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完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
宏基因组测序技术检测方法首先，宏基因组测序技术的样品采集非常重要，需要选择适当的采样策略和方法。
采样点的选择应考虑生态系统的多样性和复杂性，同时要确保采样点的代表性和一致性，以便更准确的反映生态系统的特征。
其次，样品处理是宏基因组测序技术中的关键步骤之一、样品处理的目的是去除样品中的非目标DNA，并增加细菌和古菌的DNA含量。
常用的样品处理方法包括滤网富集、密度梯度离心和聚合酶链反应（PCR）等。
在DNA提取过程中，需要先将样品中的DNA分离出来。
DNA提取的方法有许多种，可以选择适合的方法根据不同的样品类型和目标物种。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿提取法、商用DNA提取试剂盒等。
在DNA提取后，需要进行文库构建。
文库构建是将DNA片段添加接头序列，并通过PCR放大，生成可以进行测序的文库。
文库构建的方法有多种，常用的包括文库制备试剂盒和自制接头序列等。
完成文库构建后，接下来是测序步骤。
目前宏基因组测序常用的技术是高通量测序技术，常见的有Illumina MiSeq、Illumina HiSeq和PacBio等。
不同的测序技术具有不同的优缺点，可以根据实验需求选择合适的测序技术。
最后是数据分析。
宏基因组测序获得的数据量庞大，需要进行有效的数据分析来获取有价值的信息。
数据分析可以包括序列质控、序列拼接、OTU聚类、物种注释、功能预测等。
数据分析的方法有多种，可以使用开源软件如QIIME和Mothur等，也可以使用商业软件如RDP和MetaPhlan 等。
总体而言，宏基因组测序技术的检测方法包括样品采集、样品处理、DNA提取、文库构建、测序和数据分析等步骤。
这些步骤需要结合具体的实验目的和实验条件来选择和调整，以保证获得准确、可靠和有意义的结果。
宏基因组测序技术的发展将为生物学、生态学和环境研究等领域提供更深入和全面的研究手段，推动相关领域的快速发展。
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组分析流程宏基因组分析是一种用来研究微生物群落的方法，它通过对微生物群落的DNA进行测序，以及后续的数据处理和分析，来了解微生物群落的组成和功能。
宏基因组分析流程一般包括以下几个步骤：采样、DNA提取、测序、数据预处理、生物信息学分析和结果解读等。
首先，采样是宏基因组分析的第一步。
采样要注意代表性，可以选择不同环境样品来进行比较和研究。
例如，可以采集不同土壤样品、水样、肠道样品等，以获得不同地理位置、不同物种群落和不同物理化学环境下的微生物样品。
第二步是DNA提取，它是宏基因组分析的基础步骤。
DNA提取是从采样物中提取出微生物DNA的过程。
由于微生物的特点是数量少，与宿主DNA、细胞碎片等杂质混合，所以DNA提取的方法要注意高效、纯度高，并且能够获得足够的DNA浓度。
第三步是测序。
测序是宏基因组分析的关键步骤。
常用的宏基因组测序方法有Illumina HiSeq和MiSeq等，也有传统的Sanger测序方法。
Illumina HiSeq和MiSeq等高通量测序技术能够产生大量高质量的短序列片段，对于宏基因组分析来说是非常有效和经济的方法。
第四步是数据预处理。
宏基因组测序产生的数据量非常大，需要进行数据预处理和质量控制，以去除噪声和低质量的序列片段。
这一步包括质量过滤、去除接头、去除低质量片段和短片段等。
数据预处理还包括序列拼接，将多个片段拼接成更长的序列以得到更好的基因组组装。
第五步是生物信息学分析。
生物信息学分析包括序列比对、基因组组装、物种注释、功能注释等。
序列比对是将测序后的序列片段与参考基因组比对，以确定片段的起源。
基因组组装是将拼接后的序列片段组装成完整的基因组。
物种注释是将基因组中的序列与已知的物种进行比对，以确定微生物群落的组成。
功能注释是将基因组中的序列与已知的功能数据库比对，以确定微生物群落的功能。
最后一步是结果解读。
根据宏基因组分析的结果，可以了解微生物群落的组成和功能。
宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组三代测序原理
宏基因组三代测序技术是指单分子测序技术，对于DNA 样本不需要经过PCR 扩增，实现了对每一条DNA 分子的单独测序。
其基本原理为：当DNA 模板被聚合酶捕获后，4 种不同荧光标记的dNTP 通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合，与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间。
