下载文档原格式
宏基因组测序技术检测方法首先，宏基因组测序技术的样品采集非常重要，需要选择适当的采样策略和方法。
采样点的选择应考虑生态系统的多样性和复杂性，同时要确保采样点的代表性和一致性，以便更准确的反映生态系统的特征。
其次，样品处理是宏基因组测序技术中的关键步骤之一、样品处理的目的是去除样品中的非目标DNA，并增加细菌和古菌的DNA含量。
常用的样品处理方法包括滤网富集、密度梯度离心和聚合酶链反应（PCR）等。
在DNA提取过程中，需要先将样品中的DNA分离出来。
DNA提取的方法有许多种，可以选择适合的方法根据不同的样品类型和目标物种。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿提取法、商用DNA提取试剂盒等。
在DNA提取后，需要进行文库构建。
文库构建是将DNA片段添加接头序列，并通过PCR放大，生成可以进行测序的文库。
文库构建的方法有多种，常用的包括文库制备试剂盒和自制接头序列等。
完成文库构建后，接下来是测序步骤。
目前宏基因组测序常用的技术是高通量测序技术，常见的有Illumina MiSeq、Illumina HiSeq和PacBio等。
不同的测序技术具有不同的优缺点，可以根据实验需求选择合适的测序技术。
最后是数据分析。
宏基因组测序获得的数据量庞大，需要进行有效的数据分析来获取有价值的信息。
数据分析可以包括序列质控、序列拼接、OTU聚类、物种注释、功能预测等。
数据分析的方法有多种，可以使用开源软件如QIIME和Mothur等，也可以使用商业软件如RDP和MetaPhlan 等。
总体而言，宏基因组测序技术的检测方法包括样品采集、样品处理、DNA提取、文库构建、测序和数据分析等步骤。
这些步骤需要结合具体的实验目的和实验条件来选择和调整，以保证获得准确、可靠和有意义的结果。
宏基因组测序技术的发展将为生物学、生态学和环境研究等领域提供更深入和全面的研究手段，推动相关领域的快速发展。
宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
最新：宏基因组二代测序技术在血液病患者感染病原诊断中的应用中国专家共识01.血液病患者感染临床送检mNGS适应证注,特殊样本包括组织.竹的、穿刺液.支气管肺泡液洗液等无菌来源或不易小夏获取的样本图1血液病患者病原宏基因组二代测序（mNGS）送检流程图1 .中性粒细胞缺乏（粒缺）伴发热【共识2］低危且无明显感染灶的患者，如经抗菌药物治疗≥7d未明显好转可考虑在送检血培养的同时送检外周血标本mNGS;高危患者初始经验性治疗72~96h无效时，推荐送检传统微生物学检测的同时送检血液mNGS o2 .血流感染(BSI)【共识3］疑似BS1患者，在留取血培养标本的同时留取血浆样本，于-80。
C暂存;如72h内血培养阴性且抗感染治疗无改善的患者，推荐将留存样本进行mNGS o疑似脓毒症的重症患者，建议送检血培养同时送检血mNGS o3 .下呼吸道感染【共识4］下呼吸道感染患者首选支气管肺泡灌洗液(BA1F)送检传统微生物学检测，难以进行支气管肺泡灌洗的患者，可以选择深部痰进行检测，并同时留取标本冻存。
如抗感染治疗≥72h感染症状无好转或影像学表现持续加重的患者，建议送检留存标本行mNGS检测。
如为重症下呼吸道感染或有快速进展为重症的危险因素患者，建议同时送检传统微生物学检测及mNGS o鉴于血液病患者肺部感染病原谱广，部分病原难以培养或传统检测不能覆盖，且混合感染常见，推荐对于经验性抗感染治疗无效及重症下呼吸道感染患者在完善传统微生物学检测的同时，采用BA1FmNGS进行病原诊断。
血液mNGS对于下呼吸道感染病原诊断效果局限。
4 .中枢神经系统感染(CNSI)【共识5］疑似CNSI,推荐脑脊液在送检传统微生物学检测的同时送检mNGS,在流程上建议选择DNA检测，仅在考虑RNA病毒感染时完善RNA 检测流程。
CNS1时外周血与脑脊液病原分离现象(脑脊液存在感染病原，而外周血不能检出)并不少见。
因此，对于疑似CNS1患者，不推荐外周血作为替代样本进行mNGS检测。
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案是一种用于研究病原微生物群落内基因组的技术方法。
它通过测序病原体样本中的DNA或RNA，生成大量的测序数据，并利用生物信息学分析方法来解析样本中存在的病原体群落。
该实验方案的实施步骤如下：
1. 样品采集与制备：首先，需要从疾病患者或环境中收集病原体样品。
样品可
以是血液、组织、粪便等。
接下来，需要对样品进行处理，包括提取DNA或RNA，并进行质量检测。
2. 文库构建：经过样品制备后，将提取得到的DNA或RNA进行文库构建。
这一步骤包括DNA片段化、连接测序引物、PCR扩增等。
构建好的文库将被用于下
一步的测序。
3. 测序：使用高通量测序技术，如Illumina测序平台，对构建好的文库进行测序。
该步骤将产生数百万条短读长序列，形成所谓的测序数据。
4. 数据分析：测序完成后，需要对产生的测序数据进行生物信息学分析。
这一
步骤包括序列拼接、质控、去除人类宿主序列、物种注释等。
通过这些分析方法，可以得到病原体群落的基因组组成和功能特征。
5. 结果解释和研究：最后，根据数据分析结果，可以解释病原体群落的组成和
特征。
这对于研究病原体的致病机制、药物抗性等具有重要意义。
病原宏基因组测序实验方案为研究者提供了一种全面了解病原体群落结构和功
能的方法。
它可以用于研究不同疾病的病原微生物组成，探究其与疾病发生发展的关系，并为疾病的预防、诊断和治疗提供重要依据。
同时，这一技术方法也有助于了解病原体的毒力机制、耐药性乃至新病原体的发现。
