实验十一 紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选

实验十用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株【实验目的】：了解并熟悉抗药性突变株的筛选原理和方法【实验原理】：经诱变处理后的微生物群体中，虽然突变的数目大大增加，但所占的比例仍然是整个群体中的极少数。

为了快速、准确地得到所需的突变体，必须设计一个合理的筛选方法，以杀死大量的未发生突变的野生型，而保留极少数的突变型。

梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种有效简便方法，其操作要点是：先加入不含药物的培养基，立即吧培养皿斜放，待培养基凝固后形成一个斜面，再将培养皿平放，倒入含一定浓度药物的培养基，这样就形成一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基，然后再将大量的菌液涂布于平板表明上。

经培养后，在高浓度药物处出现的菌落就是抗药性突变型菌株。

【材料和器皿】：（1）菌种：大肠埃希氏菌（2）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2×（2倍浓度）牛肉膏蛋白胨培养液（分装于小三角瓶中，每瓶装20ml），生理盐水。

（3）器皿：培养皿，涂布棒，移液管，滴管，离心机【方法和步骤】：1 制备菌液从已活化的斜面菌种上挑一环大肠埃希氏菌于装有5ml牛肉膏蛋白胨培养液的无菌离心管中（接2支离心管），置37℃条件下培养16h左右，离心（3500r/min，10min），弃去上清液后再生理盐水洗涤2次，弃去上清液，重新悬浮于5ml的生理盐水中。

并且将2支离心管的菌液一并倒入装有玻璃珠的三角瓶中，充分振动以分散细胞，制成108/ml的菌液。

然后吸3ml菌液于装有磁力搅拌棒的培养皿中。

2 紫外线照射（1）预热紫外灯：紫外灯功率为15W，照射距离30cm。

照射前先开灯预热30min。

（2）照射：将培养皿放在磁力搅拌器上，先照射1min后再打开皿盖并计时，当照射达2Min 后，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。

3 增殖培养（在暗室红灯下操作）照射完毕，用无菌滴管将全部菌液吸到含有3ml 2×牛肉膏蛋白胨培养液的小三角瓶中，混匀后用黑纸包裹严密，置37℃培养过夜。

实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选Ⅰ. 紫外诱变技术一实验目的以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。

了解紫外线对细菌细胞的作用。

二实验材料和用具菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基生理盐水等器皿：10ml及1ml的移液管，无菌试管，无菌培养皿，无菌三角瓶（内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管，离心机，紫外诱变箱等。

三实验原理以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。

因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。

为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。

物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。

在生产和科研中可利用此法获得突变株。

四实验内容1、对出发菌株进行处理，制备单细胞悬液；2、紫外线进行处理；3、用平板菌落计数法测定致死率；五 操作步骤（一）出发菌株菌悬液的制备1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h ；2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm 振荡培养过夜（约16h ），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h ；3. 取4ml 培养液与5ml 离心管中，10000rpm 离心3~5min ，弃去上清液，加4ml 无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液；4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡20~30min ，以打散细胞；5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注肉汤平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml 菌液，37℃倒置培养24~36h ，进行平板菌落计数。

一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。

2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。

3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。

二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。

紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。

三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。

2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。

3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。

四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。

2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。

3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。

4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。

5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。

6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。

7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。

五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。

2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。

大肠杆菌抗药性菌株的筛选【实验目的】掌握微生物变异的原理，学习用梯度平板法分离抗药性突变株。

【实验原理】基因突变可分为自发突变和诱发突变。

许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用。

基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。

这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例子。

抗药性突变株是指野生型菌株基因突变产生的对某些化学药物的抗性变异类型，可在加有相应药物的培养基平板上选出。

抗药性突变是DNA 分子的某一特定位置的结构改变所致，有药物的存在无关，药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的鉴别手段。

