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第十四章 电泳分离技术

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《生物电泳分离技术》课件

《生物电泳分离技术》课件
随着新技术的引入，生物电泳分离技术将能够处理更多样品，实现高通量分析。
3 整合分析
结合其他技术，如质谱联用等，生物电泳分离技术将有更广泛的应用。
《生物电泳分离技术》 PPT课件
生物电泳分离技术是一种用电场作用于生物分子的分离方法。了解生物电泳 分离技术的定义和介绍是理解该技术的基础。
生物电泳分离技术的原理和机制
Principle
生物电泳分离技术基于生物分子的电荷和大小差异， 利用电场和凝胶矩阵的作用实现分离。
Mechanism
该方法利用分子在电场中的电迁移速度不同，通过 电泳迁移的方式实现分离。
3 环境
生物电泳分离技术可用于水质检测、环境局限性
优势
快速、高分辨率、可视化、简单操作是生物电泳分 离技术的优势。
局限性
生物电泳分离技术对样品量、电泳介质的选择等有 一定限制。
生物电泳分离技术的操作步骤和注意事项
1
前期准备
准备样品、电泳缓冲液、凝胶等。
生物电泳分离技术的类型和分类
1 类型
生物电泳分离技术包括凝胶电泳、毛细管电泳、等电点聚焦电泳等多种类型。
2 分类
根据分离依据可分为蛋白质电泳、核酸电泳、多肽电泳等多个分类。
生物电泳分离技术的应用领域
1 医学
生物电泳分离技术广泛应用于临床、医学研究等领域，如蛋白质分析和病原体检测。
2 农业
可用于农业上的育种、品种鉴定和土壤分析等方面。
制备凝胶
2
根据需要选择凝胶类型，制备凝胶板。
3
加载样品
将样品进行预处理后，通过加载样品孔
电泳
4
将其注入凝胶。
将凝胶板放入电泳槽中，施加电场进行
电泳分离。
5

电泳技术原理及蛋白质的分离电泳实验课件

电泳技术原理及蛋白质的分离电泳实验课件
的电荷（种类和数量）、大小和形状，在
一定时间内它们在相同电场中泳动速度不
同，各自集中到特定的位置上而形成紧密
的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技 术进行分离、分析和鉴定的基本原理。
-
（四）电泳的基本原理
勤奋 严谨 求实 创新
迁移率(mobility,m） 带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度
V m=
用
（四）影响电泳的因素
4.缓冲溶液
勤奋 严谨 求实 创新
• 决定带电颗粒的解离程度，即所带净电荷的量Q，pH>>pI，Q↑，V↑ pH值
• 最适离子强度在0.02～0.2， 离子强度 • I↑→吸引被分离带电颗粒→形成离子扩散层→被分离颗粒电动电势↓→V↓
• 溶液粘度η↑→V↓ 溶液粘度
勤奋 严谨 求实 创新
勤奋 严谨 求实 创新
T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质， 但过大，胶越硬也易脆裂。
T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。 但过小，胶稀软不易操作。
C过高，胶变脆，缺乏弹性，透明度降低。 C过低，聚合不良，呈糊状。
勤奋 严谨 求实 创新
根据样品分子的大小选择凝胶配方 一般情况下，体内蛋白质多采用7.5％浓度凝
勤奋 严谨 求实 创新
2. 电荷效应
• 在分离胶中进行，在高度浓缩的蛋白质薄层中，由 于各种蛋白质分子的PI不同，所带电荷不同，其迁 移率也不同，各种蛋白质就按迁移率的快慢顺序而 分离。
勤奋 严谨 求实 创新
3.分子筛效应
• 分子量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶 时所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同。因此表 现出不同的泳动率即所谓分子筛效应。
勤奋 严谨 求实 创新

