生物仪器分析复习资料.docx

⽣物仪器分析复习资料.docx

第⼀章⽣物样品的预制备1、从⽣物⼤分⼦的预制备过程来说，⼀般包括材料选择和预处理（如洁净、切⽚、风⼲等）、

破碎、提取纯化、浓缩、结品、⼲燥和贮藏保存等步骤，应该根据各个步骤的具体要求和⽣物样品來源（动物、植物或微⽣物培养物）的不同⽽采⽤不同的⽅法和技术设备。2、超声波细胞破碎机是利⽤超声波在液体中产⽣的空化效应，可⽤于各种动物、植物细胞, 细

菌及组织的破碎和匀浆化。3、固相萃取⽤于样品分析前的净化或富集。

4、固相萃取的⼀般步骤是：液态或溶解后的固态样品倒⼊活化过的固体萃取柱，然后利⽤抽

真空、加压或离⼼⽅式使样品进⼊固定相；然后再⽤另⼀种溶剂把⽬的组分从固定相上洗脱下来。5、固相萃取（SPE）的萃取过程包4S四个基本步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗和待测

组分洗脱。6、旋转浓缩仪是在维持低于⼤⽓压的压⼒下将较⼤体积的液态样品进⾏蒸发从⽽有效地⼤⼤

缩⼩样品体积的装置，也是分离⼯作中的必备设备之⼀。它特别适⽤于预分离的组分不耐较⾼温度的热敏性或⾼黏度样品、抽提溶剂是⽔⼀类不易挥发的⼤容积抽提液的浓缩，例如⾊素抽提液、糖类的⼄醇抽提液的浓缩等。7、利⽤强⼤的离⼼⼒讲物理性质（如质量、浮⼒、沉降系数等）不同的悬浮液内微粒进⾏分

离、浓缩的技术称为离⼼技术。离⼼技术特别适⽤于溶液量较⼩或沉淀黏稠的⽣物样品的分离。8、离⼼机的主要参数：1、相对离⼼⼒当离⼼机转头以⼀定的⾓速度3旋转，对于旋转半径

为r的任何颗粒所受到的向外离⼼⼒F可表⽰为：F=mo2r习惯上F常以相对离⼼⼒（RCF）的⼤⼩来衡量，指在离⼼时作⽤于颗粒的离⼼⼒相当于重⼒的倍数，即RCF=m"r/mg= w~r/g 式中，g为重⼒加速度（约等于980cm/s2）o2、沉降系数澄江系数指单位离⼼⼒作⽤下颗粒的沉降速度，⽤Svedberg （简称S）

表⽰，量纲为s （秒）。lS=1013s o3、沉降速度沉降速度指在离⼼作⽤下颗粒在单位时间内运动的距离。

9、离⼼过程中决定颗粒沉降速度的是该颗粒的半径和有效密度。由于沉降速度随颗粒半径的

平⽅值的变化⽽变化，可见颗粒⼤⼩是“影响更⼤于”颗粒密度的因素。因此，具有相似⼤⼩或密度的颗粒可有完全不同的沉降速度，从⽽得以彼此分离。10、通常根据⽤途将离⼼机分为制备性离⼼机和分析性离⼼机两类。也可根据离⼼机的转速

分为低速（＜6000r/min）、髙速（6000^25000r/min）和超⾼速（＞30000r/min）离⼼机。11、离⼼机使⽤注意事项：1、根据分离对象和有关资料，选择合适的离⼼转速（或离⼼⼒）