在含有一定浓度抑制生长的药物平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞在平板上长成菌落。

纯化后进一步进行抗性试验，就可以得到所需的抗药性菌株。

为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。

本实验用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素、青霉素和红霉素突变株。

【实验器材】大肠杆菌 ; LB液体培养基； LB琼脂培养基；链霉素、青霉素和红霉素；70%乙醇；无菌吸管，烧杯，试管，玻璃涂棒，水浴锅等。

【操作步骤】1.接种大肠杆菌与盛有5ml L B培养液的试管中，37℃震荡培养24h。

2.在水浴锅中融化LB培养基。

3.倒10ml已融化不含药物的LB琼脂培养基于无菌培养皿中，将培养皿一端垫起使培养皿表面在垫起的一端刚到培养皿的底与边的交界处凝固。

4.在凝固的平板底部高琼脂一边标上低，放平后在底层培养基上分别加入每毫升含有100ug链霉素、青霉素和红霉素的LB琼脂培养基10ml，凝固后制得链霉素浓度从0到另一端的100ug∕ml 的梯度平板。

5.用1ml无菌吸管吸取0.2ml大肠杆菌培养液加到梯度平板上。

用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面。

如用蘸有乙醇并经火焰灭菌的玻璃涂棒，可在火焰旁或伸进培养皿在板盖上充分冷却以免烫死细胞。

6.将平板于37℃培养48 h.7.选择1—2个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触该菌落朝高药物浓度的方向划线。

运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株摘要本文介绍了运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株的方法，并对其进行筛选、鉴定及酶活测定。