电泳分离技术

电泳分离技术

不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度
泳动度
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量、颗粒大 小和形状有关。
被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： F=EQ
➢ 式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位 降；Q为被分离物所带净电荷。
（二）、影响电泳速度的因素
• 样品本身：带电量，分子大小，形状 • 电场强度：电压 • 缓冲液：成分， pH ，离子强度 • 支持介质：电渗作用，吸附作用 • 温度
影响泳动度的因素
1．电场强度 是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势
梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场 强度的不同，电泳可分为两种。 ➢ (1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。 分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质 等大分子物质。 ➢ (2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为50～200V／ cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、 多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
电泳技术概述
▪ 70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术 环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密 切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中 必不可少的手段。
二、电泳技术的基本原理
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其 电性相反的电极移动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术。
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
NH3+
NH2
P
P
COOH
COO-

电泳分离技术

电泳分离技术
他还多年担任诺贝尔基金评审 的委员，副会长和会长之职。
1971年10月29日因心脏病突发
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 而卒于家中，终年69岁。
电泳特点
在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作 用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为 常数，是该带电粒子的物化特征性常数。
4
阿恩·威廉·考林·提塞留斯 提塞留斯是瑞典著名生化学家
和物理化学家。1902年8月10日 出生在斯德哥尔摩，在乌普沙拉 大学获三个硕士和一个博士学位 ，毕业后留校任教。
他改进、设计了电泳仪，成功 地分离了血清中的蛋白质，对氨 基酸和肽也作了分离研究，改进 了色层分离法，他设计的电泳仪 至今还在应用，发展了生物化学 的研究手段，荣获1948年诺贝尔 化学奖。
不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷 相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一 定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分 开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比
6
电荷移动规律
利用电泳可以确定胶体微粒的电性质，向阳极移动的 胶粒带负电荷，向阴极移动的胶粒带正电荷。
一般来讲，金属氢氧化物、金属氧化物等胶体微粒吸 附阳离子，带正电荷；
8
电泳种类I ：
移动界面电泳 是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳
槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电 解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极 （正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其 他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。 只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其 中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。
非金属氧化物、非金属硫化物等胶体微粒吸附阴离子 ，带负电荷。
因此，在电泳实验中，氢氧化铁胶体微粒向阴极移动 ，三硫化二砷胶体微粒向阳极移动。利用电泳可以分 离带不同电荷的溶胶。

电泳分离技术

电泳分离技术

谢谢
THANKS
样本分析。
电场不均匀性
电泳过程中电场的不均匀性可 能导致分离效果不佳。
高成本
电泳分离技术所需的设备和试 剂成本较高，增加了实验成本
。
操作复杂度
电泳分离技术的操作相对复杂 ，需要专业人员进行操作和维
护。
05 电泳分离技术的发展趋势和未来展望
CHAPTER
技术创新和改进
高效电泳分离技术的研发
通过改进电泳分离技术的原理和工艺，提高分离效率和准确性，降低能耗和成本。
21世纪
随着生物技术的快速发展，电泳分离技术在基因组学、蛋白质组学等 领域的应用越来越广泛，成为生命科学研究的重要手段之一。
02 电泳分离技术的基本原理
CHAPTER
电泳现象
定义
电泳现象是指带电粒子在电场中受到电场力的作用而发生迁移的 现象。
原理
带电粒子在电场中受到电场力的作用，产生定向移动，使得粒子在 电场中分布不均，从而实现分离。
细胞分离
利用电泳分离技术可以分离不同种类的细胞，如淋巴细胞 分型、干细胞分离等，为细胞治疗和药物筛选提供支持。
在化学和环境科学领域的应用

有机物分离
电泳分离技术可用于有机物的分 离和纯化，如氨基酸、肽类、糖 类等，在化学合成和药物制备中 具有重要应用。
环境监测
电泳分离技术可用于环境样品中 污染物的分离和检测，如重金属 离子、有机污染物等，为环境监 测和治理提供技术支持。
电泳分离技术
目录
CONTENTS
• 引言 • 电泳分离技术的基本原理 • 电泳分离技术的应用 • 电泳分离技术的优缺点 • 电泳分离技术的发展趋势和未来展望 • 结论
01 引言

