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慢病毒实验方法

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转染方法1-磷酸钙法转染HEK293T 细胞
磷酸钙法转染HEK293T 细胞
1. 试剂配制:
无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;
2XHBS: 280mM NaCl
10mM KCl
1.5 mM Na2HPO4
12 mM glucose
50 mM HEPES
Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;
2M CaCl2: 过滤灭菌,分装.
2. 实验过程:
1. 铺细胞: 选择状态良好的293T 细胞传代, 2-3x105
个细胞/35mm dish.
2. 20-24h 后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染.下面就35mm dish 为例,采用以下转染体系:
ddw: 105ul
plasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)
2M CaCl2: 16.5ul
2XHBS: 125ul
按上述顺序,往eppendorf 管中依次加入上述四种试剂.
先将前三者混匀, 最后加2XHBS.
一种方法是,加2XHBS 时要逐滴加入, 吹打至微现乳白色, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h 后换液.
另一种方法是,加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定,建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打),之后步骤同上,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.
转染方法2-Fugene转染
病毒包装1．传293T细胞，将T75用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，置于37度培养
箱10min
即可使用，铺细胞前，将明胶再次将瓶底完全覆盖一次，完全吸净，即可将细胞铺上。

传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75；若第三天转染，铺350-400万/T75。

每瓶T75加10mL 10％DMEM培养基。

1.1传293T细胞
将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL 4度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL 37度水浴中预热的10％DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。

之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul 10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。

计数板上共4大格，每大格16小格。

计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。

2．转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。

转染前无需换培养基。

3．做脂转complex：Opti MEM需在37度水浴中预热，Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。

转染每瓶T75的complex成分如下：
含cDNA的lv质粒：10ug
pVSVG：5ug
delta 8.91：7.5ug
opti MEM补足至1mL后，用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，加入56ul Fugene转染试剂，加至opti MEM液面之下，吹打3-4次。

再用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。

晃匀后，隔2-4h后再晃匀一次即可。

4．转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10％DMEM 10mL，即开始收集病毒。

5．收集24-48h病毒上清，收集后置于4度冰箱保存。

感染方法-病毒滴度测定(感染同此法)
5.1此时即可用病毒上清测病毒滴度（悬浮感染）：
①.在24孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被24孔板10min以上（同步骤1，每孔加入200ul 明胶，移液管两滴左右）。

②.消化293T细胞（步骤1.1），24孔板每孔15万细胞。

可将细胞做mix，体积扩大到15万细胞/500ul，加入1/1000 polybrene，混匀，每孔加入500ul 15万细胞即可。

③.将病毒上清4000rpm离心5min，将细胞碎片离至管底。

取5ul病毒上清至上述步骤中传入15万每孔的24孔板一孔中，摇匀；48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度。

5.2病毒滴度确定：
①. 15万293T细胞48h即可刚好长至90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度。

②. 将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于293T细胞易飘，固定及DAPI 染色整个过程请务必保持293T细胞处于液面之下。

