国内酶法GSH生产技术

gst蛋白纯化原理GST蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，其原理是利用谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione-S-transferase，GST）标签与谷胱甘肽的特异性结合来进行纯化。

GST标签可与谷胱甘肽通过二硫键共价亲和，然后通过GSH交换洗脱的原理进行蛋白纯化。

具体步骤如下：1.构建GST标签融合表达载体：将GST基因的编码序列与目标蛋白的编码序列融合，构建GST-目标蛋白融合表达载体。

这样，在细胞中表达该融合蛋白时，GST标签会紧密结合在目标蛋白的C端或N 端。

2.转染和蛋白表达：将构建好的GST-目标蛋白融合表达载体转染到合适的宿主细胞（如大肠杆菌），使其产生大量的融合蛋白。

3.细胞裂解和融合蛋白的亲和层析：收获融合蛋白的细胞，通过细胞裂解等方法破坏细胞膜，释放融合蛋白。

然后，将溶解的细胞提取物加载到含有谷胱甘肽固定在琼脂糖（或其他载体）上的亲和层析柱中。

GST标签可以特异性地与琼脂糖上的谷胱甘肽结合。

4.洗脱：通过洗脱缓冲液来去除非特异性结合的蛋白质，保留GST-目标蛋白复合物。

洗脱通常使用还原剂（如谷胱甘肽）、低pH 或其他方式进行。

5.目标蛋白的解离：将GST标签从目标蛋白上解离，得到纯化的目标蛋白。

这可以通过特定的酶切位点（如蛋白酶TEV切割位点）和相应的酶进行酶切，使GST和目标蛋白分别释放。

6.纯化分析：对纯化的目标蛋白进行分析，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等方法，确认目标蛋白的纯度和完整性。

在进行GST蛋白纯化时，对于融合表达载体的设计和构建、宿主细胞的选择、裂解条件和亲和层析条件的优化等方面都需要合理考虑，以获得高质量的纯化目标蛋白。

国内谷胱甘肽研究进展
张照明;张海涛;袁利明
【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2009(37)3
【摘要】谷胱甘肽(GSH)是一种重要的医药保健产品,在临床上用于肝脏保护、治愈肿瘤、解除氧中毒、抗衰老和治疗内分泌紊乱等疾病,效果明显无毒副作用,在医疗、保健品加工等领域有广泛的市场.介绍了国内GSH的研究和生产现状、产品用途和市场前景.
【总页数】3页(P55-57)
【作者】张照明;张海涛;袁利明
【作者单位】东营市源聚生物制品有限公司,山东,东营,257200;东营市科维生物技术有限公司,山东,东营,257091;东营市源聚生物制品有限公司,山东,东营,257200【正文语种】中文
【中图分类】TQ2
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1.国内精品酒店研究进展综述国内精品酒店研究进展综述 [J], 丁乙欣
2.谷胱甘肽的应用和酶法生产谷胱甘肽的研究进展 [J], 段学辉;谢雷波;王锦
3.谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展 [J], 马森
4.谷胱甘肽国内外研究进展 [J], 刘超;袁建国;李峰
5.专论手持技术在国内化学教学中的应用研究进展手持技术在国内化学教学中的应用研究进展 [J], 张倩;方舟;钱扬义;李玉莹
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谷胱甘肽还原酶检测说明书
谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）检测是一种用于测定谷胱甘肽还原酶活性的实验方法。

谷胱甘肽还原酶是一种关键的抗氧化酶，参与谷胱甘肽（glutathione，GSH）的再生过程，从而保护细胞免受氧化损伤。

以下是一种简化的谷胱甘肽还原酶检测说明：
1.实验原理：谷胱甘肽还原酶检测主要依赖于酶促
反应的光度测定。

在此反应中，谷胱甘肽还原酶将氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG）还原为还原型谷胱甘肽（GSH），同时将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADP+）。

反应过程中，NADPH的消耗可以通过其吸光度的变化来监测。

2.实验试剂：主要试剂包括缓冲液、还原型谷胱甘
肽、氧化型谷胱甘肽、NADPH、谷胱甘肽还原酶标准品等。

3.实验步骤：
a.样品处理：收集需要测定谷胱甘肽还原酶活
性的样品（如血清、组织或细胞提取物等），
并进行适当的处理和稀释。

b.反应体系建立：在96孔板中，分别加入缓冲
液、样品、GSSG和NADPH，然后添加谷胱
甘肽还原酶标准品。

c.光度测定：在340nm波长下，定时测定各孔
的吸光度变化，记录吸光度值。

d.计算结果：根据吸光度变化值，计算样品中
谷胱甘肽还原酶的活性。

4.注意事项：
a.在操作过程中，请遵循实验室安全规程，佩
戴必要的防护装备。

b.实验过程中，请保持试剂的纯净和稳定。

c.光度测定时，请确保仪器的准确性和稳定性。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒
微量法100T/96S
测定意义：
GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。

GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

测定原理：
GSH-Px催化有机过氧化物氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340 nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。

GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

测定原理：GSH-Px催化有机过氧化物氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340 nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。

自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调节移液器、酶标仪、96孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配置：试剂一：液体120mL×1瓶，室温保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体10μL×1支，-20℃保存。

试剂四：液体200μL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。

8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

GSH-Px测定操作：1. 酶标仪预热30 min，调节波长到340 nm。

2. 混合试剂在25℃或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min。

3. 混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一20 mL，充分震荡溶解后加入全部试剂三，混匀。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）试剂盒说明书谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择23个预期差别大的样本做猜测定。

测定意义：GSHPx是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的重要酶之一、GSHPx不但能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的损害和加添机体抗辐射等本领。

测定原理：GSHPx催化有机过氧化物氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340nm有特征汲取峰，而NADP+没有；通过测定340nm光汲取减少速率来计算GSHPx活性。

自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调整移液器、酶标仪、96孔板和蒸馏水。

试剂构成和配置：试剂一：液体120mL×1瓶，室温保管。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保管。

试剂三：液体10μL×1支，20℃保管。

试剂四：液体200μL×1瓶，4℃保管。

粗酶液提取：1.组织：依照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：5～10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。

8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌：依照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500～1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波碎裂细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.血清等液体：直接测定。

GSHPx测定操作：1.酶标仪预热30min，调整波长到340nm。

2.混合试剂在25℃或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min。

1、简介谷胱甘肽是一种三肽(L - γ- 谷氨酰- L - 半胱氨酰-甘氨酸) 化合物,它广泛分布于动物、植物、谷物和油料种子中,它在细胞中的功能之一就是抵御各种毒素和致癌剂。

有研究表明:谷胱甘肽在小肠中能被完全吸收,并且某些上皮细胞能利用外源谷胱甘肽来去毒,这说明膳食中的谷胱甘肽决定着人体中细胞受损伤的程度。

除作为抗毒剂外,谷胱甘肽还对一些巯基酶有激活作用,可作为保护酶和其他蛋白巯基的抗氧化剂,在生物氧化、氨基酸转运、保护血红蛋白等过程中起一定作用。

另外,谷胱甘肽还具有抑制衰老,预防糖尿病、消除疲劳等作用。

最近研究还发现谷胱甘肽具有抑制艾滋病毒的作用。

因此,研究谷胱甘肽对人类的健康和生活具有重要的意义。

2、谷胱甘肽在自然界的分布谷胱甘肽在自然界中分布很广,主要存在于动物组织和血中,许多植物如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类等也含有,另外酵母中谷胱甘肽的含量也较高。

2 谷胱甘肽的特性及生理功能211 谷胱甘肽的特性谷胱甘肽分子量为307. 33 ,熔点189～193 ℃(分解) ,晶体是无色透明细长柱状(板状) ,等电点(PI) 为5. 93 ,成品见光易分解,易氧化,谷胱甘肽分子中有一特殊的δ- 肽键,即由谷氨酸的δ- COOH 与半胱氨酸的α- NH2 缩合而成,这样的肽键与蛋白质分子中的一个氨基酸中α- COOH 和另一个氨基酸中α- NH2 失水缩合而成的肽键显然不同。

由于谷胱甘肽中含有一个活泼的巯基极易被氧化,2 分子还原型谷胱甘肽(简称GSH) ,脱氢以二硫键( S S ) 相连便成为氧化型的谷胱甘肽(简称GSSG) ,所以谷胱甘肽可分为氧化型和还原型两大类,在生物体中起重要功能作用的是还原型谷胱甘肽。

2.2 谷胱甘肽的生理功能谷胱甘肽的生理功能主要表现在6 个方面:(1) 维持红细胞膜的完整性。

(2) 对于需要巯基的酶有保护与恢复活性的功能。

(3) 谷胱甘肽是多种酶的辅基与辅酶。

(4) 参与氨基酸的吸收及转运。

谷胱甘肽过氧化物酶检测方法
谷胱甘肽过氧化物酶检测方法是一种用于测定生物体内谷胱甘
肽过氧化物酶（GPx）活性的方法。

本方法基于GPx的催化作用，将
过氧化氢还原成水，并在反应过程中消耗还原型谷胱甘肽（GSH），使其转变为氧化型谷胱甘肽（GSSG）。

测定反应前后GSH和GSSG的比例变化，即可计算出样品中GPx的活性。

常用的谷胱甘肽过氧化物酶检测方法包括紫外-可见分光光度法、荧光法和色谱法等。

其中，紫外-可见分光光度法是常用的定量方法，其原理是利用GPx催化剂将过氧化氢还原为水，测定反应前后NADPH 浓度的变化。

荧光法利用GSH与荧光探针的反应性，在荧光信号变化的同时测定GPx活性。

色谱法则是在高效液相色谱仪上使用GSH和GSSG标准品，通过检测样品中这两种化合物的浓度，计算出GPx活性。

总体而言，谷胱甘肽过氧化物酶检测方法是一种有效的检测生物体内GPx活性的方法，适用于疾病诊断和治疗效果评估等领域。

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谷胱甘肽1.定义谷胱甘肽〔glutathione GSH〕CAS号：70-18-8。