电泳分离

电泳分离

支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反 之，则泳动速度慢。
电泳时电流通过支持介质会产生热量，按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度（I）的平方、导体的 电阻（R）和通电的时间（t）成正比（Q=I2Rt）。
电泳的分类
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。 自由电泳包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。 区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、 聚丙烯酰胺凝胶）等。
谢谢观看
影响的主要因素
0 1
电场强度
0 2
溶液的pH
0 4
电渗
0 6
温度
0 3
溶液的离子 强度
0 5
支持介质的 筛孔
电场强度是指每厘米距离的电压降，又称为电位梯度或电势梯度。电场强度对颗粒的泳动速度起着十分重要 的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。根据电场强度的大小可将电泳分为高压电泳和常压电泳。常 压电泳的电场强度一般为2～10V/cm，电压为100～V，电泳时间从几十分钟到几十小时，多用于带电荷的大分 子物质的分离；高压电泳的电场强度为20～200V/cm，电压大于500V，电泳时间从几分钟到几小时，多用于带电 荷的小分子物质的分离。
溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度越慢。
在电场中，溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗。例如，在纸电泳中，由于滤纸纤维素上带有一定量的 负电荷，使与滤纸相接触的水在电场中，液体对于固体支持介质的相对移动称为电渗现象。由于电泳支持介质表 面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有SiOH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向 移动，形成介质表面溶液的流动。在pH>3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，使玻璃表面的溶液层带 正电，在电泳中向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加 快电泳速度；反之，则降低电泳的速度。

第十四章 电泳分离技术

第十四章 电泳分离技术

■ 联丙烯酰胺单体聚合过程：
聚 合 反 应
交联剂造成分枝
聚合反应
Bis 交錯连結 Bis
free radical
端点自由基 可再延续
自由基形成
一些概念
▪ 凝胶浓度和交联度 ▪ 不连续与连续胶 ▪ 变性胶及非变性胶
SDS (Sodium dodecyl sulfate)
十二烷基磺酸钠
凝胶的浓度和交联度
▪ 琼脂凝胶电泳：常用pH6-9;离子强度 0.02-0.05;硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液； 浓度常用1%-1.5%
▪ 琼脂凝胶电泳的优点：？？ 1. 近似自由界面 2. 液固相间无明显界面，电泳速度快 3. 不吸收紫外线，可直接用紫外检测仪测定 4. 容易染色易洗脱
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进 行，不加变性剂
■ SDS 在蛋白质表面 均勻敷上 一层负电：
SDS
boiling
原态蛋白质
变性蛋白质成一线狀分子 並且均勻帶上一层负电荷
极性头部
非极性尾部
■ 三种不同性质蛋白质的电泳比较：
Quaternary Molecular Protein Structure Weight
pI
Mobility
Native SDSPAGE PAGE
X Tetramer (40,000)x4 5.8 Slow Fast Y Monomer 88,000 5.2 Fast Slow Z Monomer 60,000 9.3 Upward Medium
X - Y - Z+
Native-PAGE
▪ 凝胶浓度：T（Acr和Bis总浓度） =(a+b)/m.100%

实验14 醋酸纤维素薄膜电泳法分离蛋白质

实验14 醋酸纤维素薄膜电泳法分离蛋白质

5. 定量 （可采用下面两种方法） 将膜条用滤纸压平，吸干，按区带分段剪开，分别浸 在5ml 0.4mol/l的NaOH溶液中，并剪取相同大小的无色 带膜条作空白对照，进行比色。 将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2~3min后， 取出贴在洁净的玻璃板上，干后为透明的薄膜图谱， 可用光密度计直接测定。
图2 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图
1为清蛋白； 2，3，4，5分别为α1-，α2-，β-及γ-球蛋白； 6为点样原点。

