两步酶法生产 7-ACA 项目

酶法合成7—ACA及头孢菌素类抗生素的研究进展作者：王俏来源：《中国科技博览》2015年第04期[摘要]在当前的抗生素药物市场中，头孢是一类较为常见的药物，应用范围也十分广泛。

为了能够提高头孢菌素类抗生素生产效益，人们也在不断的研发新的生产工艺。

最初的头孢类抗生素制备工艺主要是化学合成法，近些年，酶法合成工艺的应用也越来越广泛，已经逐渐成为主流的制备工艺。

现本文通过详细分析酶法合成7-ACA的工艺方法，来探究酶法合成工艺在不同头孢菌素类抗生素制备中的应用。

[关键词]酶法；7-ACA；头孢菌素类；抗生素；制备工艺中图分类号：P314 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）04-0348-01与传统的化学合成方法相比，采用酶法合成头孢类抗生素药物更为高效环保。

这是因为在酶法制备的过程中，无需使用有毒试剂，也减少了各种有毒废液的排放，并且其工艺操作更加简单，能够极大的提高生产效率。

事实上，酶法自从上世纪70年代起就已经开始被应用在抗生素药物制备中，但最初并未得到大规模的推广应用。

近些年，酶法合成工艺逐渐备受人们的重视，并逐渐开始进行大规模工业生产，成为未来头孢类抗生素工业生产的主要工艺方法。

而7-ACA作为头孢类抗生素的母核，在其生产合成过程中发挥了非常重要的作用，具有典型的代表意义，因此本文决定通过探析酶法合成7-ACA的工艺，来探讨其在头孢类抗生素生产中的研究进展。

1、酶法合成7-ACA的工艺分析7-ACA，即7-氨基头孢烷酸，是头孢菌素类抗生素的关键中间体，在其合成工艺中占有关键地位。

其合成工艺主要有化学合成法与酶法合成法两种。

其中前者的工业应用较为成熟，但是其合成的周期过长，反应步骤较多，且会产生污染环境的三废，而后者则不会出现这些问题，酶法合成不但周期短，反应温和，更重要是其不会产生污染物，在当前各行业都在提倡环保节能的社会发展形势下，酶法合成无疑更符合持续发展的要求。

目前酶法合成头孢菌素类抗生素可以采用两步酶法制备工艺，也可以采用一步酶法制备工艺。

7—ACA细菌内毒素检查方法探析作者：杨帅来源：《东方食疗与保健》2016年第10期[摘要]要建立药用的中间体7-ACA细菌内毒素检查方法。

本文是按照2010年的中国药典中的附录进行的本次试验分析，根据分析判定相应的结果。

研究结果表明了供试品溶液的浓度，如果浓度是1.25mg/ml的时候，就说明对细菌内毒素的检查是没有任何的干扰的，使用药用中间体7-ACA的检查方法是可行的。

[关键词]7-ACA；细菌内毒素；检查方法药用中间体7-ACA是一种头孢类的抗生素前身，这种头孢类的抗生素是合成的，没有将细菌内的毒素进行有效的去除。

内毒素就是一种威胁着人体生命安全的一种致病的因子，只要很少的内毒素就会引起生物或者是病理作用，因此现在7-ACA细菌内毒素的检查并且进行有效的控制，已经成为了研究的重点。

本文的研究中，考虑到7-ACA的PH比较低，仅仅在3.0-5.0之间，但是细菌内毒素比较适合的PH值是在6.0-8.0之间，因此就需要进行供试品的调节，需要调节到6.0-8.0之间，之后才能够开始进行检测。

一、材料药用中间体7-ACA，这一药品的批号分别是691312017、691312018和691312019。

鲎试剂1，这一试剂是TAL1，批号是1302130，是由湛江博康海洋生物有限责任公司制造的。

鲎试剂2，TAL2，湛江安度斯生物有限公司。

细菌内毒素工作标准品（CSE，中国食品药品生物检定院，批号为150601-201176，规格为100EU/支）。

细菌内毒素检测用水和碳酸钠。

二、方法和结果（一）鲎试剂的灵敏度复核在本次试验中使用的是2010年版本的中国药典中的第二部的附录进行的7-ACA细菌内毒素检查方法的研究，在试验的过程中，要求灵敏度要在0.5-2.0λ之间，具体的试验结果如表1所示：（二）供试品中细菌内毒素限制的确定在本次产品中使用的是药用中间体，从成品的注射剂上来说，使用的是通用量，通用量是在1h内输入的药量不能够超过1.2g，在计算的过程中使用的是通用的量，也就是说M=1.2g/（60kg·h）=20mg，（kg·h）。

酶法合成7—ACA及头孢菌素类抗生素的研究进展作者：李秀娟申雪皎来源：《科学与财富》2016年第11期摘要：酶法合成7-ACA近年来不断的完善，合成的效率大大提高了，而且废气、废物以及废水的排放有效的减少了。

头孢菌素类抗生素在医药行业比较常见，这是一种常用的抗生素，在合成制备的过程中，需要保证安全性以及药效。

本文对酶法合成7-ACA及头孢菌素类抗生素的研究进展进行了分析与介绍，还介绍了几种常见的合成方法，希望对相关工作人员提供一定参考与帮助，从而促进我国医药行业更快的发展。

关键词：酶法合成；7-ACA；头孢菌素；抗生素；研究酶法合成是医药行业传统的合成方法，其最早出现在20世纪60年代末，迄今已发展了50余年，在20世纪90年代，研究出了酶缩合反应技术以及固定化酶技术，相关技术人员对配套技术也进行了完善，这位大规模药物工业生产创造了良好的条件，使得酶法合成头孢氨苄、阿莫西林有了突破性进展。