和离⼼时间，在安全速度内运⾏。2、样品必须保持平衡。

3、转头通常较重，在更换时必须⾮常谨慎，轻取轻放，避免碰撞或掉落。离⼼前必须确认

是否正确组装、上紧盖⼦。12、技术路线可能⽤到的设备

细胞破碎匀浆器、超声波破碎器、⾼速组织捣碎机

分离提収萃収器、各式离⼼机

纯化精制离⼼机、层析柱、电泳仪浓缩旋转蒸发浓缩仪

结晶、⼲燥真空⼲燥机、冻⼲机

冷藏冻存超低温冰箱

上述所⽰的是分离蛋⽩质或輛的⼀个前处理步骤中，对应于拟采取的技术路线可能⽤到的

仪器或设备的例⼦。

第⼆章细胞⽣物学新型研究技术与设备1、激光扫描共聚焦显微镜系统利⽤紫外光或可见光激光激发荧光探针⽽得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，具有快速、实时、定性、定量、定位地进⾏分析测量的功能，尤其是可进⾏活细胞的⽆损伤测定，并可利⽤强⼤的计算机图像处理技术将⼀定厚度范闱内的细胞或结构的虚拟光学切⽚进⾏三维重建⼯作。2、LSCM共聚焦的⼯作原理：1、在LSCM系统中采⽤了点光源，由点光源发出的激光光束通过光源针孔；2、经过⼆⾊镜折射⾄物镜后，聚焦于样品的焦平⾯上；3、从样品表⾯上反射回来的光信号反向并透过⼆⾊镜刚好会聚在共聚焦检测孔上，被放置在该位置上的光电倍增器所接受，这样就采集到了从样品的聚焦点上获得的该点的信息；4、在焦平⾯上作X或Y 轴向的逐点逐线的移动扫描所获得的信息，经计算机储存、处理，即可获得该XY平⾯的⼆维图像。LSCM I作吋可以根据研究需要选择不同的扫描⽅式，既可以沿着Z轴打描得到⼀系列XY平⾯，也可以沿着Y轴扫描得到⼀系列XZ平⾯。借助于计算机的图像处理专⽤软件, 可以将这些平⾯图像“堆积”起來，成为⽴体的三维图像。这就是所谓的三维重建的基本原理。3、典型的LSCM系统构成由激光光源、扫描头、显微镜、计算机控制系统、图像信息储存及输11!设备等组成。

4、LSCM的基本功能可分为两个⽅⾯，即利⽤LSCM进⾏各种细胞⽣物学功能的研究，以及利⽤扫描所获得的图像信息（光学切⽚）进⾏各种图像的加⼯处理等静态或动态图像分析研究⼯作。（⼀）黏附细胞的分选（⼆）细胞膜流动性的研究（三）“光陷阱”技术（四）光漂⽩恢复技术（五）光活化技术（六）Ca2+、pH及其他胞内离⼦的动态荧光测定（七）三维图像重建5、荧光探针就是荧光染⾊试剂，是能在外在光源激发下发射出⼀定波长可见光的⼀类有机化合物。

6、在选择使⽤合适的荧光探针时应注意的两个问题如下述。

1、最⼤吸收波长或最⼤发射波长

2、光漂⽩光漂⽩也称光褪化效应，使⽤时■应尽量避免过度强光或长吋间照射，以免缩短样品使⽤寿命。

7、（⼀）细胞样品的准备⼀般要求细胞是单层且悬浮分散的

（⼆）荧光探针的标记根据实验⽬的和对象，选择合适的荧光探针⾮常重要。通常可以参考有关⽂献和资料做出选择。荧光探针选定后，可以根据实验室的条件，选择合适的⽅法将荧光探针引⼊胞内。现在常⽤的引⼊⽅法有：显微注射法、温育法和透膜剂法等。8、流式细胞仪是对单个细胞、细胞群或其他⽣物微粒进⾏快速分析或分选的新型仪器。它综合了现代电⼦物理技术、激光技术、和计算机技术等，可对⾼速流动状态下预经荧光探针标记的细胞同时进⾏多种参数分析。9、FCM具有下列优点：（1）通⽤性⼴只要是单细胞悬浮液即可⽤于分析。（2）⾼速度

（3）⾼灵敏度（4）多参数设定（5）⾼纯度10、流式细胞仪的基本结构：FCM主要包括液流系统、光学系统、分选系统（可选功

能）、⾃动进样器（可选件）等。11、流式细胞仪的分析及分选原理

（1）在进⾏分析之前，必须预先制备好经荧光染料标记的单细胞悬浮液，在⽓体压⼒下通过样品管引⼊到喷嘴内形成样品流。

（2）于此同时，不含细胞的鞘液也经鞘液管压⼊喷嘴，包围在样品液外形成分层鞘液流的同轴流动。

（3）处于中⼼轴流动状态的样品流直径约30 pm,⽽鞘液的直径约为50^100p mo这种由鞘液和样品流组成的圆形流束⾃喷嘴喷射出來后，与激光光朿形成垂直相交状态。（4）单个细胞的样品流匀速通过激光束照射后，其标记上的荧光染料受到激发⽽发出荧光, 并产⽣光散射。这种反映细胞内部结构特点的荧光信号和反映细胞体积⼤⼩等信息的光散射信号被设置在与样品流垂直⽅向的多通道荧光检测器和光散射检测器检验并放⼤，根据荧光强度与胞内⽣物⼤分⼦含量的⽐例关系，可以对细胞进⾏定量分析。

（5）当带上不同电荷的细胞液流经⼀对带有⼏「伏恒定静电场的偏转板时，这些带电荷的⼩⽔滴将根据⼝⾝所带的电荷性质发⽣偏转，进⼊两侧的收集管中，⽽不带电荷的⽔滴则径直落⼊废液收集管⼬，从⽽实现对细胞的分选。12、FCM各种常见参数的符号及意义简述如下：

（1）前向散射光。这种散射光信号的强弱直接反映了细胞体积的差异。

（2）90。散射光。这种散射光信号反映了细胞内颗粒物质的⼤⼩或多少。

（3）荧光参数。反映了荧光探针所标记的细胞内不同物质性质的差异。13、FCM样品制备的主要步骤

制备符合FCM分析特殊要求的单细胞悬浮液，是FCM分析的基本要求和关键环节，常⽤的有酶学法（利⽤各种分解酶来消化或分散组织）、化学法（利⽤各种螯合剂与组织上的⼆价阳离⼦5+、Mg+、和单价阳离⼦结合，破坏细胞内的粘连使之分散出來），以及物理法等。⼏个步骤：