[实验操作注意事项] 实验操作注意事项]
点样前沿要平，点样好坏是电泳图谱是否清晰的 关键。 点样量要控制好，少则区带不清，多则有拖尾现 象。 电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接， 注意不要接错。
带电质点(分子 离子、胶体颗粒)在电场作用下 分子、 电泳 —— 带电质点 分子、离子、胶体颗粒 在电场作用下 向带相反电荷的电极移动的现象。除了电荷情况外， 向带相反电荷的电极移动的现象。除了电荷情况外，带电 质点的重量、形状等也对它的移动产生一定的影响。 质点的重量、形状等也对它的移动产生一定的影响。 各种蛋白质分子在不同的pH 条件下的带电情况不同，这 条件下的带电情况不同， 各种蛋白质分子在不同的 取决于蛋白质的等电点pI值—— pI＞pH 时，蛋白质带正 取决于蛋白质的等电点 值 ＞ 电荷； ＜ 时 蛋白质带负电荷。在这次实验的pH条 电荷；pI＜pH时，蛋白质带负电荷。在这次实验的 条 件(8.6)下，样品蛋白质带负电荷 下 样品蛋白质带负电荷———在电场中向阳极移 在电场中向阳极移 动。 醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方 醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成， 法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，具有均一泡沫样 结构，有强渗透性，对分子移动无阻力。 结构，有强渗透性，对分子移动无阻力。作为区带电泳的 支持物进行蛋白电泳有简便、快速，样品用量少等优点。 支持物进行蛋白电泳有简便、快速，样品用量少等优点。

电泳分离技术

电泳分离技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利用 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利用 人工合成的凝胶作为支持介质的区带电 泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 和交联剂N 和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺经过聚 合交联从而形成的三维空间凝胶网络。 合交联从而形成的三维空间凝胶网络。
第二节 电泳技术原理
高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0 05mm内径的毛细管； 一是采用了0.05mm内径的毛细管； mm内径的毛细管 二是采用了高达数千伏的电压。 二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发 ， 大大减小 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发， 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发 了温度效应，使电场电压可以很高。 了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高， 电场推动力大 ， 又可进一步使柱径变小 ， 电压升高， 电场推动力大，又可进一步使柱径变小， 电压升高 柱长增加， 柱长增加， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱 ， 理论塔 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱 板数高达几十万块/ 板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。 特殊柱子可以达到数百万。
仪器装置
1.高压电源 1.高压电源
稳定、连续可调的直流电源； （1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； 具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； 电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性：0.1%； 电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换； 电源极性易转换；
绘制标准曲线： 绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率： 按下式计算相对迁移率：

生物工程下游技术第十四章+电泳分离技术1

生物工程下游技术第十四章+电泳分离技术1

5.电泳技术问题及对策
1).低离子溶液中,不同电荷的蛋白质分子间会发生
相互静电作用,增加溶液离子强度可减少这种作 用,但会提高电泳时的电流,使产热更多,温度升 高又促进蛋白质的扩散,使区带变宽,分辨率下 降.因此电泳缓冲液的离子强度必须控制适当。
0.02-0.2M 的离子强度 离子强度低,速度快,发热低,有电渗 离子强度高,速度慢,发热大
高压(500—10000v)仅需几分钟
V:泳动速度:cm/秒or分
E:电场强度:伏特/cm
l:支持场的长度
(有效长度)
不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度
(2)影响泳动率u的因素
内因：1.净电荷
2.质点大小 3.质点形状
外因：1.V ( U/L)
2.缓冲液的pH (pH恒定)
3.离子强度[I] 最适:0.02-0.2
6).电泳过程发热量的控制: 发热的难题：蛋白质变性;蛋白质区带扩 散,分辨率下降; • 对策: ① 减少发热:降低电流,提高电压;提高传热 表面积;提高材质的传热系数;提高冷却 系统的温差. ② 减少扩散:增加缓冲系统或介质的黏度可 以减少扩散;在微重力作用下进行电泳;
思考
• 什么是等电点电泳?什么是等电聚焦电泳?
电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子、慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。
不连续系统浓缩效应示意图
• 连续胶与不连续胶:
连续胶：胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份不变
不连续胶:胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份变化
X Y Z
Tetramer (40,000)x4 5.8 Monomer Monomer 88,000 60,000 5.2

电泳分离PPT课件

电泳分离PPT课件
胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相， 比纸电泳分辨率高。
❖以上两种类型的电泳，由于介质的孔径 度大，没有分子筛效应，主要靠被分离 物的电荷多少进行分离。
4
第54页/共48页
③琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多
糖，一般用于核酸的分离分析。
（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应； （2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用； （3）无毒； （4）染色、脱色程序简单，背景色较低； （5）热可逆性； （6）生物中性：一般不与生物材料结合。
四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )
利用蛋白质具有不同等电点的特性，以 聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体 两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有 各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。
32
第332页/共48页
2）光催化系统：核黄素－光
催化剂: 核黄素（维生素B2）
引发剂: 光
.
TEMED的存在，可加速聚合。
15
第165页/共48页
聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成
16
第176页/共48页
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着 度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein) 在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只 与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。
24
第254页/共48页
两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对
数呈线性关系，符合下式：logMW=C-bm MW：分子量；m：迁移率；C、b均为常数