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法空气中的病原微生物是引起呼吸道感染等疾病的主要传播源之一。
传统的病原微生物检测方法需要分离纯化以后进行鉴定，耗时且存在一定的局限性。
而病原微生物宏基因组测序技术的发展为快速、准确地鉴定空气中的病原微生物提供了新的方法。
病原微生物宏基因组测序是通过对空气中微生物的DNA进行高通量测序，利用得到的DNA序列信息进行微生物的鉴定和分类。
该技术可以检测到空气中的各类微生物，包括细菌、真菌、病毒等，并能够对它们的种属、数量和功能进行分析。
病原微生物宏基因组测序鉴定方法的具体步骤如下：1. 样品采集：通过空气采样器将空气中的微生物收集到培养基或滤膜上。
采集的样品可根据需要选择特定的时间段和空间位置，如医院、实验室或公共场所。
2. DNA提取：对采集到的微生物样品进行DNA提取，将微生物DNA 纯化并浓缩，以便后续的测序分析。
常用的DNA提取方法包括化学法、机械法和磁珠法等。
3. 文库构建：将提取到的微生物DNA进行文库构建，即将DNA片段连接到测序适配体上。
文库构建的方法有多种，如PCR扩增、转座子测序等。
4. 高通量测序：将构建好的微生物DNA文库进行高通量测序，目前常用的测序技术包括Illumina测序、PacBio测序和IonTorrent测序等。
高通量测序可产生大量的DNA序列数据，用于后续的分析和比对。
5. 数据分析：通过对测序得到的DNA序列数据进行分析，包括序列比对、物种注释、功能注释等。
常用的分析工具有QIIME、mothur、MG-RAST等。
分析结果可以得到微生物的种属信息、相对丰度以及功能特征等。
病原微生物宏基因组测序鉴定方法的优势在于其高通量、快速、准确的特点。
相比传统的培养方法，宏基因组测序可以检测到更多种类的微生物，并能够对微生物的功能进行分析。
此外，宏基因组测序还可以检测到低浓度的微生物，具有更高的灵敏度。
病原微生物宏基因组测序鉴定方法在医学、生物安全等领域具有广泛的应用前景。
宏基因组测序的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!宏基因组测序流程。
1. 样品采集和DNA提取。
从目标环境中采集样品，例如土壤、水或动物肠道。
简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。
送检mNGS宏基因组二代测序报告情况、标本类型、送检保存要求、标本运输要求、测序情况、内容解释、微生物致病概率分级及解读宏基因组二代测序(mNGS) 是基于核酸检测的微生物鉴定技术其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。
下呼吸道感染主要包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之mNGS 技术本身存在的局限性，mNGS 诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理解读。
需送检mNGS情况(1) 免疫抑制宿主疑似发生LRTI 且临床表现提示非CAP 常见病原微生物所致者；(2) LRTI 患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；LRTI 经规范经验性抗感染治疗48—72 h 后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者；(3) 聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的LRTI；有特殊病史且经验性治疗无效，病情较为严重的LRTI；临床考虑特殊病原体(感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时；(4) 患者有LRTI 症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致，可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS 以帮助鉴别诊断。
不建议送检 mNGS情况(1) 免疫功能健全宿主罹患LRTI（包括重症肺炎)，经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转；(2) LRTI 已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效；(3) 无法获取优质标本。
mNGS 标本类型在LRTI 的病原微生物诊断中，可用于mNGS 检测的标本包括痰(含诱导痰)、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（BALF）、经支气管肺活检（TBLB）标本、经支气管内超声（EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等。
国家标准《环境微生物宏基因组检测高通量测序法》编制说明（一）工作简况1、任务来源随着高通量测序技术的快速发展，对环境微生物的研究已经摆脱了对于微生物培养技术的依赖，进入了大数据，高通量的领域。
随着人们对环境微生物认识的不断加深，在环境监测、治理，工、农业生产及健康评估、疾病诊断等领域，微生物的重要性正在不断凸显。
而环境微生物的检测，即对环境中微生物的种类与丰度进行定性、定量，则是所有科学研究与实践应用的基础，直接关系着科研结果的可信度与生产应用的可靠性。
尽管基于高通量测序的环境微生物检测如此重要，但目前国内却始终没有相对应的标准出台。
复杂的环境微生物群落，不规范的检测方法，极易造成数据的混乱及结论、结果的矛盾，严重影响了这一先进技术在各领域的推广和应用。