因此统计荧光信号存在时间的长短，可区分匹配的碱基与游离碱基。
通过统计4 种荧光信号与时间的关系，即可测定DNA 模板序列。
宏基因组三代测序技术在针对二代测序范围外的复杂基因突变类型进行测序方面具有独特优势，可用于肠道微生物研究等领域。
宏基因组测序原理宏基因组测序是一种用于分析微生物群落中所有微生物的基因组信息的技术。
在过去的几十年里，宏基因组测序技术已经取得了长足的进步，成为了研究微生物生态系统的重要工具。
它可以帮助科学家们更好地理解微生物在自然环境中的分布、功能和相互作用，对环境保护、医学和工业等领域具有重要意义。
宏基因组测序的原理主要包括样品采集、DNA提取、DNA文库构建、高通量测序和生物信息学分析等几个步骤。
首先，样品采集是宏基因组测序的第一步。
在采集样品时，需要考虑到样品的来源、保存条件和采集方法等因素，以确保获得的样品能够准确地反映微生物群落的真实情况。
其次，DNA提取是宏基因组测序的关键步骤之一。
通过DNA提取，可以从样品中提取出微生物的总DNA，为后续的文库构建和测序分析奠定基础。
接下来，DNA文库构建是宏基因组测序的重要环节。
在文库构建过程中，需要将提取得到的DNA样品进行裂解、末端修复、连接适配体、文库扩增等多个步骤，最终构建成适合高通量测序的文库。
然后，高通量测序是宏基因组测序的核心技术之一。
通过高通量测序，可以对文库中的DNA进行大规模、高效率的测序，获得大量的序列数据。
最后，生物信息学分析是宏基因组测序的最后一步。
通过生物信息学分析，可以对测序获得的数据进行序列拼接、物种注释、功能预测等多方面的分析，从而获得微生物群落的组成结构、功能特征等信息。
总的来说，宏基因组测序是一种综合性的技术，需要多个步骤的有机配合才能完成。
它的原理简单清晰，但在实际操作中需要科学家们高度的技术功底和丰富的实践经验。
随着技术的不断进步，相信宏基因组测序技术将会在微生物生态学、环境科学、医学和工业等领域发挥越来越重要的作用。
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1. 样品采集和DNA提取。
从目标环境中采集样品，例如土壤、水或动物肠道。
宏基因组技术路线主要分为4个步骤:
环境中微生物群体总DNA的提取、宏基因组文库的构建、序列测定及分析、功能基因的筛选鉴定。
总DNA的提取主要分为
原位裂解法和异位裂解法两种方法。
原位裂解法利用酶以及其它一些可以破碎细胞的化学物质直接将样品中的微生物破碎后提取环境样品中的DNA。
缺点：该法在高效提取基因组DNA的同时,也伴随着污染物的增加,而对后续PCR反应等实验结果产生干扰;
异位裂解法是先用物理方法将微生物从环境样品中分离出来,然后再抽提DNA,该法虽然减少了污染。
缺点：在分离细胞的过程中可能会造成细胞的丢失,从而使提取的DNA不能很好的代表环境中的微生物多样性。
宏基因组文库的构建分为2类
一类是以分析环境中的微生物多样性为目的而构建的16S rDNA文库,通过测定环境样品中的核糖体RNA,通过序列比对、系统进化分析,是目前研究环境生物多样性的最有效手段
另一类是以筛选功能基因为目的的宏基因组文库。
功能基因的筛选:
主要有2种方法:一是基于序列分析的方法;二是基于功能鉴
定的方法。
基于序列分析的方法是对文库中的DNA进行测序分析,从而对特定环境中微生物多样性和功能进行研究,该法较为简便,但受限
于已发现基因,很难发现一些新基因,在新化合物的筛选上具有很大的局限性,一般作为功能鉴定的辅助研究手段;
基于功能鉴定的方法是将功能基因整合进外源宿主,利用重组克隆产生的新活性物质进行筛选,可用于筛选新基因或一些具有潜在应用价值的基因。
通常是两法须同时使用,相互补充,提高筛选效率。
宏基因组和16s的测序原理嘿呀，宝子，今天咱们来唠唠宏基因组测序原理哈。
宏基因组呢，简单来说，就是直接从环境样本里提取所有微生物的基因组DNA。
这就像是把一个超级复杂的微生物小社会里，每个成员的基因密码本都一股脑儿地拿出来。
你想啊，环境里的微生物那可太多样啦，土壤里、水里、咱们肠道里，到处都是。
宏基因组测序就像是给这个微生物大杂烩做一个超级全面的基因普查。
那它具体咋做呢？咱先得从样本采集开始。
比如说要研究土壤里的微生物宏基因组，就像个小探险家一样，去挖一点土回来。
这个土可不得了，里面藏着数不清的微生物呢。
然后呢，就要把这些微生物的基因组DNA提取出来。
这就有点像从一个装满宝藏的大箱子里，把那些闪闪发光的基因宝石挑出来。
这个过程可不容易，因为微生物种类太多了，它们的细胞结构啥的也不一样，得想办法把所有的DNA都完好无损地弄出来。
提取到DNA之后，就要进行测序啦。
现在常用的测序技术就像是一个超级精密的基因扫描仪。
它会把DNA分子切成一小段一小段的，然后一个一个地读取这些小片段上的碱基序列。