化学分离技术的电泳技术

化学分离技术的电泳技术

化学分离技术的电泳技术化学分离技术是一种可以将复杂混合物中的不同组分进行分离的技术。

在这种技术中，电泳技术是一种非常重要的技术，它可以根据化学物质的电性差异，将复杂混合物中的组分进行分离。

本文将深入讨论电泳技术在化学分离中的应用。

一、电泳技术的基本原理电泳技术是利用电场的作用将带电粒子分离的技术。

在电场作用下，带电粒子会在电场的力作用下移动，而移动的方向和移动速度取决于粒子的电荷量和大小、电场的大小和方向、粒子的分子量和形状等因素。

在实际应用中，电泳技术通常使用凝胶电泳和毛细管电泳。

凝胶电泳是将待测物质加入凝胶中，然后将凝胶放入电场中进行分离；毛细管电泳则是利用毛细管的内腔作为分离区域，在电场作用下进行分离。

二、电泳技术在蛋白质分离中的应用蛋白质是一种复杂的生物大分子，具有比较明显的水溶性和电性。

因此，在蛋白质分离中，电泳技术是一种非常有效的分离方法。

在蛋白质电泳中，通常使用凝胶电泳。

具体操作方法为：将蛋白质样品加入凝胶中，然后将凝胶放入电场中进行分离。

由于蛋白质具有不同的分子量和电荷性质，因此在电场作用下会分离出不同的带电蛋白质。

这种分离方式可以实现对于蛋白质的精确定量和分子质量的测定。

三、电泳技术在DNA分离中的应用电泳技术在DNA分离中也是一种非常常用的方法。

在DNA电泳中，通常使用凝胶电泳，具体操作方法和蛋白质电泳类似。

但是，DNA分子量较大，难以在电场中移动，因此在DNA电泳中通常需要加入一定的缓冲液和染料（如溴化乙锭）来帮助DNA分子的运动。

而在分离过程中，DNA会根据其分子量和电荷性质在凝胶上产生不同的迁移距离。

这种分离方式可以实现对于DNA的大小和形状的测定，并且可以用于DNA的纯化和检测。

四、电泳技术的发展趋势虽然电泳技术具有非常好的分离效果，但是它也存在一定的缺陷。

例如凝胶制备需要时间和成本较高，并且凝胶中的分离速度较慢。

为了克服这些缺陷，目前许多研究工作者正在寻求其他分离方法，如毛细管电泳、细微流动电泳、微流控电泳等新技术。

电泳分离法

电泳分离法
• 不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同 但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后， 由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加 电场的电压与电泳时间成正比。
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电荷移动规律
• 利用电泳可以确定胶体微粒的电性质，向阳极移动的胶粒 带负电荷，向阴极移动的胶粒带正电荷。
• 一般来讲，金属氢氧化物、金属氧化物等胶体微粒吸附阳 离子，带正电荷；
电化学分离方法
张宇
概述
电化学分离法的定义： ➢基于原子或分子的电性质以及离子的带电性质和行为进行 化学分离的方法。
电化学分离的特点： ➢������ 操作简单，往往可同时进行多种试样的分离； ➢������ 除消耗一定电能外，化学试剂消耗少，放射性污物少； ➢������ 分离速度比较快（除自发电沉积和电渗析），尤其高 压电泳，即使复杂样品也能快速分离。
2
1 自发电沉积 2 电解分离法 3 电泳分离法 4 电渗析分离法 5 化学修饰电极分离富集法 6 溶出伏安法
3
电泳分离方法
一、电泳分离法的发展和特点
前言
1937年，瑞典科学家蒂塞利乌斯设计了世界上第一台电 泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。 70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环 节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
设A、B两种带电粒子的迁移率分别为μA和μB，在电场作用下，经过时间
t后，它们的迁移距离为：
两种粒子迁移的距离差为：
由上式可得，μA-μB、t、V/L三者的值愈大，Δs 愈大，A、B两个
粒子之间分离愈完全。
20
影响电泳的因素
• 1. 电泳介质的pH值