我国在酶法合成的研究上也取得了一定成绩，虽然与国外先进单位有着一定差距，但是也研究出了很多有效的大规模工业生产技术，促进了我国医药事业的发展，下面笔者对酶法合成7-ACA以及头孢菌素类抗生素进行简单介绍。

1 酶法合成7-ACA的酶法合成7-ACA是头孢菌素类抗生素生产过程中重要的母核，头孢菌素的结构如图1所示，其可以抑制肽转肽酶催化产生的转肽反应，从而保证线性高聚物无法交联形成网状结构，阻止了细胞壁的合成，会导致大量的细胞死亡。

7-ACA即7-氨基头孢烷酸，采用化学法进行工业生产时，多采用的是头孢菌素C钠盐进行生产，由于这种方法的工艺比较复杂，而且生产的成本也比较高，还会对周围环境造成污染，所以，相关工作人员会选用酶法裂解简化生产过程，在优化的过程中，有效提高了回收率，还提高了产品的质量，减少了成本以及对周围环境的影响。

1.1 酶法合成7-ACA在工业生产中，7-ACA多采用的是两步酶法制备法，头孢菌素C会在通氧的环境下与D-氨基酸氧化酶反应，发生催化反应，生成了一种具有酮基的中间体以及H2O2，由于中间体并不稳定，容易发生化学氧化从而出现脱羧，生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸，在酰化酶的作用下，还会脱去侧链，最终生成7-ACA。

一、前言头孢菌素类抗生素是一族β－内酰胺类广谱抗生素，通过干扰细菌细胞壁的合成并加速细胞壁的破坏而起到杀菌的作用，是以天然头孢菌素Ｃ作为原料，经裂解和侧链改造而得到的，具有抗菌谱广、抗菌活性高、疗效好、耐酸、耐碱、耐β－内酰胺酶、低致敏、不良反应小等特点，已经成为目前全世界最为畅销的抗感染药物之一［１］。

７－氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）是生产头孢菌素的关键性中间体，化学名称为：７－氨基－３－乙酰氧甲基－８－酮－５－硫杂－１－氮杂二环［４，２０］辛－２－烯－２－羧酸。

生产７－ＡＣＡ的方法主要有：化学合成法，一步酶法和两步酶法。

其中化学法存在着工艺复杂、成本高以及污染严重等问题，正逐渐被酶法所取代。

一步酶法是利用头孢菌素Ｃ酰化酶直接催化ＣＰＣ，脱去７－位的Ｄ－α－氨基己二酰侧链，生成７－ＡＣＡ［２］。

虽然该法步骤简单，但目前已发现的ＣＰＣ酰化酶活力都十分低，远不能满足工业催化的需要。

而两步酶法是利用两个不同来源的酶分别进行催化，首先，ＣＰＣ在Ｄ－氨基酸氧化酶（ＤＡＡＯ）的作用下，产生一个具酮基的中间体ＫＡ－７－ＡＣＡ，这个中间体较不稳定，很容易被同时产生的Ｈ２Ｏ２化学氧化脱羧，转变成戊二酰基－７－氨基头孢烷酸（ＧＬ－７－ＡＣＡ）；然后在ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶的作用下脱去其侧链，生成７－ＡＣＡ［３］［４］。

二、ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶概述１．ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶分类及性质目前文献中报道的绝大多数产ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶的微生物都是假单胞菌，李勇等人按蛋白质结构的不同对其进行了分类，同一类的酰化酶具有相似的性质，对应的基因序列有较高的同源性［５］。

第Ⅰ种酶最引人注目的特点是在很宽的ｐＨ值范围内（ｐＨ６．５－９．０）对ＧＬ－７－ＡＣＡ都有很高的水解活力；这一特点在工业生产中十分有利，因为在ＧＬ－７－ＡＣＡ水解过程中生成戊二酸，反应液的ｐＨ值变化很大。