这个过程就像是把一本超级厚的基因大书，拆成一页一页的小纸条，然后仔细地看每张小纸条上写的字。
测序的结果就是得到了海量的DNA小片段序列信息。
但是呢，这还没完事儿。
得到这些小片段序列后，就像拼拼图一样，得把它们重新组合起来。
因为这些小片段原本是来自整个微生物群落的基因组的。
这时候就需要一些超级厉害的计算机算法啦。
这些算法就像是一群超级聪明的小助手，它们会根据片段之间的重叠部分，把这些小片段一点点地拼接成完整的或者接近完整的基因组序列。
这就好比把那些散落一地的拼图碎片，按照形状和图案重新拼成一幅幅完整的图画。
宏基因组测序的好处可多啦。
它能让我们知道一个环境里到底有哪些微生物在生活，它们都有啥本事。
比如说在肠道微生物研究里，通过宏基因组测序，我们就能发现哪些微生物和我们的健康有关系，是让我们不容易生病呢，还是可能会让我们肚子不舒服。
简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。
微生物测序是一种用于分析微生物群落组成、识别未知微生物、研究微生物遗传变异和功能基因组学的技术。
以下是常用的微生物测序方法：1.基于16S/18S rRNA基因测序：o这是最常用的方法，针对细菌的16S rRNA基因和真菌的18S rRNA 基因或ITS区域进行测序。
这些区域在不同微生物之间存在足够多的变异，可以用来区分不同的种属，同时又有足够的保守性以便设计通用引物。
通过高通量测序（如Illumina平台）获取大量样本中的rRNA基因片段，并通过比对已知数据库分析微生物群落的组成和多样性。
2.宏基因组测序（Metagenomics）：o宏基因组测序直接提取环境样本或生物体内的所有基因组DNA进行测序，无需分离培养单个微生物。
通过分析所得序列数据，可以推断微生物的种群结构、功能基因和代谢途径。
3.扩增子测序：o对目标微生物基因组的特定区域（如V1-V9区域的16S rRNA基因）进行PCR扩增后进行高通量测序，以此获得微生物组成的详细信息。
4.全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）：o对单个微生物进行全基因组测序，可以得到该微生物完整的DNA序列信息，用于深入研究其基因组结构、进化关系、毒力因子、抗生素抗性基因等方面。
5.转录组测序（Transcriptomics）：o测定微生物细胞内mRNA的表达水平，揭示微生物在特定条件下的活性基因和功能状态。
6.单细胞测序（Single-cell sequencing）：o对单一微生物细胞进行基因组或转录组测序，适用于复杂微生物群落中稀有物种的鉴定和功能研究。
7.CRISPR阵列测序：o分析微生物中CRISPR系统的重复序列，用于追踪微生物与其环境相互作用的历史和感染历史。
样本准备对于微生物测序至关重要，包括样品采集、存储、DNA/RNA提取、文库构建等一系列步骤。
随着测序技术和生物信息学方法的进步，微生物测序已经成为研究微生物生态、疾病关联、工业发酵优化等领域的重要工具。
肺泡灌洗样本进行宏基因组测序的注意事项和研究方法肺泡灌洗液样本宏基因组测序在临床诊断和研究中具有重要意义。
本文详细介绍了进行泡灌洗液样本宏基因组测序的注意事项，包括样本的采集、运输、处理和测序，以及相关生物信息学分析方法，旨在为临床医生和研究人员提供实用的指南。
一、随着测序技术的发展，宏基因组测序在感染性疾病诊断、肿瘤研究、遗传病筛查等领域发挥着越来越重要的作用。
肺灌洗液样本（BALF）是一种重要的生物样本，可反映肺部的病理变化和微生物感染情况。
将宏基因组测序应用于肺泡灌洗液样本，可以全面揭示样本中的微生物多样性和功能，为临床诊断和治疗提供新的思路。
然而，在进行肺泡灌洗液样本宏基因组测序的过程中，有许多注意事项需要遵循，以确保测序结果的准确性和可靠性。
二、肺泡灌洗液样本的采集与运输1. 样本采集：肺泡灌洗液的采集应遵循严格的操作规范，确保样本的质量。
患者坐位，向肺泡内注入适量生理盐水，通过人工呼吸使生理盐水在肺泡内充分混合，然后通过气管插管将灌洗液抽出。
采集的肺泡灌洗液应迅速转入无菌容器中，并避免剧烈震荡，以保持样本的原始状态。
2. 样本运输：肺泡灌洗液样本应尽快进行测序，以避免微生物的代谢活动和样本的降解。
若不能立即测序，应将置于-80℃冰箱中保存，以保持样本的稳定性。
在运输过程中，应注意防止样本的污染和冻融。
三、肺泡灌洗液样本的处理1. 样本的预处理：将肺泡灌洗液样本进行梯度稀释，以降低微生物的浓度，避免测序过程中的生物抑制现象。
预处理后的样本可进行后续的DNA提取。
2. DNA提取：选用适合肺泡灌洗液样本的提取试剂盒，按照说明书进行操作。
提取过程中，应注意避免样本的污染和DNA的降解。
3. DNA的质量评估：通过琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop 等方法对提取的DNA质量评估，确保DNA的完整性及无明显降解。
