体抗炎药Prokaryotic Expression,Purification and Activity Determination of Aldehyde ReductaseZhou Xiaofen 1Wang Huaqian 1*Wang Zhenshi 1Lin Weiping 1Du Zhiy un 1**Zhang Kun 1,2**1Faculty of L ig ht Industry and Chemical E ngineering,Guangdong University of Technology,Guangzhou,510006;2Wuyi University,Jiangmen ,529020*The authors con trib u ted equally to th is work**Correspondin g authors,zhiyundu@;kzh ang@ DOI:10.13417/j.g ab.034.000628Abstr act Aldehyde reductase (AKR1A1),a member of the aldo-keto reductase superfamily,plays a principle role in the reductive detoxification of aldehydes.Aldehyde reductase gene,His-tagged gene and enterokinase cleavage site were adjusted according to Escherichia coli codon bias without changing their amino acids.The synthetic gene was inserted into the pET-22b (+)expression vector through the Nco 玉and Xho 玉site.And the recombination expression plasmid was named pET-22b-(His)6-DDDDK-AKR1A1.The plasmid was transferred into Escherichia coli Rosetta strains.After induced with 0.25mmol/L IPTG at 16℃for 14h,41.74%fusion protein was gained mainly in soluble form.The cell lysate was loaded to Ni-NTA affinity chromatography and pelB-(His)6-DDDDK-AKR1A1fusion protein was purified to 90%purity .After using the specific of Enterokinase specific to shear the protein,Ni-NTA and Sephadex G-75were used to purified the proteins again,getting the wild type AKR1A1protein with 98%purity.The western blotting analysis and protein sequence analysis were used for identification of the fusion protein.The (His)6-DDDDK-AKR1A1activity was determined as (41.3依0.1)U/mg and AKR1A1activity was determined as (79.4依0.15)U/mg using in vitro enzyme dynamic method.The inhibitory activities of thirteen kinds of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs)were determined using the AKR1A1protein.The results showed基金项目：本研究由国家自然科学基金(3)和广东省自然科学基金博士启动项目(S )共同资助基因组学与应用生物学，2015年，第34卷，第3期，第628-634页Genomics and Applied Biology,2015,Vol.34,No.3,628-63421272042012040007488that the oxaprozin,ketoprofen,tolfenamic acid,flufenamic acid etc.had good inhibitory effects on AKR1A1.K eywor dsAldehyde reductase,Prokaryotic soluble expression,Non-steroidal anti-inflammatory drugs醛酮还原酶(AKR)是一个超家族，目前可分成15个家族(AKR1~AKR15)，约有150个家族成员。
效应面法优化蒙花苷水解工艺及其水解物的醛糖还原酶抑制活性研究目的：用效应面法对蒙花苷的水解工艺进行优化，通过醛糖还原酶模型研究其水解物金合欢素醛糖还原酶的抑制活性。
方法：建立水解物金合欢素体外生物酶模型，通过测定NADPH的荧光吸收，计算水解物金合欢素对醛糖还原酶的抑制率，从而得到水解物的醛糖还原酶抑制活性的IC50的平均值。
在蒙花苷水解工艺中采用效应面法优化水解工艺，并对结果进行预测分析。
结果：水解物金合欢素醛糖还原酶抑制活性，其IC50的平均值为2.74 mg·L-1。