用PBS涮3次。

加入4％ PFA室温固定30min, 24孔板每孔200ul。

③．用PBT洗2次，每次3分钟。

④．PBS将DAPI 1000倍稀释，每孔加入200ul，避光室温静置5min。

⑤．PBS洗2次，每次5分钟，即可在荧光显微镜下计数，取2-3处取平均值。

⑥．病毒滴度（IU/mL）=荧光细胞占总细胞数的百分比÷5×1.5×105×103
Protocol for Production of Lentiviral Vectors in 293T cells
Day 1 Plating (9-10am)
Plate 2-2.5x106 of 293T cells per 10cm plate
Day 2 Transfection (9-10am)
Prepare calcium-phosphate precipitate (1ml/10cm plate)
•Transfer vector - 20µg
•Packaging plasmid - 15µg (3rd generation: pMDL g/p RRE - 10µg + pRSV-Rev - 5µg) •Envelope plasmid - 6µg
Add water to 0.5ml, add 0.5ml 2xHBS and mix well. Add 50µl 2.5M CaCl2 and shake briefly, keep in RT for 20-25min, add dropwise on a plate and mix gently with a medium
Change medium (6-8hrs later); remove medium with precipitate and add 6ml/plate of fresh medium
Day 4 Collection (9-10am)
•Collect medium
•Spin 3000rpm/5min/RT
•Filter through 0.45 µm
At this point virus can be used for transduction, frozen at -70°C for future use, or concentrated Concentration
Transfer 30ml of virus to 33ml Beckman conical tubes spin at 26.000rpm/2hrs/4°C in Beckman SW28 swingle bucket rotor. After spin discard supernatant and resuspend the virus in a desired volume of serum-free medium (e.g. Cellgro or Episerf) or PBS/1% BSA, aliquot and store at
-70°C. For transduction of very delicate cells the virus can be concentrated on sucrose cushion, just put 4ml of 20% sucrose on the bottom of the tube and overlay with 26ml of viral supernatant.
Reagents:
• 2 x HBS (for 500ml)
•NaCl - 8g
•KCl - 0.38g
•Na2HPO4 - 0.1g
•Hepes - 5g
•Glucose - 1g Bring pH to 7.05 2.5M CaCl2
bi-distilled water。

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慢病毒实验技术实践操作总结

慢病毒实验技术实践操作总结

慢病毒实验技术实践操作总结表格1：推荐不同规格培养板下转染试剂的⽤量(引⽤⾃Qiagen公司技术⼿册)9号孔⾥⾯细胞的克隆数）设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（ul）。

2、定量PCR法Day1：在六孔板中按照5×104个/孔接种293FT细胞。

在加⼊病毒液之前，取两个孔的细胞进⾏计数，以确定感染时细胞的实际数⽬，记为N。

Day2：吸去剩余四个孔中的培养基，将病毒浓缩液⽤培养基稀释200倍，也就是取1ul 病毒加⼊到199ul的培养基中。

留下⼀孔不加⼊病毒稀释液作为对照，另外三个孔中分别加⼊0.5ul，5ul和50ul的稀释病毒，四孔均补充2ml新的培养基。

感染24h。

更换1ml/孔新的培基，并在培基中添加DnaseI以去除残余的质粒DNA，37℃消化15min；最后加⼊2ml 293FT 专⽤培养基，继续培养48h。

Day3：抽提DNA，定量后妥善保存或者马上开展后续实验。

条件（不同公司的要求不⼀样在此不做统⼀的标准化介绍）。

数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数⽤基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。

滴度（integration units per ml，IU ml-1）的计算公式如下：IU ml-1= (C ×N× D×1000)/V。

（C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数；N = 感染时细胞的数⽬（约为1×105）D = 病毒载体的稀释倍数；V = 加⼊的稀释病毒的体积数）。