《电泳分离》PPT课件

《电泳分离》PPT课件
Polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE ）
❖ 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其 分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物， 而且可以研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、 等电点及分子构型。
❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点： ①孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。 ②机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。 ③电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分 子的制备。
一、基本原理
（一）基本原理
当带电粒子
以速度ν 在电场
中移动时，受到 大小相等、方向 相反的电场推动 力和平动摩擦阻 力的作用。
电场强度 电泳阻滞力
物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。
（二）影响电泳速度的相关因素
1. 颗粒性质：带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗 粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径成反比。
2. 电场强度：E 愈高，带电颗粒的泳动速度愈快。 3. 溶液性质：pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈
大，净电荷愈多，泳动速度越快； 离子强度在0.02－0.2为宜; 泳动速度与溶液黏度成反比。
4.电渗 是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性 质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈 高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗方向 一致时，加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方 向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。
蛋白质分子的构型起主要作用
三.不连续凝胶电泳的分离原理
（一）原理
系统的不连续性表现在以下几个方面：
❖凝胶系统的不连续性：上层为大孔径的浓缩 胶，下层为小孔径的分离胶。
❖缓冲液离子组成及pH的不连续性：电极缓冲 液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为 pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的 Tris-HCl缓冲液。

_电泳分离

_电泳分离

2、薄层电泳 、
将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层 进行电泳的技术。 常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅 胶等 操作：
（1）缓冲液选择 （2）支持物处理 （3）薄层板制作 （4）加样 （5）电泳 （6）分析 离子强度较高的缓冲液 精制品 挖沟、混合样品、填埋 印染法
3、薄膜电泳(film electrophoresis) 薄膜电泳(film
带电物质在电场作用下，因其电荷性 带电物质在电场作用下，因其电荷性 电荷数量及分子量大小的不同而 质、电荷数量及分子量大小的不同而 泳动方向、 的不同， 产生的泳动方向 泳动速度的不同 产生的泳动方向、泳动速度的不同， 最终使混合物组分得以分离 的操作 单元称为电泳分离 电泳分离（ 单元称为电泳分离（electrophoresis separation 主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、 主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、 酶等电点测定及小批量酶的分离纯化。 酶等电点测定及小批量酶的分离纯化。
（2）两性电解质载体 ） 理想的两性电解质载体： 理想的两性电解质载体： a）在等电点处有足够的缓冲能力，保证 梯度稳 ） 等电点处有足够的缓冲能力，保证PH梯度稳 定。 b）在等电点处有足够的电导，允许一定的电流通 ） 等电点处有足够的电导， 过。 c）分子量要小，易于与被分离物质分开。 ）分子量要小，易于与被分离物质分开。 d）不与被分离物质发生反应或使之变性。 ）不与被分离物质发生反应或使之变性。
（5） 操作要点
pH梯度支持介质的制备 （自由电泳，凝胶支持系统） 聚焦电泳 分离组分的检测
（必要时可以在检测之前采用透析， 膜分离等方法除去两性电解质载体）
(3)等电聚焦操作关键是调配稳定的、连续的PH梯度。 等电聚焦操作关键是调配稳定的、连续的 梯度 梯度。 等电聚焦操作关键是调配稳定的 氨基酸混合物或 一般用氨基酸混合物 聚氨基羧酸（多氨基、 一般用氨基酸混合物或聚氨基羧酸（多氨基、多 梯度。 羧基）的缓冲溶液调配PH梯度 羧基）的缓冲溶液调配 梯度。 (4)PH梯度支持介质：聚丙烯酰胺凝胶最常用， (4)PH梯度支持介质：聚丙烯酰胺凝胶最常用，其次 梯度支持介质 最常用 是琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶。 琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶。