优选的水解工艺为水解时间7.4 h，硫酸甲醇0.54 mol·L-1，固液比3∶1。
结论：水解物金合欢素具有比蒙花苷较好的醛糖还原酶抑制活性。
优选的蒙花苷水解工艺简便，预测性良好。
标签：蒙花苷；效应面分析法；金合欢素；醛糖还原酶抑制剂蒙花苷为菊科植物野菊花Chrysanthemum indicum L.的主要天然黄酮类成分[3]。
近年来国内外研究表明，蒙花苷对大鼠晶状体的醛糖还原酶（AR）有抑制活性[4]。
本实验室前期研究表明，蒙花苷属于低溶解度，透过性较差的药物[5]。
药物比表面积和脂溶性对药物体内吸收有重要的促进作用，因此通过去糖基化增加蒙花苷的比表面积和脂溶性，对蒙花苷进行结构修饰。
效应面法具有试验次数少，精确度高，应用方便的特点，该设计方法可以很好地应用于药学领域[6]。
本研究以蒙花苷水解率为指标，运用效应面法进行蒙花苷水解工艺优化。
选用经典的非细胞模型[7-9]，评价醛糖还原酶在水解物金合欢素干预下的变化。
1 材料Lab Alliance高效液相色谱仪（SeriesⅡ一元泵系统，Lab Alliance色谱工作站）；AB204-N电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；HS-3120超声波清洗器（奥特赛恩斯机器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪高科仪器厂）。
蒙花苷对照品（实验室自制，经HPLC归一法检测纯度>97%），金合欢素（中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱醇，天津市康科德科技有限公司）；冰醋酸（色谱醇，天津市康科德科技有限公司）；其他试剂均为分析醇。
收稿日期:2007205214 修回日期:2007207204基金项目:中南民族大学科学基金(YZZ05018)3通讯联系人:柳畅先,女,教授,研究方向为生化分析.第24卷第2期Vol.24 No.2分析科学学报J OU RNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE 2008年4月Apr.2008文章编号:100626144(2008)022*******酶催化动力学荧光法测定乙醇覃建军,柳畅先3,察冬梅(中南民族大学化学与材料科学学院,国家民委分析化学重点实验室,武汉430074)摘 要:利用醇脱氢酶(ADH )催化乙醇与氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD )反应的原理,通过测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH )荧光强度的变化率得出其酶促反应速度,对应乙醇浓度而制得标准曲线,试样中乙醇含量由标准曲线求得,检出限为4.0×10-6mol/L 。
考察了试剂用量、p H 、共存组分对测定的影响。
该方法简便、快速、准确。
关键词:乙醇;酶法测定;醇脱氢酶;动力学荧光法中图分类号:O657.39 文献标识码:A乙醇的分析测定在医疗和食品工业中具有重要意义,其含量的测定方法有气相色谱法、密度瓶法、碘量滴定法等。
近年来酶法在分析测定方面得到广泛应用[1-5]。
作者已报道过用酶法测定乙醇[6]。
本文采用酶反应荧光体系使得测定更灵敏,检出限更低。
方法基于(AD H )催化下列反应:乙醇+NAD NAD H +乙醛NAD 为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,无荧光,而NAD H 是一种强荧光物质,通过测定NAD H 荧光强度的变化率得出其酶促反应速度,对应不同乙醇浓度制得标准曲线,从而可测定试样中的乙醇含量。
由于酶促反应的专一性,可避免试样中众多共存组分的干扰,减少繁杂的预处理过程。
1 实验部分1.1 仪器与试剂L S55型荧光分光光度计(美国,Perkin 2Elmer 公司);p HS 23C 型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。
生理实验方法总结酶提取液制备称取干净叶片0.5g于预冷研钵中，加2ml的提取介质﹙PH7.8的50 mmol·L-1磷酸缓冲液﹚，充分研磨后，加提取介质冲洗钵体，并使最终体积为5ml，6000rpm离心30min，上清液即为提取液。
供SOD、CAT、POD、MDA和蛋白质含量测定。
1、叶片相对含水量：先求叶片鲜重Wf，然后将叶片浸入蒸馏水中数小时（要48h左右叶片质量才不会增加），使叶片吸水成饱和状态。
取出用吸水纸吸取表面的水分，立即放入已知重量的称瓶中称重，再放入蒸馏水中一段时间后取出吸干外面水分，再称重，直至重量不再增加为止。
此时即为叶片吸水饱和时的重量Wt，再将样品烘干，求得组织干重Wd，即得相对含水量=（Wf-Wd）/（Wt-Wd）×100%注：Wf——叶片鲜重（g）；Wd——叶片干重（g）；Wt——叶片饱水重（g）。
2、比叶重：单位面积的叶片的干重，避开主脉。
3、相对电导率：取大小相当的植物叶片(尽量保证叶片的完整性,少含茎节),用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次,用滤纸吸干表面水分,将叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉),快速称取鲜样3份,每份0.1g,分别置于10ml去离子水的刻度试管中,盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理12h.用电导仪测定浸提液电导(R1),然后沸水浴加热30min,冷却至室温后摇匀,再次测定浸提液电导(R2).相对电导率=R1/R2!100% 4、叶绿素含量：将采回的样叶快速洗净擦干，去中脉，称取0.1g，加10ml95%的乙醇，在黑暗中泡45h（直到叶片发白）。