（1）制备合适浓度的单细胞悬浮液。

（2）利⽤选定的荧光探针标记，⽬的细胞或胞内⽬的成分。

（3）上机分析测定。

（4）测定数据的判读和⽜物学意义的解释。

第三章⾊谱技术及其相关设备1、⾊谱分析是⼀类利⽤分离介质将样品⼬的各组分进⾏定性或定量的分离和分析技术。

2、⾊谱法也称⾊层法或层析法，其分离驱动⼒来源于样品中各组分在不同的两相间的浓度差，即相同分配技术的差别。不同组分在两相间的连续相对移动（分配和传递）的结果，可实现⼀系列组分的分离和分析的⽬的。其⼬，使组分在相间移动的介质称为移动相，⽽固定不动的部分则称为固定相。

（⼀）按两相状态分类

⽓相⾊谱。⽓相⾊谱以⽓体为流动相。

液相⾊谱。以某种液体为流动相。在液相⾊谱中尚有⼀些传统或较新发展的⾊谱技术，如: 尺⼨排阻⾊谱。3、有关⾊谱图的常⽤术语及其定义简介：

1、基线

没有样品只有流动相进⼊检测器时的流出曲线，反映了样品信号为零时噪声信号随时间变化的检测器本底信号，通常为⼀直线，称为基线。2、峰⾼

从⾊谱顶点到基线的垂直⾼度，⼀般与组分的量成正⽐，可⽤作定量分析的根据。3、区域宽度

以下列三种参数表⽰，反映⾊谱柱或⾊谱条件的优劣。

（1）峰宽也称峰底宽度或基线宽度，指⾊谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距。

（2）半⾼峰宽，h/2处所对应的峰宽。

（3）标准偏差G即0. 607h处⾊谱峰宽的⼀半。

上述三个参数间的关系为：W=4c

W I/2=2.35G4、保留值

保留值是下列具体参数的总称。

（1）死时间S流动相中的溶质不被固定相吸附或溶解⽽经过⾊谱柱的时间，表现在该⾊谱图上即是从进样到出现峰值所需的吋I'可O

（2）保留时间切这⾥最常⽤到的保留值，指从进样到出现峰顶的时间

（3）调整保留时间t：,为保留时间扣除死时间的值，即t r ⼆t r⼀to

（7）锋⾯值A由整个峰曲线所围绕起来的⾎积，它和峰⾼⼀般与组分的含量和浓度成正⽐, 是定量分析的基本依据。4、分离参数

1、分配系数K

样品组分在⾊谱柱⼬的分离实际上是组分在流动相与固定相多次反复交配过程。它可⽤⼀个成为分配系数的K的参数来描述。分配系数K为⼀-定温度及压⼒下组分在两相间达到平衡吋的浓度⽐。K^Cs/G2、分配⽐k

分配⽐k指在⼀定温度及压⼒下组分在两相间分配达到平衡状态时分配在固定相和流动相中的质量⽐。即⼆CsVc/（Cn. Vm）3、相⽐率B

想⽐率B描述的是分配系数K和分配⽐率k的关系，可⽤下式表⽰：B ⼆K/k

5、分离度⼜称分辨率，定义为相邻两组份的⾊谱峰保留值之差与两组⾊谱峰低競均值的⽐值。R= [t r（B）-t r（A） ] /O. 5（W A+W B） =2 [t r（B）-t r（A） ] / （W A+W B）

显然，R值越⼤，表明两组分的分离效果越好，⼀般來说，当R〈1时，两峰有重叠；当R⼆1 时，分离程度可达95% （即两峰5%重叠）；当R⼆1.5时,分离程度可达99. 7% （即两峰重叠部分为0. 3%）。实际上常以R⼆1. 5作为相邻两组分已完全分离的标志。6、⽓相⾊谱法是以⽓体为流动相的⾊谱分析⽅法。根据固定相的状态乂可以分为⽓-固⾊谱和⽓-液⾊谱两类。前者采⽤多孔性固体为固定相，使⽤于⼀些永久性⽓体及沸点化合物的分离；后者采⽤⾼沸点的有机物涂渍在惰性载体上。7、⽓相⾊谱法原理：经预制备的合适样品（多为液体和⽓体状态）由进样器注射进汽化室汽化，并在载⽓的带动下进⼊⾊谱柱。由于样品⼬各组分在沸点、极性或吸附性能上的差异, 使得各组分在流动相和柱内的液体或固体固定相Z间形成反复多次的分配或吸附与解吸附, 因此在载⽓中K值⼤（分配浓度⼤）的先⾏流出⾊谱柱，⽽在固定相中，K值⼤的组分则滞后流出。这些先后流出的组分经检测器的信号检出及转换，以电信号的形式输出，其有⽆及⼤⼩与各组分的量或浓度成正⽐例关系。8、根据⾊谱柱的不同，⽓相⾊谱仪课分为填充柱⽓相⾊谱仪和⽑细管柱⾊谱仪两种类型。