第Ⅱ种酶最显著的特点是具有γ－谷氨酰转肽酶（ＧＧＴ）活力，其氨基酸序列与大肠杆菌和假单胞菌的ＧＧＴ具有３０％以上的同源性。

第26卷　第1期中　南　林　学　院　学　报V o l.26　N o.1　2006年2月JOU RNAL O F CEN TRAL SOU TH FOR ESTR Y UN I V ER S IT Y Feb.2006　Ξ[文章编号]1000-2502(2006)01-0044-04国产固定化GL272A CA酰化酶制备72A CA的工艺优化莫章桦,刘友全,张小飞(中南林业科技大学生命科学与技术学院,湖南长沙410004)[摘　要]　通过对国产固定化GL272A CA酰化酶和游离酶的表观米氏常数(K m)及最大反应速度(V m)的测定.结果表明:固定化GL272A CA酰化酶的K m和V m值分别为8.69mmo l・L-1和76Λmo l・g-1m in-1,均较游离酶高;在对酶促反应的关键参数底物质量浓度、转化温度、转化pH进行优化后,用固定化GL272A CA酰化酶在底物GL272A CA质量浓度30g・L-1、转化温度25℃、转化pH8.0的条件下转化GL272A CA制备72A CA可连续操作150批以上,转化率和收率均达95%以上.[关键词]　GL272A CA酰化酶;固定化酶;72A CA;酶促反应[中图分类号]　Q978 [文献标识码]　Opti m iza tion of Na tive I mm ob il ized G L-7-ACA Acyla se for7-ACAM O Zhang2hua,L I U You2quan,ZHAN G X iao2fei(Schoo l of L ife Science and T echno logy,Central South U niversity of Fo resty”T echno logy,Changsha410004,H unan,Ch ina)Abstract:T h is paper has deter m ined the K m and V m ax of native i m mobilized GL272A CA acylase and free enzym es.T he K m and V m ax ofi m mobilized GL272A CA acylase are8.69mmo l・L-1and76Λmo l・g-1m in-1respectively that are h igher than the free enzym es.T hekey param eters of enzym atic reacti on such as substrate concentrati on,temperature and pH value w ere investigated.U nder op ti m al conditi ons,native i m mobilized GL272A CA acylase fo r GL272A CA to72A CA can be used over150cycles at GL272A CA(30g・L-1, 25℃,pH8.0).T he conversi on rate and yield w ere all over95%.Key words:GL272A CA acylase;i m mobilized enzym e;72A CA;enzym atic reacti onΒ2内酰胺抗生素是广泛使用的最有效的抗菌药物,但随着这些抗菌素的使用,细菌对它们的耐药性日趋严重[1].抗生素改性——半合成青霉素(SSP)和半合成头孢菌素(SSC)的开发与生产是解决这一问题的主要途径[2].临床应用证明,半合成头孢菌素是一类抗菌谱广、抗菌活性强、疗效高、毒性低的抗生素[3],72氨基头孢烷酸(72Am inocep halo spo ran ic acid,72A CA)作为半合成头孢菌素的关键中间体,其生产工艺也成为近年来的研究热点[4].目前,72A CA的生产方法主要采用化学法,但是化学法生产72A CA须在超低温条件下进行,而且涉及到大量有毒有害的有机溶剂如三甲基氯硅烷、五氯化磷等的使用[5],因此化学法生产72A CA条件苛刻、过程复杂且污染环境,缺乏可持续发展的前景,而酶法生产条件温和、过程简单、污染小已使其有逐渐取代化学法之势.目前人们研究较多的是如图1所示的两步酶法制备72A CA,首先,D2氨基酸氧化酶(D2am ino acid ox idase, DAAO)催化氧化CPC产生酮酸中间体(ketoadi p yl72am inocephalo spo ran ic acid,keto272A CA)和双氧水,在双氧水存在下,中间体自发变成戊二酸单酰基272氨基头孢烷酸(glu taryl72am inocep halo spo ran ic acid,GL272 A CA),再由GL272A CA酰化酶(GL272A CA acylase)催化脱去侧链,生成72A CA[6].GL272A CA酰化酶是双酶法制备72A CA的第二步用酶,Sh ibuya等人在P seudom onas p u tida和P seudom onas SY27721中发现了GL272A CA酰化酶,并对该酶进行了分离纯化及酶学性质的研究[7].湖南福Ξ[收稿日期]2005207215[基金项目]2002年湖南省引导资金项目,2003年国家发改委高新技术产业化示范工程项目.[作者简介]莫章桦(1965-),男,湖南长沙人,高级工程师,博士研究生,主要从事微生物工程和酶工程研究工作.来格生物技术有限公司从国外引进了GL 272A CA 酰化酶产生菌——大肠杆菌基因工程菌并对其进行了培养和酶的分离、纯化与固定化.本文中对游离GL 272A CA 酰化酶和固定化GL 272A CA 酰化酶的表观米氏常数和最大反应速度进行了研究和比较,并对用固定化GL 272A CA 酰化酶制备72A CA 的几个关键参数(底物质量浓度、温度、pH 值等)进行优化,提供了较好的工艺线路,确保了酶的转化批次和提高了转化收率,为双酶法制备图1　两步酶法制备72A CA 的合成路线F ig .1　Enzy matic process to produce 7-ACA72A CA 全面实现产业化奠定了坚实的技术基础.1　材料与方法1.1　材料大肠杆菌基因工程菌GL 272A CA 酰化酶酶液和固定化GL 272A CA 酰化酶以及底物GL 272A CA 由湖南福来格生物技术有限公司提供;GL 272A CA 标准品和72A CA 标准品由石家庄制药集团中润有限公司提供;其余试剂均为国产市售分析纯商品.1.2　方法1.2.1　酶活力的测定精确量取一定量酶液或称取一定量固定化酶至50mL 烧杯中,加入预热到25℃的10mL 质量浓度为20g ・L -1的GL 272A CA 溶液,以500r ・m in -1的速度搅拌,并用0.1m o l LN aOH 溶液调酶-底物混合液pH 至8.0,使pH 为8.0保持3～5m in ,记录加碱量和反应时间.活力计算:单位酶量每分钟消耗1Λm o l N aOH 为一个单位;设25℃活力为W (Λm o l ・L -1m in -1或Λm o l ・g -1m in -1),则 W =(V 2-V 1)×C ×103(M in +S ÷60)×V 样G 样.式中:V 2为滴定完后滴定仪读数(mL );V 1为滴定前滴定仪读数(mL );C 为N aOH 溶液的浓度,为0.1mm o l ・mL -1;M in 为分时;S 为秒时;V 样为酶液样品体积(mL );G 样为固定化酶样品重量(g ).1.2.2　72A CA 含量测定及转化率、收率计算(1)H PL C 分析条件柱子:H ypersil BD S C 18,5u ,200×4.6;流动相:10%乙腈和pH 3.0缓冲液(V V )(3.4g 磷酸二氢钾溶于850mL 水,用85%磷酸调pH 至3.0,加100mL 乙腈,再用水加至1L );流速:1mL m in ;检测:UV 检测,254nm ;标准液:称12.5m gGL 272A CA 和72A CA ,分别加入到25mL 容量瓶中,加入20ΛL 85%磷酸,用流动相加至刻度,注射20ΛL 标准液,H PL C 测定3次,计算平均值;样品测定:取转化液0.5mL ,用流动相稀释至50mL ,注射20ΛL 进行H PL C 分析,根据标准液含量和峰面积以及样品峰面积计算样品含量;保留时间:GL 272A CA 12～13m in ,72A CA 2～3m in .