于721分光光度计测定在波长D470nm、645nm 和663nm下的光密度（OD值），按照Arnon公式，计算出每克叶片的叶绿素a,b和叶绿素总的含量：叶绿素a(mg/g鲜重)=（12.7D663-2.69D645）*[V/（1000*W）]叶绿素b(mg/g鲜重)=（22.9D645-4.63D663）*[V/（1000*W）]叶绿素总含量(mg/g鲜重)=（20.2D645+8.2D663）*[V/（1000*W）]类胡萝卜素含量(mg/g鲜重)=(1000D470－2.05Ca－114.8Cb)/245式中：D---光密度读数V---叶绿素提取液总体积（10ml）W---所用叶片鲜重（g）5、MDA含量的测定：用硫代巴比妥酸法：取干净试管，加入酶提取液1mL，然后再加入3ml10%的TCA和1ml 0.6%的TBA，摇匀，混合液在95℃水浴中保温30min，迅速冷却后，4000rpm下离心10min，取上清液分别于600nm，532nm，450nm波长下测定吸光度值。
荧光法测定醛糖还原酶活性的优化作者：王俊杰方会龙段小毛肖和平谷娟李玲欧阳冬生【摘要】目的找出优化NADP生成荧光法测定红细胞醛糖还原酶 (AR) 活性的方案。
方法通过研究血红蛋白浓度、激发荧光水浴时间以及NADP溶液贮存时间对荧光强度的影响，优化红细胞AR活性测定的NADP生成法；以此方法测定正常及糖尿病大鼠AR活性。
结果 NADP生成法的精确度受血红蛋白影响，在终止反应后的NADP溶液中加入250 μl 6％高氯酸沉淀血红蛋白可消除此影响；水浴激发荧光时间5、30、60 min，荧光值变异系数无差异；在激发荧光前将反应体系生成的NADP溶液贮存于-20℃的条件下至少可以稳定保存4 w。
糖尿病大鼠AR活性明显高于正常对照组(P<0.05)。
结论优化的NADP生成法可以更准确测定红细胞AR活性。
【关键词】糖尿病；醛糖还原酶；荧光；活性【Abstract】Objective To optimize the the NADP generating fluorimetric method for aldose reductase (AR) activity. Methods The effect of haemoglobin，the time of aqueous bath arousing fluorescence and storage time of NADP solution on the fluorescent value was observed. It was optimized that the NADP generating fluorimetry assayed erythrocytes AR activity. AR activity of normal and diabetic mellitus rat were examined.Results The accuracy of this assay was influenced by hemoglobin concentration which could be eliminated by adding 250 μl 6﹪ perchloric acid to precipitate hemoglobin as the reaction was terminated. It had no difference for the variation coefficient of fluorescence value when the time that the fluorescence was provocated through waterbath was 5,30,60 min. NADP solution could be stored in the condition of -20℃ fo r 4 weeks at least. AR activity was higher in diabetic rats than that of normal rats(P＜0.05). Conclusions Optimized NADP generating fluorimetry can measure activity of erythrocyte AR accurately.【Key words】Diabetes; Aldose reductase; Fluorescence；Activity醛糖还原酶(Aldose Reductase，AR)是葡萄糖代谢多元醇通路的限速酶，高血糖可激活AR，使葡萄糖经多元醇通路的代谢增强，造成山梨醇在细胞内的蓄积和还原剂如还原型辅酶Ⅱ (NADPH) 的缺失，导致细胞膜的结构和功能受损而干扰细胞的正常代谢。
动物和临床实验均提示，高血糖激活AR是糖尿病并发症的主要发病机制之一〔1〕。
最新研究发现AR还在心肌缺血〔2〕及内毒素引起的休克反应〔3〕中发挥着重要作用。
因此，测定红细胞AR活性，对研究AR 与相关疾病发病机制的关系具有重要意义。
目前测定AR活性有荧光法和比色法。
红细胞AR活性测定多采用荧光法〔4〕，其原理为NADP与强碱作用产生荧光信号，其强度与NADP的浓度成正比，咪唑可保护荧光的稳定性，当定量且过量的NADPH存在时，以DL甘油醛为底物，可通过测定NADP的生成或NADPH 的减少来反映AR活性。
新近有研究显示NADP生成法灵敏度和重复性更好〔5〕，为此，我们对该方法进行了优化。
1 材料与方法1.1 动物及分组雄性10周龄SD大鼠20只，由中南大学动物实验中心提供，随机分成2组：对照组和糖尿病组。