（以上的病毒滴度定量⽅法，主要是针对收取的病毒原液经过浓缩以后进⾏定量。

）ShRNA的设计，以李洋设计的shCD133human序列为例讲述Human shCD133 Lentiviral 从序列设计到病毒包装成形1．cDNA sequence（设计原理见附件资料）773-792: GACCCAACATCATCCCTGT5’-3’ GATCT GACCCAACATCATCCCTGT TTCAAGAGA ACAGGGATGATGTTGGGTC TTTTTA5’-3’ AGCTTAAAAA GACCCAACATCATCCCTGT TCTCTTGAA ACAGGGATGATGTTGGGTC A订单发INVITROGEN公司合成，详见：Invitrogen Custom Primers certificate of analysis Fa 5⽀Rb 5⽀然后⽤⽆酶⽔配成50uM/L每⽀⼀共150ul/FA 155ul/RB各取100ul 做成mixture: Day1 95℃5min↓70℃10min↓Room temper water bath overnight↓Day2 Vortex gently↓Stored at -20℃or placed on ice for current use.2. Human shCD133操作程序Day 1psuper载体酶切，切出带有与shCD133 cDNA序列相配的酶切接头Psuper 10 ulBgl II 2 ulHind III 2 ulBuffer k 5 ulddH2O 31 ul37℃酶切过夜50 ul reagent（⼀次多做⼏管）Day 21．Psuper 酶切产物鉴定回收（qiagen回收试剂盒）2．回收后点样确定⽚段⼤⼩（约3170bp）3．与合成的shCD133 mix 连接反应DNA T4 ligase 1 ulLigase buffer 2.5 ul退⽕后的寡核苷酸mix 10pmol 0.4 ulPsuper酶切产物0.5pmol 10 ul(15.3ng/ul,具体定量要根据质粒浓度确定) ddH2O 11.1 ul (25ul reagent, 16℃连接过夜) Day 3连接产物转化stbk3感受态，铺板Day 4挑取3-4克隆，摇菌（3ml左右）Day 5抽质粒，酶切鉴定酶切体系：1．酶切pSUPER-shCD133质粒shRNA 41 ul (约6 ug)ECor1 2 ulCla1 2 ul37℃酶切过夜50 ul体系buffer H 5 ulMarker 1 2 3 4 5 6 MDNA20001.2号质粒酶切⽚段处于Marker DNA2000 的250bp上⽅，273是正确的⽚段⼤⼩.注意3-6道的错误⽚段，其实与正确的273bp 差别不⼤，要注意仔细区分参⽐marker250这条带对应的位置。

慢病毒感染细胞 操作手册

慢病毒感染细胞 操作手册

慢病毒感染细胞实验方法一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。

若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。

若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。

二、实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清Ausbian VS500TDMEM Corning 10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50G Puromycin Clontech 631305D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制2.主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯IX71CO2培养箱日本三洋SANYO MCO-175倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco 21生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio 1200-Ⅱ-A2三、实验步骤1．准备目的细胞（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。

（2）完全解冻后，1300 rpm，离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。

（3）吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。

（4）24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。

2．目的细胞慢病毒感染（1）贴壁细胞：a.处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右。

慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。

所以要在细胞购进时就进行冻存。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7.将细胞离心，1000rpm，2min。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。

密度为3×105个/ml。

4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。

三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6. 第二天观察细胞存活率。

倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。

二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems， cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems， cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems， cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。

慢病毒滴度测定方法简介

慢病毒滴度测定方法简介

慢病毒滴度测定方法简介(表达荧光的慢病毒)Day 0：将生长状态良好的293T 细胞消化计数后稀释至1⨯105/ml, 加入96孔板，100 μl/孔(1⨯104个细胞)，每种病毒需要6个孔。

放入37℃，5% CO2培养箱中培养过夜。

Day 1: 在EP 管中做10倍梯度稀释，连续6个稀释度。

稀释方法如下：每种病毒准备6个1.5 ml EP 管，每管加入90 μl完全培养基，往第一个管中加入10 μl病毒原液，混匀后，吸取10 μl 加入第二个管混匀。

以此类推。

然后把稀释好的病毒和细胞孵育过夜。

Day 2：吸去带有病毒的培养液，在每个孔中再加入100 μl 完全培养液，以利于细胞的生长。

Day 3：显微镜观察荧光。

此时荧光会有初步表达。

Day 4：在荧光显微镜下观察结果，对荧光比例合适（10-30%之间）的孔进行细胞计数，并计算滴度。

其计算公式如下:滴度（TU/ml）=细胞数⨯荧光百分比⨯103/病毒原液体积(μl)。

举例：③号管对应孔的荧光比例为30%，细胞总数为8⨯104，滴度（TU/ml）=8⨯104⨯30%⨯103/0.1=2.4⨯108如果要感染2×105个细胞，MOI=30（1个细胞对应30个病毒粒子）（见下注），则需要病毒体积为=2×105⨯30/2.4⨯108（ml）=0.025 ml=25 μl.注：MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。

各种细胞的最适MOI值有差别，请客户正式实验前先进行预实验摸索最适MOI。