(2)转化率及收率计算 转化率=转化后GL 272A CA 减少量(m o l )转化前GL 272A CA 初始量(m o l )×100%,收率=转化后72A CA 生成量(m o l )72A CA 理论生成量(m o l )×100%.1.2.3　转化反应将称量好的固定化GL 272A CA 酰化酶装入酶反应器中(酶投入量按5k Λ L 加入),加入1L 用去离子水配制好的质量浓度为20～40g L 的GL 272A CA 溶液,开启搅拌,控制温度15～35℃,滴加3m o l L 氨水,维持pH 7.0～9.0,至反应速度为初始速度的2%以下(或pH 3分钟内不再变化),停止反应,过滤.取起始样和终止样各0.5mL ,分别用流动相稀释至50mL ,进行H PL C 分析,计算转化率和收率.2　结果与分析2.1　GL 272A CA 酰化酶游离酶和固定化酶表观米氏常数及最大反应速度比较用不同质量浓度的GL 272A CA 溶液为底物,分别测定游离酶和固定化酶的酶活力(反应初速度),结果见54第1期莫章桦等:国产固定化GL 272A CA 酰化酶制备72A CA 的工艺优化表1、表2.用L inew eaver 2B u rk 双倒数法作图(见图1),分别求出表观米氏常数(K m )和最大反应速度(V m ).表1　固定化酶在不同GL 272A CA 底物质量浓度下测定的反应初速度Table 1　I n iti al reaction rate of i m m obilized enzy m e i n differen t substrate concen tration S G L 272ACA 质量浓度 (g ・L -1)20151052.51.250.625V 反应初速度 (Λmo l ・g -1m in -1)59.958.455.145.834.821.511.7根据图2回归直线方程计算(1 V =I V m +K m V m ×1 S ):固定化酶最大反应速度为76Λm o l ・g -1m in -1,表观米氏常数为8.69mm o l ・L -1;游离酶的最大反应速度为27.1Λm o l ・mL -1m in -1,表观米氏常数为4.57图2　固定化酶及游离酶表观米氏常数及最大反应速度测定F ig .2　K m and V m of i m m obilized G L -7-ACA Acylase and free enzy m e mm o l ・L -1.结果表明,游离酶固定化后表观米氏常数增大,这是固定化酶由于空间位阻和构象改变等原因所致.但并不是一般认为K m 越小越有利于反应,因为酶与底物亲和力的减少也是改善酶促反应的一个重要因素[8],因此采用固定化酶更能有效地催化反应.2.2　底物质量浓度对转化率和收率的影响将GL 272A CA 配成质量浓度为20、25、30、35、40g ・L -1的底物溶液,在pH 8.0、25℃条件下分别进行转化反应,表2　游离酶在不同GL 272A CA 底物质量浓度下测定的反应初速度 Table 2　I n iti al reaction rate of free enzy m e i ndifferen t substrate concen tration S G L 272ACA 质量浓度 (g・L -1)20151052.51.250.625V 反应初速度 (Λmo l ・g -1m in -1)24.724.023.119.716.211.37.1H PL C 分析计算转化率和收率(见图3).从图3可以看出,随着底物质量浓度的增加,转化率降低同步造成收率降低,这是由于随着反应的进行,较高质量浓度的底物将产生高浓度的产物抑制作用而不利于转化;而较低的底物质量浓度虽有利于转化,但由于会影响转化结束后的提取操作及结晶收率.因此,综合考虑底物质量浓度图3　底物浓度对转化率和收率的影响 F ig .3　Effects of substrate concen tration onconversion rate and y ield 控制在30g ・L -1左右为佳.2.3　转化温度对转化率和收率的影响在底物质量浓度30g ・L -1,pH 8.0条件下,分别控制温度为15、20、25、30、35℃进行转化反应,H PL C 分析计算转化率和收率(见图4).从图4可知,过低的转化温度会造成转化率偏低同步造成收率偏低,而且会使转化时间过长;相对较高的温度有利于转化率的提高,但温度较高同样会加速GL 272A CA 和72A CA 的降解从而使收率降低,而且较高的温度会影响酶的稳定性,不利于重复性多批次转化反应.因此综合分析,转化温度控图4　转化温度对转化率和收率的影响F ig .4　Effects of te m perature on conversion rate and y ield制25℃左右有利于酶促反应.2.4　转化pH 对转化率和收率的影响在底物质量浓度30g ・L -1,25℃条件下,分别控制转化pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0进行转化反应,H PL C 分析计算转化率和收率(见图5)从图5可以看出,过低的pH 转化率和收率均明显偏低;相对较高的pH 有利于转化率的提高,但过高的pH 加速了GL 272A CA 和72A CA的降解,特别是pH 达到了9.0时将使收率明显64中　南　林　学　院　学　报第26卷降低,而且过高的pH 将影响酶的稳定性.因此综合考虑,转化pH 控制在8.0左右较好.图5　转化pH 对转化率和收率的影响F ig .5　Effects of pH on conversion rate and y ield 2.5　多批次转化反应中酶活力衰减及转化率、收率情况在优化转化条件下(GL 272A CA 质量浓度30g ・L -1,pH 8.0,25℃),按5k Λ・L -1加入固定化GL 272A CA 酰化酶进行多批次转化反应,记录每批H PL C 分析计算每批转化率和收率(见图6).从图6可知,整个转化反应重复进行了152批,在初始转化时间为90分钟左右时,固定化酶半衰期在152批以后,每批的转化率和收率均在95%以上,保持了较高的水平.结果充分表明:固定化GL 272A CA 酰化酶在优化转化条件下制备72A CA 具有较好的稳定性和较高的收率水平.图6　多批次转化酶活力衰减及转化率、收率情况F ig .6　Operational st ability of i m m obilized G L -7-ACA acylase for 7-ACA3　结　论固定化GL 272A CA 酰化酶米氏常数为8.69mm o l ・L -1,较游离酶为高,由于使用固定化酶进行转化有利于改善酶促反应,同时具有转化率高,副产品少,能重复多次使用以及后提取简单、产品质量好等优点,因此有利于大规模生产72A CA .用固定化GL 272A CA 酰化酶转化制备72A CA 过程中,反应转化率和收率受底物浓度、pH 值、温度的影响,控制底物质量浓度30g ・L -1左右、pH 8.0左右、温度25℃左右进行转化反应,转化率和收率均保持较高水平,可达95%以上.在优化转化条件下用固定化GL 272A CA 酰化酶转化制备72A CA ,在保证收率的前提下可连续重复转化152批以上,这和德国ROCH E 公司的水平相当,由于国产固定化酶的成本远远低于进口酶,因此用国产固定化GL 272A CA 酰化酶生产72A CA 已具备较充分的产业化条件.[参　考　文　献][1]　姜学军,张雨华,曲洪琴.世界青霉素工业的现状和发展趋势[J ].中国医药情报,1999,5(2):105.[2]　吴星佳,杨　晟,王　峥,等.Β-内酰胺抗生素工业中的酶工程[J 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头孢烯酸制备方法的研究新方向摘要：通过查阅现有文献总结出d-7-aca的各种制备研究进展，系统概述新型头孢中间体去乙酰基7-氨基头孢烯酸（d-7-aca）的特点、应用及制备研究进展。