在此背景下，本标准开始酝酿萌芽。
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC 387）提出并归口。
根据国标委综合〔2018〕83号文件《国家标准化管理委员会关于下达2018年第四批推荐性国家标准计划的通知》，正式确认立项，本项目计划编号为20184468-T-469 ，名称为环境微生物宏基因组检测高通量测序法，计划在2020年完成。
本标准负责起草单位：深圳华大生命科学研究院。
本标准参加起草单位：深圳华大基因科技有限公司、深圳基因产学研资联盟、中国测试技术研究院、深圳华大临床检验中心。
本标准主要起草人：陈冰、肖亮、钟焕姿、贾慧珏、李俊桦、姜华艳、李倩一、吴昊、李陶莎、唐美芳、钟宏彬、周媛。
2、目的和意义本标准从样品采集，保存与运输，实验室处理到数据产出等方面给出了较为明确的要求，规定了基于高通量测序技术检测微生物的方法，适用于使用高通量测序技术，利用宏基因组学方法进行环境微生物检测和鉴定分析的机构。
这一标准的建立和普及能够使得基于高通量测序的环境微生物检测技术流程做到规范化、统一化，进而在样本的可靠度和产出数据的通用性方面有显著的提升。
同时，这一标准的推广和实施，能够使得高通量测序技术的应用领域得到极大拓展，让环境、农业、健康等涉及微生物检测的各个行业有更统一和顺畅的评估、交流语境，并有力的推动这些行业的发展，从病原菌的检测，环境检测到疾病的诊断、分型，甚至是疾病状态的预测和干预，本检测技术都能发挥巨大的作用，为全民健康及工农业技术进步提供有力的保障和支持，促进科研及相关领域经济的发展。
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序（metagenomics sequencing）是一种用于研究微生物群落组成和功能的技术。
它通过对环境样本中的DNA进行高通量测序，可以获取到微生物群落的整个基因组信息，包括群落中各种微生物的组成、丰度以及功能特征。
首先是样品采集。
宏基因组测序可以应用于各种环境样品，包括土壤、水体、肠道、皮肤等。
样品采集时需要注意避免污染，并选择适当的采集方法和样品保存条件，以确保得到代表性的样品。
其次是DNA提取。
由于微生物在环境中通常以微量存在，所以需要进行DNA提取以获取足够的DNA样本。
提取方法通常使用商业化的DNA提取试剂盒，其原理大致相同：首先破解细胞壁和细胞膜，释放DNA，并经过一系列的沉淀和洗涤步骤，最终得到纯化的DNA。
然后是测序。
宏基因组测序技术常用的测序平台包括Illumina HiSeq，PacBio SMRT和Oxford Nanopore等。
其中Illumina HiSeq平台是目前最为广泛应用的测序平台。
测序时将建好的文库片段与测序芯片上的测序引物配对，通过不同的测序方法（如合成DNA链延伸和荧光信号检测等）获取DNA片段的序列信息。
最后是数据分析。
宏基因组测序所得到的海量数据需要进行生物信息学分析，以解读数据中的信息。
数据分析包括序列质量控制、去除主机DNA、去除低质量序列、进行序列拼接和比对、物种分类和功能注释等。
其中物种分类可以使用16S或18SrRNA基因序列进行，功能注释可以使用基因数据库进行。
通过这些分析，可以获取样品中各种微生物的组成和丰度，并了解其功能特征。
总结来说，宏基因组测序技术的检测方法包括样品采集、DNA提取、建库、测序和数据分析等几个重要步骤。
这些步骤通常需要借助一系列的实验方法和设备来完成。
宏基因组测序技术的快速发展，为我们深入了解微生物群落提供了有力的工具，也为环境保护、农业生产、医学研究等领域提供了更加准确、细致的数据支持。
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组（Metage nome）（也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome,或元基因组）。
是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature", 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学（或元基因组学，metagenomics）就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组DNA,进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组（Metage nome）（也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome,或元基因组）。
是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature", 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学（或元基因组学，metagenomics）就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组测序结题报告项目名称:XXXXXX客户单位:XXXXXX报告单位:XXXXXX报告日期:XXXXXX目录一、项目信息 (1)二、项目流程 (2)2.1 项目执行流程 (2)2.1.1 DNA提取及检测 (2)2.1.2 文库构建及质检 (2)2.1.3 Hiseq测序 (2)2.2 生物信息分析流程 (3)2.3 项目分析内容 (4)三、项目结果报告 (5)3.1 测序数据预处理 (5)3.1.1 测序数据过滤与拼接 (5)3.2 基因预测及丰度分析 (6)3.2.1 基因预测 (6)3.2.2 