电泳分离技术的研究和应用

电泳分离技术的研究和应用

电泳分离技术的研究和应用现代科技中的电泳分离技术，是一种基于电场作用的分离手段，广泛应用于制药、化学、生物、食品科学等领域。

它利用分子之间的不同电性质，使它们在电场中受到不同的作用力，达到分离杂质、纯化、富集等目的。

下面，我们就来探讨一下电泳分离技术的研究和应用。

一、电泳分离技术的原理电泳分离技术是基于分子在电场中的不同电性和大小而实现的分离方法。

它利用带电小分子在电场中受到的电荷作用力和摩擦力进行分离。

因此，分子的大小、电荷性质及溶液中存在的离子强度都会影响电泳的分离效果。

二、电泳分离技术的分类电泳分离技术主要分为毛细管电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、电泳层析等几种类型。

其中，毛细管电泳技术广泛应用于生物医药、食品检测等领域，并在分析分离中特别有效。

凝胶电泳技术可以拆分DNA，并在分离中被广泛应用。

等电聚焦电泳主要应用于蛋白质研究。

电泳层析技术主要应用于有机化学、生物技术等领域，它可用于大量的蛋白质结构的纯化和分析。

三、电泳分离技术的应用1、药品分析和开发领域在现代医学领域，电泳分离技术已经在药品分析和开发领域被广泛应用。

特别是毛细管电泳技术的发展，使得药品分析的精确度和敏感度有了很大的提高。

2、生物医学领域电泳分离技术在生物医学领域的应用非常广泛。

例如在制备、分离和纯化DNA、RNA和蛋白质方面，电泳分离技术已经成为不可替代的工具。

可以通过凝胶电泳或者毛细管电泳技术分离出DNA序列，以便进行疾病诊断和研究。

3、食品科学领域电泳分离技术在食品科学领域的应用也非常广泛。

其中，凝胶电泳技术被广泛应用于食品检测，以检测食品中的农药残留、病毒和细菌等危害因素。

4、环境监测领域在环境监测方面，电泳分离技术非常适用。

例如可以利用毛细管电泳技术检测水中的有机物和无机物污染物。

综上所述，电泳分离技术是一种非常有效的分离手段，根据不同的分子属性，可以用于杂质分离、纯化、富集等目的。

同时，在诊断和分析化学、医学、食品科学、环境科学等领域中应用广泛。

电泳分离的原理

电泳分离的原理

电泳分离的原理下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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• 支持介质：电渗作用，吸附作用
• 温度
影响泳动度的因素
1．电场强度 是指每厘米场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场 强度的不同，电泳可分为两种。
(1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。 分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质 等大分子物质。 (2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为50～200V／ cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、 多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。
2.不连续系统： 缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连 续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子 筛效应。
电泳作用效应
分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的
蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不
同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。
SDS (Sodium dodecyl sulfate)
十二烷基磺酸钠
凝胶的浓度和交联度
凝胶浓度： T（Acr和Bis总浓度）=(a+b)/m.100% 交联百分比： C（交联剂的百分比）=b/(a+b).100% a:Acr浓度；b: Bis浓度；m:缓冲液体积
凝胶的浓度和交联度
浓度和交联剂浓度决定胶的物理状 态及分子筛的孔径的大小
(一)、泳动度u
(迁移率):
带电质点在单位强度电场下的泳动速度
u:泳动度or泳动率(cm/
伏·秒or分)
d:泳动距离:cm t:电泳时间:秒/分
U:电压:常压(100—500v)
高压(500—10000v)仅需几分钟
V:泳动速度:cm/秒or分
E:电场强度:伏特/cm
l:支持场的长度
(有效长度)
不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度
琼脂糖凝胶电泳的基本操作
１、配制缓冲液贮备液 ２、水平型琼脂糖凝胶制备 ３、样品的制备与点样 ４、电泳 ５、染色 ６、样品回收
紫外
+
-
水平板式电泳槽
垂直板式电泳槽
﹣
﹣
﹢
﹢
在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外 光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成
● 不连续胶有聚焦样品的作用
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
三种物理效应
⑴样品浓缩效应 ⑵分子筛效应 ⑶电荷效应
三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高
（1）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。
①凝胶孔径不连续性
②缓冲液离子成份的不连续性
③pH的不连续性
⑴．样品浓缩效应
凝胶孔径的不连续性 分离胶为小孔胶。 样品胶及浓缩胶为大孔胶；
2 1 2 CH2=CH-CO-NH2
Acrylamide 有毒性！
TEMED (catalyst):四乙基乙二胺 帮助传递自由基的催化剂
核黄素-TEMED系统与过硫酸铵-TEMED系统
■ 联丙烯酰胺单体聚合过程： 聚 合 反 应
交联剂造成分枝
聚合反应 free radical
Bis
交錯连結
Bis
第十四章 电泳分离技术
一、电泳技术概述
1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电 泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。
20世纪50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的 电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及 琼脂作为支持物。 60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支 持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电 聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具 有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
■ 凝胶的聚合反应：
Ammonium persulfate (free radical initiator)过硫酸铵
(O4S-SO4 )
2-
2 SO4
1 1
自由基的生成者 Acrylamide (monomer) Bis(acrylamide) (bridge)
交联使聚合产生分枝:甲叉丙烯酰胺
凝胶的基本單位:丙烯酰胺