提高了头孢菌素c发酵组份的利用率，并且避免了使用有毒化学试剂，且酶法生产工艺具有条件温和、无污染、收率高、成本低等优点，更有利于产业化生产。

关键词：d-7-aca、7-aca、cpc、d-cpc、头孢菌类【中图分类号】r9research progress of preparation method of d-7-aca（shan shulian， harbin pharmaceutical group co.， ltd general pharm. factory， harbin， heilongjiang province，150086）abstract： objective： briefly describe the feature，application and preparation research progress of the new cephalosporin intermediate d-7-aca. method： to consult the related literature to summarize the several preparation research progress of d-7-aca. results： preparation ofd-7-aca by three-enzymic method can make the catalytic conversion of cpc and d-cpc into d-7-aca， can improve the availability of cpc fermentation constituent， and avoid using the poisonous chemical agents. the manufacturing process of enzymic method has many advantages， for example，the condition is mild， no pollution， the yield is high，and the cost is low， so it is more in favor of industrialization production.key words： d-7-aca、7-aca、cpc、d-cpc、cephalosporin 头孢类抗生素可破坏细菌的细胞壁，并在繁殖期杀菌，对细菌的选择作用强，而对人几乎没有毒性，具有抗菌谱广、抗菌作用强、耐青霉素酶、过敏反应较青霉素类少见等优点。