谷胱甘肽是一种存在于自然界中的氨基酸复合物，由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸等三种氨基酸组合而成的寡肽。

谷胱甘肽在体内以两种形态存在，即复原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽〔oxidized glutathione，简称GSSG〕。

通常人们所指的谷胱甘肽是复原型谷胱甘肽。

复原型谷胱甘肽很容易被氧化，两分子谷胱甘肽的活泼巯基氧化脱氢后以二硫键相连得到的二聚体，即是氧化型谷胱甘肽。

其中只有复原型谷胱甘肽才具有生理活性，而生物体内的氧化型谷胱甘肽需经复原后才能发挥生理功能。

2.结构和理化性质谷胱甘肽是一种白色晶体，化学名为γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，其结构如图1所示。

相对分子质量为，熔点是192～195 °C〔分解〕，等电点为。

比旋光度[α]D20为，H2O)，易溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰氨，不溶于乙醚和丙酮。

谷胱甘肽固体较为稳定，而水溶液在空气中易被氧化，谷胱甘肽在高水分活度下不易保存，只有将水分活度控制在以下才能长期稳定保存。

3.生理功能谷胱甘肽是细胞内存在最丰富的小分子硫醇类化合物，其分子中含有一个特异的γ-肽键，由谷氨酸的γ-羧基与半胱氨酸的α-氨基缩合而成，并且半胱氨酸侧链基团上连有一个活泼巯基，是谷胱甘肽许多重要生理功能的结构根底。

3.1抗氧化作用复原型谷胱甘肽结构中含有一个活泼的巯基—SH，易被氧化脱氢。

它在体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化，让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能。

同时去除自由基。

机体内新陈代谢产生的许多自由基会损伤细胞膜，毁坏免疫系统，侵袭生命大分子，促进机体衰老，并诱发肿瘤或动脉粥样硬化的产生。

由此，谷胱甘肽具有抗衰老和强化免疫系统等作用。

3.2整合解毒作用谷胱甘肽半胱氨酸上的巯基为其活性基团〔故谷胱甘肽常简写为G-SH〕，易与碘乙酸、芥子气〔一种毒气〕、铅、汞、砷等重金属盐或致癌物质等相结合，并促进其排出体外，起到中和解毒作用。

谷胱甘肽的生理功能与主要用途与应用领域！谷胱甘肽的生理功能与主要用途与应用领域！一、背景及概述由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽。

谷胱甘肽可以氧化型(GSSG)和还原型(GSH)存在，两者可互相转变。

其在组织中分布很广，多以还原型存在。

还原型谷胱甘肽对维持巯基酶的活性和红细胞膜的稳定性有重要作用。

它还能参加小肠内氨基酸的吸收和肾小管对氨基酸的重吸收作用。

而半胱氨酸残基的巯基是某些酶的必需基因；胱氨酸残基的二巯键是胰岛素、加压素、催产素和免疫球蛋白等分子中的重要结合键。

当发生某些中毒时，可使这些分子中化学基因发生改变引起它们的活性改变或丧失。

因此谷胱甘肽在生物氧化、氨基酸转运、毒物解毒、保护血红蛋白等过程中起一定作用。

谷胱甘肽广泛存在于所有生物细胞中，其中以酵母、小麦胚芽以及人和动物肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体中含量较为丰富。

正常人体GSH和GSSG的比例为100∶1，全血中GSH的正常质量浓度约为371mg·L-1，人体的肝脏和肾脏是GSH主要的合成、代谢和排泄器官。

自1888年，法国科学家DereyPailhade首先在酵母抽提物中发现谷胱甘肽以来，科学家一直在努力研究它的生理活性并逐渐现它在清除自由基，解毒，保护肝脏以及抗癌等方面的用途。

谷胱甘肽在医药领域和食品工业领域具有广泛应用，目前开发谷胱甘肽已成为研究热点。

二、生理功能谷胱甘肽结构中半胱氨酸侧链基团上连有一个活泼巯基，它是谷胱甘肽许多重要生理功能的结构基础，能保护体内重要酶蛋白巯基不被氧化、灭活，有利于酶活性的发挥。

通过巯基与体内的自由基结合，可直接使自由基还原为容易代谢的酸类物质，加速自由基的排泄，从而减轻自由基对重要脏器的损害。

此外，谷胱甘肽所含的γ谷氨酰胺键能维持分子的稳定性并参与转运氨基酸；谷胱甘肽中的甘氨酸和半胱氨酸残基还可参与胆酸的代谢。

三、用途用于药物中毒、酒精中毒、丙酮血性呕吐症(自体中毒、周期呕吐症)、重金属中毒、慢性肝病、里耳黑变病、肝斑、炎症后色素沉着、妊娠呕吐和晚期妊娠中毒，预防及治疗放射线、抗癌药物及其他原因引起的白细胞减少症，还用于放射病及放射线引起的口腔粘膜炎、过敏性疾病。