1.2 方法1.2.1 试剂和仪器NADPH(纯度>98％，ROTH公司)，NADP(纯度>90％，ROTH公司)，DL甘油醛(Wako公司)，链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，其他试剂均为国产分析纯。
荧光分光光度计(日本产岛津RF5000)，京都血糖仪(日本第一科学株式会社)。
1.2.2 大鼠糖尿病模型的复制大鼠适应性喂养3 d，禁食12 h，糖尿病组按5.5 ml/kg体重单次腹腔注射STZ溶液 (STZ用0.1 mol/L pH4.2的柠檬酸缓冲液配成10 mg/ml的溶液)，3 d后尾静脉采血随机测血糖≥13.5 mmol/L者为糖尿病大鼠，对照组注射等量柠檬酸缓冲液。
饲养期间所有大鼠自由饮水进食。
4 w后眼眶采血，血糖仪测定血糖。
1.2.3 制备裂解红细胞4 w后，眼眶采血，取肝素抗凝血1 ml，3 000 r/min×10 min分离红细胞，然后加4倍体积4℃预冷的生理盐水，3 000 r/min×10 min×3 次离心洗涤红细胞，按照50 μl/支分装 (一支实验管，其余备用)，-20℃冻存。
取冻存红细胞加200 μl 10 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，振荡溶解10 min，3 000 r/min×10 min，去沉淀。
1.2.4 AR活性测定反应体系每份样品一式三份，冰上操作，反应体系（终浓度）：135 mmol/L PBS，100 mmol/L硫酸铵，0.04 mmol/L DL甘油醛，150 μmol/L NADPH，5 μl 红细胞溶血液，总体积200 μl。
实验管加上述所有试剂，空白管以去离子水代替NADPH。
加入DL甘油醛后立即37℃水浴反应。
1.2.5 终止反应5 min后，将样本同时放入冰浴中，加入600 μl 0.5 mol/L HCl后60℃水浴15 min来终止反应并破坏反应剩余的NADPH。
冰浴冷却后加入250 μl 6％高氯酸3 000 r/min×10 min离心沉淀血红蛋白，吸取上清1 ml，-20℃冻存。
1.2.6 荧光值测定加入2 ml 6 mol/L NaOH (内含10 mmol/L咪唑) 37℃水浴5 min激发NADP产生荧光，Ex360 nm/Em460 nm测定荧光强度。
1.2.7 血红蛋白含量测定〔6〕用高铁氰化血红蛋白法。
实验管加稀释液3 ml，红细胞溶血液12 μl，空白管以去离子水代替红细胞溶血液，混匀，静置5 min，以空白管调零测实验管在540 nm的吸光度值，计算血红蛋白含量Hb(g/L)＝OD540×367.7。
每份样品平行做三份取均值。
1.2.8 绘制标准曲线并计算AR活性反应体系与条件同上，去离子水代替红细胞溶血液，NADP(0～1 000μmol/L) 代替NADPH，以NADP浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标做标准曲线，求回归方程。
由方程求得NADP生成量，以每分钟产生1 μmol NADP为1个酶活性单位(U)，计算AR活性。
1.2.9 血红蛋白对AR活性测量值的影响①按照以上实验方法分别测定在加入2.5、4、5、6、10 μl同一红细胞溶血液的情况下激发的荧光强度；②在终止反应后的NADP溶液中未加入250 μl 6％高氯酸沉淀血红蛋白，然后测定激发的荧光强度。
1.2.10 样本的保存周期以同一溶血液为标本，测定反应体系生成的NADP溶液在-20℃冻存0、4、24 h，1、2、4 w后的NADP激发的荧光强度。
1.2.11 同一红细胞溶血液激发荧光的水浴反应时间对荧光强度的影响①37℃水浴5 min后测量NADP产生的荧光值；②37℃水浴30 min后测量NADP产生的荧光值；③37℃水浴60 min后测量NADP产生的荧光值。
1.3 统计学分析实验结果用x±s表示，两样本均数比较用t检验，多样本均数比较(成组设计)用单因素方差分析。
统计分析采用SPSS12.0统计软件包。
2 结果2.1 标准曲线与回归方程NADP标准曲线的回归方程：荧光强度=2.828+1.419×NADP浓度，则NADP浓度=(荧光强度-2.828)/1.419。
2.2 血红蛋白对AR活性测量值的影响在未去除血红蛋白的条件下，红细胞溶血液在2.5～10 μl的范围，荧光强度随红细胞血红蛋白量的增加而降低；在终止反应后的NADP溶液中加入250 μl 6％高氯酸沉淀血红蛋白，荧光强度随红细胞溶血液的含量升高而升高，提示红细胞对荧光测量值有较大干扰。
红细胞溶血液2.5、4、5、6、10 μl各组未去除血红蛋白测定的荧光值均低于去除血红蛋白测定的荧光值(P<0.05)，见表1。
表1 红细胞溶血液在去除和未去除血红蛋白条件下激发的荧光强度(略)2.3 样本的保存周期-20℃冻存4、24 h，1、2、4 w后的NADP溶液测定的荧光强度分别是：45.2±1.7，44.2±1.3，45.4±1.9，44.1±2.1，44.4±2.3与对照组(44.9±1.2)比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.4 激发荧光的水浴反应时间对荧光强度的影响生成的NADP溶液加入含咪唑的NaOH后，在37℃水浴分别放置5、30、60 min激发荧光值，各组间总体均数差异均有统计学意义(P<0.05)，各组间变异系数的差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。
表2 激发荧光的不同水浴时间测量的荧光强度(略)2.5 各组大鼠血糖和红细胞AR活性比较糖尿病大鼠造模4 w后血糖为(22.72±3.42) mmol/L与对照组血糖(6.25±1.04) mmol/L比较显著升高（P<0.05）。
糖尿病大鼠AR活性(5.64±2.28) U/mg较对照组(1.45±0.98) U/mg显著升高（P<0.05）。