第26卷　第1期中　南　林　学　院　学　报V o l.26　N o.1　2006年2月JOU RNAL O F CEN TRAL SOU TH FOR ESTR Y UN I V ER S IT Y Feb.2006　Ξ[文章编号]1000-2502(2006)01-0044-04国产固定化GL272A CA酰化酶制备72A CA的工艺优化莫章桦,刘友全,张小飞(中南林业科技大学生命科学与技术学院,湖南长沙410004)[摘　要]　通过对国产固定化GL272A CA酰化酶和游离酶的表观米氏常数(K m)及最大反应速度(V m)的测定.结果表明:固定化GL272A CA酰化酶的K m和V m值分别为8.69mmo l・L-1和76Λmo l・g-1m in-1,均较游离酶高;在对酶促反应的关键参数底物质量浓度、转化温度、转化pH进行优化后,用固定化GL272A CA酰化酶在底物GL272A CA质量浓度30g・L-1、转化温度25℃、转化pH8.0的条件下转化GL272A CA制备72A CA可连续操作150批以上,转化率和收率均达95%以上.[关键词]　GL272A CA酰化酶;固定化酶;72A CA;酶促反应[中图分类号]　Q978 [文献标识码]　Opti m iza tion of Na tive I mm ob il ized G L-7-ACA Acyla se for7-ACAM O Zhang2hua,L I U You2quan,ZHAN G X iao2fei(Schoo l of L ife Science and T echno logy,Central South U niversity of Fo resty”T echno logy,Changsha410004,H unan,Ch ina)Abstract:T h is paper has deter m ined the K m and V m ax of native i m mobilized GL272A CA acylase and free enzym es.T he K m and V m ax ofi m mobilized GL272A CA acylase are8.69mmo l・L-1and76Λmo l・g-1m in-1respectively that are h igher than the free enzym es.T hekey param eters of enzym atic reacti on such as substrate concentrati on,temperature and pH value w ere investigated.U nder op ti m al conditi ons,native i m mobilized GL272A CA acylase fo r GL272A CA to72A CA can be used over150cycles at GL272A CA(30g・L-1, 25℃,pH8.0).T he conversi on rate and yield w ere all over95%.Key words:GL272A CA acylase;i m mobilized enzym e;72A CA;enzym atic reacti onΒ2内酰胺抗生素是广泛使用的最有效的抗菌药物,但随着这些抗菌素的使用,细菌对它们的耐药性日趋严重[1].抗生素改性——半合成青霉素(SSP)和半合成头孢菌素(SSC)的开发与生产是解决这一问题的主要途径[2].临床应用证明,半合成头孢菌素是一类抗菌谱广、抗菌活性强、疗效高、毒性低的抗生素[3],72氨基头孢烷酸(72Am inocep halo spo ran ic acid,72A CA)作为半合成头孢菌素的关键中间体,其生产工艺也成为近年来的研究热点[4].目前,72A CA的生产方法主要采用化学法,但是化学法生产72A CA须在超低温条件下进行,而且涉及到大量有毒有害的有机溶剂如三甲基氯硅烷、五氯化磷等的使用[5],因此化学法生产72A CA条件苛刻、过程复杂且污染环境,缺乏可持续发展的前景,而酶法生产条件温和、过程简单、污染小已使其有逐渐取代化学法之势.目前人们研究较多的是如图1所示的两步酶法制备72A CA,首先,D2氨基酸氧化酶(D2am ino acid ox idase, DAAO)催化氧化CPC产生酮酸中间体(ketoadi p yl72am inocephalo spo ran ic acid,keto272A CA)和双氧水,在双氧水存在下,中间体自发变成戊二酸单酰基272氨基头孢烷酸(glu taryl72am inocep halo spo ran ic acid,GL272 A CA),再由GL272A CA酰化酶(GL272A CA acylase)催化脱去侧链,生成72A CA[6].GL272A CA酰化酶是双酶法制备72A CA的第二步用酶,Sh ibuya等人在P seudom onas p u tida和P seudom onas SY27721中发现了GL272A CA酰化酶,并对该酶进行了分离纯化及酶学性质的研究[7].湖南福Ξ[收稿日期]2005207215[基金项目]2002年湖南省引导资金项目,2003年国家发改委高新技术产业化示范工程项目.[作者简介]莫章桦(1965-),男,湖南长沙人,高级工程师,博士研究生,主要从事微生物工程和酶工程研究工作.来格生物技术有限公司从国外引进了GL 272A CA 酰化酶产生菌——大肠杆菌基因工程菌并对其进行了培养和酶的分离、纯化与固定化.本文中对游离GL 272A CA 酰化酶和固定化GL 272A CA 酰化酶的表观米氏常数和最大反应速度进行了研究和比较,并对用固定化GL 272A CA 酰化酶制备72A CA 的几个关键参数(底物质量浓度、温度、pH 值等)进行优化,提供了较好的工艺线路,确保了酶的转化批次和提高了转化收率,为双酶法制备图1　两步酶法制备72A CA 的合成路线F ig .1　Enzy matic process to produce 7-ACA72A CA 全面实现产业化奠定了坚实的技术基础.1　材料与方法1.1　材料大肠杆菌基因工程菌GL 272A CA 酰化酶酶液和固定化GL 272A CA 酰化酶以及底物GL 272A CA 由湖南福来格生物技术有限公司提供;GL 272A CA 标准品和72A CA 标准品由石家庄制药集团中润有限公司提供;其余试剂均为国产市售分析纯商品.1.2　方法1.2.1　酶活力的测定精确量取一定量酶液或称取一定量固定化酶至50mL 烧杯中,加入预热到25℃的10mL 质量浓度为20g ・L -1的GL 272A CA 溶液,以500r ・m in -1的速度搅拌,并用0.1m o l LN aOH 溶液调酶-底物混合液pH 至8.0,使pH 为8.0保持3～5m in ,记录加碱量和反应时间.活力计算:单位酶量每分钟消耗1Λm o l N aOH 为一个单位;设25℃活力为W (Λm o l ・L -1m in -1或Λm o l ・g -1m in -1),则 W =(V 2-V 1)×C ×103(M in +S ÷60)×V 样G 样.式中:V 2为滴定完后滴定仪读数(mL );V 1为滴定前滴定仪读数(mL );C 为N aOH 溶液的浓度,为0.1mm o l ・mL -1;M in 为分时;S 为秒时;V 样为酶液样品体积(mL );G 样为固定化酶样品重量(g ).1.2.2　72A CA 含量测定及转化率、收率计算(1)H PL C 分析条件柱子:H ypersil BD S C 18,5u ,200×4.6;流动相:10%乙腈和pH 3.0缓冲液(V V )(3.4g 磷酸二氢钾溶于850mL 水,用85%磷酸调pH 至3.0,加100mL 乙腈,再用水加至1L );流速:1mL m in ;检测:UV 检测,254nm ;标准液:称12.5m gGL 272A CA 和72A CA ,分别加入到25mL 容量瓶中,加入20ΛL 85%磷酸,用流动相加至刻度,注射20ΛL 标准液,H PL C 测定3次,计算平均值;样品测定:取转化液0.5mL ,用流动相稀释至50mL ,注射20ΛL 进行H PL C 分析,根据标准液含量和峰面积以及样品峰面积计算样品含量;保留时间:GL 272A CA 12～13m in ,72A CA 2～3m in .(2)转化率及收率计算 转化率=转化后GL 272A CA 减少量(m o l )转化前GL 272A CA 初始量(m o l )×100%,收率=转化后72A CA 生成量(m o l )72A CA 理论生成量(m o l )×100%.1.2.3　转化反应将称量好的固定化GL 272A CA 酰化酶装入酶反应器中(酶投入量按5k Λ L 加入),加入1L 用去离子水配制好的质量浓度为20～40g L 的GL 272A CA 溶液,开启搅拌,控制温度15～35℃,滴加3m o l L 氨水,维持pH 7.0～9.0,至反应速度为初始速度的2%以下(或pH 3分钟内不再变化),停止反应,过滤.