• 只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一 个个台阶状的图形; • 等速电泳(isotachophoresis) • 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速 移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电 泳，它的区带没有重叠，而是分别保持; • 等电聚焦 (isoelectricfocusing)
电泳技术概述
70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术 环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密 切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中 必不可少的手段。
二、电泳技术的基本原理
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其 电性相反的电极移动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术。
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P COOH P COONH3+ P COONH2
pH＜pI
pH＝pI
pH＞ pI
pH>pI 分子带负电荷，在电场中向正极移动; pH<pI分子带正电荷，在电场中向负极移动;
的条带。
核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系: 共价闭环
超螺旋结构DNA>直线DNA >双链环状DNA
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由 Raymends和 Weintraub．L建立。1964年， 此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推 广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目 前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离 和分析。
分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻
力大，移动慢。
电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。
㈠、凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)
1、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高 聚物，是由 D— 半乳糖和 3 、 6— 脱水 —L— 半 乳糖结合的链状多糖。
琼脂糖
一般浓缩胶：2-5%，a:b=20 分离胶：7-10%，a:b=40 标准胶浓度：7%
在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体 内的蛋白质能得到满意的分离效果。因 此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。
对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶 或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出 适宜的凝胶浓度。
• 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成 pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带， 分辨率很高。
混合
分立
稳态 时毗邻
移界
区带
等速
稳态 时分立静 止 等电聚焦
pH
AB
ABC
AB
B
B A B A
A B C
9
A
CBA
8 7 6
+
根据操作方式分类
1.连续系统： 缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都
影响泳动度的因素
4．电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。 如纸电泳时，滤纸吸附OH-带负电荷，与纸接触的 缓冲液带正电荷向负极移动。
影响泳动度的因素
5．温度 电泳时会产生焦耳热，使介质黏度下降， 分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使 样品中的生物大分子变性失活。 因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却 散热装置。 6．支持物 要求是均匀，吸附力和电渗小，机械 性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明， 无紫外吸收。
泳动度
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量、颗粒大 小和形状有关。
被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为：
F = E Q 式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位 降；Q为被分离物所带净电荷。
（二）、影响电泳速度的因素
• 样品本身：带电量，分子大小，形状
• 电场强度：电压
• 缓冲液：成分， pH ，离子强度
三、电泳的分类
按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、平 板电泳；
按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙 烯酰胺电泳、自由电泳；
按分离原理分类
• 移界电泳（moving boundary EP） 不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带， 可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出— 个个互相分离的峰; • 区带电泳(zone EP)
蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球 状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之， 则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛 作用将各种蛋白质分成各自的区带。
这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是 大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。
端点自由基 可再延续
丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺
聚丙烯酰胺凝胶具 有一定的网状结构。 如果形成的孔径大小 接近于所分离样品分 子的平均半径，样品 分子在通过凝胶孔洞 时，所受到的阻力就 会和样品分子的大小 及形状有关。
聚丙烯酰胺凝胶的优点
①在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
②化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应； ③对pH和温度变化较稳定；
④几乎无电渗作用；
⑤样品不易扩散，其灵敏度可达10-6g； ⑥凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节； ⑦分辨率高； PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的 分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、 等电点等。