非冗余基因集的构建 (7)3.2.3 Core-pan基因分析 (8)3.2.4 基因数目差异分析 (9)3.3 物种注释分析 (11)3.3.1 物种注释 (11)3.3.2 物种相对丰度 (13)3.3.3 优势物种分析 (15)3.4 功能注释分析 (16)3.4.1 eggNOG功能注释 (16)3.4.2 KEGG注释 (17)3.4.3 基于CAZy数据库功能注释（高级分析） (19)3.4.4 基于ARDB数据库功能注释（高级分析） (21)3.5组间差异显著性分析 (23)3.5.1 PCA分析 (23)3.5.2 Anosim分析 (24)3.5.3 NMDS分析（高级分析） (25)3.5.4 PCoA分析 (26)3.5.5 Test (27)3.5.6 STAMP差异分析（高级分析） (29)3.5.7 LEfSe分析 (30)3.5.8 Random forest分析（高级分析） (31)3.6 环境因子关联分析 (33)3.6.1 RDA/CCA分析 (33)3.6.2 Cytoscape网络分析（高级分析） (34)四、参考文献 (35)一、项目信息二、项目流程2.1 项目执行流程2.1.1 DNA提取及检测基因组DNA提取采用公司自主研发的meta提取流程完成，其中微生物细胞破碎采用了玻璃珠研磨结合化学裂解及酶解等方法，最大程度的还原微生物的组成。
宏基因组测序技术
检测方法
宏基因组测序技术检测标准
简介：
宏基因组测序介绍
宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，经过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就能够直接对环境中所有微生物进行测序。
能够真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
当前又能够分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序
16sDNA是最常见的微生物物种分子鉴定的标签，，经过对样品中16sDNA测序能够鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
当前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，能够很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序
在这种测序方式中，我们能够假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就能够研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
能够发现新的基因，能够进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
另外，该项测序不单能够针对DNA水平，也能够针对全RNA进行基因表示水平的研究。
样品处理：
宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：
宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0， 260/230 = 1.8-2.0，电泳检测DNA应是完整的一条带。
测序Sequencing
1)16S/18S测序：
Sanger测序：
用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先经过PCR将16S/18S序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导
入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。
由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现一般见做二代测序结果的验证。
454 Platform：
454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。
454 GS FLX+ System测序读长能够达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。
文库构建：
用fusion Primer扩增核糖体RNA，将已扩增的rRNA直接做乳液PCR，在GS FLX+ 和GS Junior系统上进行测序。
测序深度：
数据分析：
使用免费的软件包对微生物的种群多样性进行鉴定，并进行比较。
1.MEGAN：一个宏基因组分析工具，能够在大量的测序数据中对
测序结果进行聚类分析。
2.MG-RAST：用于注释宏基因组样品的全自动软件。
3.IMG/M：基于宏基因组序列微生物群体的功能性。
4.CAMERA：致力于微生物生态学研究。
5.CARMA：能够经过未拼接的序列来进行物种组成和微生物的遗
传潜力的研究。
6.GALAXY：用于高等真核生物的研究，例如昆虫等。
7.Greengenes：16S rRNA的数据库，能够用来做16S rRNA的比
对。
8.QIIME：针对454测序数据的宏基因组分析。
9.The Ribosome Database Project（RDP）：针对焦磷酸测序的
分析方法。
Miseq Platform：
Miseq平台读长能够是2X250bp或2X300bp。
使用Miseq Reagent Kit V2能够产出7.5-8.5Gb的数据，使用Miseq Reagent Kit V3能够产出13.2-15Gb的数据。