取起始样和终止样各0.5mL ,分别用流动相稀释至50mL ,进行H PL C 分析,计算转化率和收率.2　结果与分析2.1　GL 272A CA 酰化酶游离酶和固定化酶表观米氏常数及最大反应速度比较用不同质量浓度的GL 272A CA 溶液为底物,分别测定游离酶和固定化酶的酶活力(反应初速度),结果见54第1期莫章桦等:国产固定化GL 272A CA 酰化酶制备72A CA 的工艺优化表1、表2.用L inew eaver 2B u rk 双倒数法作图(见图1),分别求出表观米氏常数(K m )和最大反应速度(V m ).表1　固定化酶在不同GL 272A CA 底物质量浓度下测定的反应初速度Table 1　I n iti al reaction rate of i m m obilized enzy m e i n differen t substrate concen tration S G L 272ACA 质量浓度 (g ・L -1)20151052.51.250.625V 反应初速度 (Λmo l ・g -1m in -1)59.958.455.145.834.821.511.7根据图2回归直线方程计算(1 V =I V m +K m V m ×1 S ):固定化酶最大反应速度为76Λm o l ・g -1m in -1,表观米氏常数为8.69mm o l ・L -1;游离酶的最大反应速度为27.1Λm o l ・mL -1m in -1,表观米氏常数为4.57图2　固定化酶及游离酶表观米氏常数及最大反应速度测定F ig .2　K m and V m of i m m obilized G L -7-ACA Acylase and free enzy m e mm o l ・L -1.结果表明,游离酶固定化后表观米氏常数增大,这是固定化酶由于空间位阻和构象改变等原因所致.但并不是一般认为K m 越小越有利于反应,因为酶与底物亲和力的减少也是改善酶促反应的一个重要因素[8],因此采用固定化酶更能有效地催化反应.2.2　底物质量浓度对转化率和收率的影响将GL 272A CA 配成质量浓度为20、25、30、35、40g ・L -1的底物溶液,在pH 8.0、25℃条件下分别进行转化反应,表2　游离酶在不同GL 272A CA 底物质量浓度下测定的反应初速度 Table 2　I n iti al reaction rate of free enzy m e i ndifferen t substrate concen tration S G L 272ACA 质量浓度 (g・L -1)20151052.51.250.625V 反应初速度 (Λmo l ・g -1m in -1)24.724.023.119.716.211.37.1H PL C 分析计算转化率和收率(见图3).从图3可以看出,随着底物质量浓度的增加,转化率降低同步造成收率降低,这是由于随着反应的进行,较高质量浓度的底物将产生高浓度的产物抑制作用而不利于转化;而较低的底物质量浓度虽有利于转化,但由于会影响转化结束后的提取操作及结晶收率.因此,综合考虑底物质量浓度图3　底物浓度对转化率和收率的影响 F ig .3　Effects of substrate concen tration onconversion rate and y ield 控制在30g ・L -1左右为佳.2.3　转化温度对转化率和收率的影响在底物质量浓度30g ・L -1,pH 8.0条件下,分别控制温度为15、20、25、30、35℃进行转化反应,H PL C 分析计算转化率和收率(见图4).从图4可知,过低的转化温度会造成转化率偏低同步造成收率偏低,而且会使转化时间过长;相对较高的温度有利于转化率的提高,但温度较高同样会加速GL 272A CA 和72A CA 的降解从而使收率降低,而且较高的温度会影响酶的稳定性,不利于重复性多批次转化反应.因此综合分析,转化温度控图4　转化温度对转化率和收率的影响F ig .4　Effects of te m perature on conversion rate and y ield制25℃左右有利于酶促反应.2.4　转化pH 对转化率和收率的影响在底物质量浓度30g ・L -1,25℃条件下,分别控制转化pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0进行转化反应,H PL C 分析计算转化率和收率(见图5)从图5可以看出,过低的pH 转化率和收率均明显偏低;相对较高的pH 有利于转化率的提高,但过高的pH 加速了GL 272A CA 和72A CA的降解,特别是pH 达到了9.0时将使收率明显64中　南　林　学　院　学　报第26卷降低,而且过高的pH 将影响酶的稳定性.因此综合考虑,转化pH 控制在8.0左右较好.图5　转化pH 对转化率和收率的影响F ig .5　Effects of pH on conversion rate and y ield 2.5　多批次转化反应中酶活力衰减及转化率、收率情况在优化转化条件下(GL 272A CA 质量浓度30g ・L -1,pH 8.0,25℃),按5k Λ・L -1加入固定化GL 272A CA 酰化酶进行多批次转化反应,记录每批H PL C 分析计算每批转化率和收率(见图6).从图6可知,整个转化反应重复进行了152批,在初始转化时间为90分钟左右时,固定化酶半衰期在152批以后,每批的转化率和收率均在95%以上,保持了较高的水平.结果充分表明:固定化GL 272A CA 酰化酶在优化转化条件下制备72A CA 具有较好的稳定性和较高的收率水平.图6　多批次转化酶活力衰减及转化率、收率情况F ig .6　Operational st ability of i m m obilized G L -7-ACA acylase for 7-ACA3　结　论固定化GL 272A CA 酰化酶米氏常数为8.69mm o l ・L -1,较游离酶为高,由于使用固定化酶进行转化有利于改善酶促反应,同时具有转化率高,副产品少,能重复多次使用以及后提取简单、产品质量好等优点,因此有利于大规模生产72A CA .用固定化GL 272A CA 酰化酶转化制备72A CA 过程中,反应转化率和收率受底物浓度、pH 值、温度的影响,控制底物质量浓度30g ・L -1左右、pH 8.0左右、温度25℃左右进行转化反应,转化率和收率均保持较高水平,可达95%以上.在优化转化条件下用固定化GL 272A CA 酰化酶转化制备72A CA ,在保证收率的前提下可连续重复转化152批以上,这和德国ROCH E 公司的水平相当,由于国产固定化酶的成本远远低于进口酶,因此用国产固定化GL 272A CA 酰化酶生产72A CA 已具备较充分的产业化条件.[参　考　文　献][1]　姜学军,张雨华,曲洪琴.世界青霉素工业的现状和发展趋势[J ].中国医药情报,1999,5(2):105.[2]　吴星佳,杨　晟,王　峥,等.Β-内酰胺抗生素工业中的酶工程[J ].世界科技研究发展,2001,23(1):8.[3]　罗　晖,李　强,童亿舟,等.酶法生产7-氨基头孢烷酸的研究进展[J ].现代化工,2002,22(12):18.[4]　Chen J T ,L in S Y ,T sai H .Enzym atic and chem ical conversi ons of cephalo spo rin 2C to 72(glutarylam ido )cephalo spo ranic acid [J ].B i o techno logy,1991,19:234.[5]　D aniela M onti,Giacomo Carrea,Sergi o R iva,et al .Characterizati on of an Industrial B i ocatalyst:I mmobilized Glutaryl 272A CA A cylase [J ]B i o techno logy and B i oengineering,2000,70(2):239.[6]　陈少欣,吴文琼,刘　晨,等.三角酵母D -氨基酸氧化酶的固定化研究[J ].中国医药工业杂志,2003,34(2):69.[7]　周宏伟,魏中荻,杨蕴刘,等.GL 272A CA 酰化酶的分离纯化及性质研究[J ].微生物学报,1997,37(3):196.[8]　Shw etu S ,Bhat T K ,Gup ta M N ,et al .B i oaffinity i m mobilizati on of tannase from A spergillus niger on concanvalin A Sepharo se CL 24B [J ].B i o techno l.A pp l .B i ochem .,2002,35(3):165-169.[本文编校:谢荣秀]74第1期莫章桦等:国产固定化GL 272A CA 酰化酶制备72A CA 的工艺优化。