通过实验验证，成功选育出一株植酸酶高产菌株，其酶活达到了较高水平。

介绍植酸酶是一种具有解除植物中植酸盐抗营养因子作用的酶。

在动物、人类体内，它能够释放无机磷以提高对磷的利用效率。

因此，植酸酶在生物技术和农业生产中具有极高的价值。

目前，获得植酸酶高产菌株的方法有很多，例如基因工程、长期培养筛选等。

然而，这些方法对设备、时间、技术水平等要求比较高，成本也比较高。

相比之下，运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株更具优势。

紫外诱变是一种传统的微生物术语。

它是指用紫外线辐射处理微生物，产生突变，从而改变微生物的某些性状的过程。

它有着速度快、操作简便、筛选效果显著等优点。

实验材料和方法实验菌株以原繁压菌作为研究对象。

原繁压菌是一种常见的生物菌株，可用于生物技术、医药、环保等领域。

实验中使用的原繁压菌来自于某生物技术公司。

实验设备和试剂实验设备包括无菌工作台、高压灭菌器、紫外线灯、恒温振荡培养箱、分光光度计等。

试剂包括琼脂、LB培养基、植酸盐、硝酸钠、Na2HPO4等。

实验步骤1.取10微升的原繁压菌液放置于琼脂平板上，待其全面涂布后将其放入无菌工作台上恒温培养。

2.取1平板用紫外线灯辐照1分钟，同时对照组以同样方式处理。

3.将受照试验组培养菌悬浮于LB液体培养基中，恒温振荡培养，选取菌株后进行次级发酵。

4.通过过筛试验及酶活测定鉴定所获得的高产菌株。

实验结果及分析经过实验验证，紫外诱变成功激发原繁压菌中某些菌株的植酸酶高产潜力。

在恒温振荡扩大培养的过程中，筛选和鉴定了一类植酸酶高产菌株。

经过次级发酵，该高产菌株平均比对照组酶活测定提高了50%左右，酶活达到了200u/g左右。

本实验成功地运用了紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株。

该方法操作简便，快速，能够筛选出带有目的性的高产菌株。

本实验结果可以为利用微生物生产高附加值产品提供实验参考。

紫外突变技术及抗药性突变菌株的筛选简述后培养的目的及注意事项
紫外突变技术是利用紫外线辐射使细菌基因发生突变的一种方法,可以产生新的遗传变异体。

抗药性突变菌株的筛选则是指通过对细菌进行一定的选择压力（如加入抗生素）,筛选出能够产生抗药性的突变体。

经过紫外线诱导后得到的突变体需要进行培养,在培养中筛选出对目的选择压力具有抗性的突变体。

比如,如果目的是筛选出抗生素的突变体,则应将突变体接种到含有抗生素的培养基上进行筛选。

同时,也要注意对突变体进行鉴定,以保证所得到的新型细菌具有确定的生物学特性。

在突变体筛选及后续培养过程中还要注意以下事项：
1. 突变体要保存得当,以避免遗失或污染。

2. 筛选条件需要严格控制,确保所选出的突变体的稳定性和选择压力的可逆性。

3. 培养基的组成要根据不同的目标进行合理调配,以保证突变体的稳定性和生长情况。

4. 突变体的鉴定需要进行多种生化测试,以保证其具有目的性的变异和稳定的遗传特征。

紫外诱变筛选高效木质素降解菌株的研究随着人们对环境保护的要求越来越高，环境污染也成为了一个严重的问题。

木质素是造纸工业废水、生活污水、城市垃圾、农业废物和林业废弃物等生物质残渣中的主要成分，对水资源和环境造成很大的污染。

因此，研究木质素的高效降解机制和菌株，是解决木质素污染的重要途径之一。

本文旨在通过紫外诱变筛选高效木质素降解菌株，探究其降解机制，为解决木质素污染提供一定的理论指导和实践指导。

一、实验原理1.菌种：本实验选用的木质素降解菌株为白腐菌Trametes sp.，在常规培养基下培养并筛选。

2.诱变：通过紫外线照射，诱发白腐菌Trametes sp.的基因突变和突变体的产生。

3.筛选：将紫外线诱变后的白腐菌Trametes sp.转移到含木质素的固体培养基中，筛选木质素降解能力强的菌株。

4.鉴定：通过形态学、生理生化和分子生物学等多种方法对获得的菌株进行鉴定。

二、实验步骤1.白腐菌Trametes sp.的预处理：将白腐菌Trametes sp.预处理于常规培养基上，培养2-3天，并用生理生化方法鉴定其特性。

2.紫外诱变：将预处理的白腐菌Trametes sp.接种在固体VEG培养基中，分别用白炽灯、荧光灯和紫外线照射4h，10h和24h。

用各种灯光下的非照射组作为对照组。

3.筛选：将诱变后的白腐菌Trametes sp.转移到含木质素的固体培养基中，在37℃下静置，观察其生长情况和木质素的降解情况。

4.分离：在含木质素的固体培养基中，挑选降解效果较好的白腐菌Trametes sp.菌株进行单菌落分离。

5.鉴定：通过形态学、生理生化和分子生物学等方法鉴定单菌落的特性，并筛选出木质素降解能力强、生物学特性优良的菌株进行进一步研究。

三、实验结果1.诱变后的白腐菌Trametes sp.生长情况在不同光照下有明显差异。

其中以荧光灯照射24h的白腐菌生长情况较好，而荧光灯照射4h的白腐菌生长情况较差，且繁殖速度缓慢。

紫外诱变和氨基酸抗性筛选选育那西肽高产菌株秦艳飞;薛正莲;项驷文;李恒奎;王洲【摘要】目的筛选出那西肽高产菌株.方法以活跃链霉菌CB040517作为出发菌株,通过紫外-氧化锂诱变处理,并结合前体复合氨基酸抗性筛选,选育那西肽高产菌.结果通过致死率和正突变率的考察,确定紫外最佳诱变剂量为100s.在分离培养基上层加入氯化锂和底层加入复合氨基酸进行正突变株的定向筛选,选育得到那西肽高产菌株UV-19-A12,其摇瓶效价达904.00μg/mL,比出发菌株提高72.5%,经过五代斜面传代试验考察,该菌株遗传性状稳定.结论紫外诱变和氨基酸抗性筛选可以获得那西肽高产菌株.%Objective To screen out Streptonyces actuosu strains of high yield of nosiheptide.Methods UV mutagenesis and prosoma compound amino acids were used to screen high-yielding strains of nosiheptide directionly by using Streptomyces actuosu CB040517 as orginal strain.Results The results showed that the dose of UV irradiation was determined 100s in term of death rate and positive ing isolation medium with lithium chloride on the upper layer and compound amino acids on the bottom layer, a high-yield nosiheptide-producing strain named UV-19-A21 was obtained, whose shaking production arrived to 904μg/mL, increased by 72.5％ than the orginal strain, its character was satable after five generations.Conclusion The Streptomyces actuosu strains of high yield of nosiheptide could be obtained by UV mutagenesis and prosoma compound amino acids resistance screening.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2011(036)008【总页数】5页(P586-589,605)【关键词】活跃链霉菌;那西肽;紫外诱变;氨基酸抗性筛选【作者】秦艳飞;薛正莲;项驷文;李恒奎;王洲【作者单位】安徽工程大学生物与化学工程学院,微生物发酵安徼省工程技术研究中心,芜湖,241000;安徽工程大学生物与化学工程学院,微生物发酵安徼省工程技术研究中心,芜湖,241000;安徽工程大学生物与化学工程学院,微生物发酵安徼省工程技术研究中心,芜湖,241000;安徽工程大学生物与化学工程学院,微生物发酵安徼省工程技术研究中心,芜湖,241000;安徽工程大学生物与化学工程学院,微生物发酵安徼省工程技术研究中心,芜湖,241000【正文语种】中文【中图分类】R978.6那西肽是含硫多肽类抗生素，与硫链丝菌肽(thiostrepton)、盐屋霉素(siomycin)、硫肽霉素(thiopetin)属于同一类化合物[1]。

实验名称：抗药性突变株的获取和突变率测定姓名：学号：系别：实验日期：同组同学名单:本实验利用紫外线诱变，获得大肠杆菌的链霉素抗性突变株，学习了解微生物诱变育种的基本技术。

试验后，通过计算紫外照射造成的死亡率以及自发突变频率和诱导条件下突变频率，进一步加深对紫外诱导的认识。

【实验目的】1.掌握获取细菌自发和经诱变产生的突变株的基本方法。

2.了解突变株频率和突变率的计算。

3.了解微生物诱变育种的基本技术。

4.【实验材料】1.菌种大肠杆菌（E. coli）2.培养基及试剂牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、蒸馏水、链霉素（母液10 mg/mL；终浓度10 µg/mL）。

3.仪器及用具三角瓶（300 mL）、9 cm培养皿、6 cm培养皿、离心管（1.5 mL）、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、大头针、涂布器、酒精灯【实验方法及步骤】（一）出发菌株培养液的制备1. 取斜面或冻存菌种划平板，获得单克隆一个。

2. 取单克隆，37°C条件下在牛肉膏蛋白胨液体培养基培养8~24h；稀释培养液，取102 ~103 个细菌个体转移到新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基，过夜培养。

（二）培养基的制备倒牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（非选择性培养基），以及含有链霉素的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（选择性培养基平板；链霉素终浓度10 µg/mL，在倒平板前加入到培养基中）（三）自发突变的测定取过夜培养液，稀释106倍（用1.5mL离心管装0.99mL 无菌蒸馏水，将10 µL 培养液加入到0.99 mL蒸馏水，震荡或吹打混匀，连续三次），取100µL 涂布在非100µL涂布在选择性培养基平板上。

（四）诱导突变以及测定1. 紫外灯预热20 min。

2. 紫外照射：2 mL细菌培养液放入带有搅拌子的培养皿（6 cm），放置在紫外灯下方的磁力搅拌器上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，处理15s，盖上皿盖，关闭搅拌和紫外灯。

紫外诱变及其突变株的性能测试1材料与方法1.1材料菌种：四铃啤酒酵母仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。

培养基：麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。

（麦芽汁由四铃啤酒厂提供）1.2试验方法1.2.1酵母菌的活化取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养，于28℃恒温培养箱培养14h，得到正常生长阶段的酿酒酵母菌悬液。

然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采用28℃恒温培养14h，得到完全活化的正常生长的酵母菌。

1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定1.2.2.1菌悬液的制备取1OmL菌液离心收集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于1OmL生理盐水中，制得菌悬液。

取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中，摇匀，130r/min振荡培养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养结束用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦芽汁培养液为对比，根据所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。

（此图视为参考）1.2.3紫外线诱变试验用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度达到lx106个／mL。

(此处菌悬液浓度的确定采用三种方法：1.显微镜直接计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法)备注：平板直接计数法：如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落，且培养周期长，耗时多，工作量大，但是也是我们的强项，可以锻炼大一的动手能力。

2：显微镜直接计数法：比较直观，我们可以直接显微观察，多人工作计数。

耗时较短，且工作量较小，并且我系其他实验组采用此方法计数，可供参考。

3：光电比浊法：虽然绘制标准曲线要求较高，但是工作量较小，且一次绘制好标准曲线好后，以后可以用，准确率较高。

比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，可以校正方案。

实验步骤：打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳定。