7-ATCA制备
1.1产品名称：ATCA
1.2分子式：C10H12N6O3S2
1.3分子量：328.40
1.4理化性质：本品为白色或类白色结晶固体。

1.5成品的质量关键参数：mp：208-212，旋光：<-37，KF<0.6%,吸光度：450nm<0.08（0.4g/10ml，10%NaHCO3）
1.6用途包装及储存：本品为合成头孢孟多无菌原料，20Kg纸板桶包装，置阴凉干燥处，储存温度低于20度。

2.原材料规格及质量标准
2.17-ACA质量标准
性状：白色或类白色结晶性粉末
干燥失重：<0.1%，60度真空3小时。

纯度：>98%
吸收度：0.04
含量：>98%
色泽：<y4
比旋度：88
水分：<0.5%.KF
2.2MSN质量标准
性状：白色晶体
熔点：124-126度
含量：>99%
水分：<0.5%
2.3AET质量标准（乙腈或其他）
性状：无色透明液体，无可见杂质
纯度：>99.5%
水分：<0.5%
2.4BFE质量标准
性状：无色或淡黄色透明液体
色级：<2号
含量：>18%(以BF3)
水分：<0.1%
2.5氨水质量标准
性状：无色透明液体，无可见杂质
含量>25%
2.6 ACTN及回收ACTN的质量标准
性状：无色澄明液体
水分：<0.5%
含量：>99%，98.5%（回收）
杂质：<1%。

7-ACA（7-氨基头孢烷酸）
7-ACA：7-氨基头孢烷酸，成品为白色结晶粉末，不溶于水及一般有机溶剂，为医药中间体，是许多半合成头孢菌素的起始原料。

7-氨基头孢烷酸是头孢菌素关键性中间体，是头孢菌素中最常用的母核，7-ACA有两个活性基团，3-位的乙酰氧基和7-位的氨基，在这两个活性基团上连接不同的侧链，就构成不同性质的头孢类抗生素。

头孢菌素C（CPC）是由头孢菌在玉米浆、淀粉、糊精、蛋氨酸、葡萄糖、豆油、CaCO3、MgSO4、(NH4)2SO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CuSO4组成的培养基中发酵得到。

7-ACA（7-氨基头孢烷酸）是通过头孢菌素C（CPC）裂解而成，按裂解方法的不同分为化学法和酶法。

化学法需要在极端条件下进行，而且使用大量有毒害的化学物品，给环境和人体带来很大的危害。

酶法分为一步法和两步法，酶法生产不含溶剂和重金属，质量高，生产占地面积小，但国内不具备酶的生产能力，依靠进口，价格较高。

大致流程：菌种发酵微滤超滤离子交换
脱色柱纳滤浓缩结晶干燥离心
酶水解7-ACA。