四、宏基因组测序1. 测序平台的选择：目前市面上有多种测序平台，如Illumina、PacBio和Oxford Nanopore等。
国家标准《环境微生物宏基因组检测高通量测序法》编制说明（一）工作简况1、任务来源随着高通量测序技术的快速发展，对环境微生物的研究已经摆脱了对于微生物培养技术的依赖，进入了大数据，高通量的领域。
随着人们对环境微生物认识的不断加深，在环境监测、治理，工、农业生产及健康评估、疾病诊断等领域，微生物的重要性正在不断凸显。
而环境微生物的检测，即对环境中微生物的种类与丰度进行定性、定量，则是所有科学研究与实践应用的基础，直接关系着科研结果的可信度与生产应用的可靠性。
尽管基于高通量测序的环境微生物检测如此重要，但目前国内却始终没有相对应的标准出台。
复杂的环境微生物群落，不规范的检测方法，极易造成数据的混乱及结论、结果的矛盾，严重影响了这一先进技术在各领域的推广和应用。
在此背景下，本标准开始酝酿萌芽。
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC 387）提出并归口。
根据国标委综合〔2018〕83号文件《国家标准化管理委员会关于下达2018年第四批推荐性国家标准计划的通知》，正式确认立项，本项目计划编号为20184468-T-469 ，名称为环境微生物宏基因组检测高通量测序法，计划在2020年完成。
本标准负责起草单位：深圳华大生命科学研究院。
本标准参加起草单位：深圳华大基因科技有限公司、深圳基因产学研资联盟、中国测试技术研究院、深圳华大临床检验中心。
本标准主要起草人：陈冰、肖亮、钟焕姿、贾慧珏、李俊桦、姜华艳、李倩一、吴昊、李陶莎、唐美芳、钟宏彬、周媛。
2、目的和意义本标准从样品采集，保存与运输，实验室处理到数据产出等方面给出了较为明确的要求，规定了基于高通量测序技术检测微生物的方法，适用于使用高通量测序技术，利用宏基因组学方法进行环境微生物检测和鉴定分析的机构。
这一标准的建立和普及能够使得基于高通量测序的环境微生物检测技术流程做到规范化、统一化，进而在样本的可靠度和产出数据的通用性方面有显著的提升。
同时，这一标准的推广和实施，能够使得高通量测序技术的应用领域得到极大拓展，让环境、农业、健康等涉及微生物检测的各个行业有更统一和顺畅的评估、交流语境，并有力的推动这些行业的发展，从病原菌的检测，环境检测到疾病的诊断、分型，甚至是疾病状态的预测和干预，本检测技术都能发挥巨大的作用，为全民健康及工农业技术进步提供有力的保障和支持，促进科研及相关领域经济的发展。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测标准
简介：
宏基因组测序介绍
宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s
DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序
16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序
在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：
宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：
宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0， 260/230 = 1.8-2.0，电泳检测DNA应是完整的一条带。
测序Sequencing
1)16S/18S测序：
Sanger测序：
用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。
由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验证。
454 Platform：
454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。
454 GS FLX+ System测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。
文库构建：
用fusion Primer扩增核糖体RNA，将已扩增的rRNA直接做乳液PCR，在GS FLX+ 和GS Junior系统上进行测序。
测序深度：
数据分析：
使用免费的软件包对微生物的种群多样性进行鉴定，并进行比较。
1.MEGAN：一个宏基因组分析工具，可以在大量的测序数据中对测序结果进行
聚类分析。
2.MG-RAST：用于注释宏基因组样品的全自动软件。
3.IMG/M：基于宏基因组序列微生物群体的功能性。
4.CAMERA：致力于微生物生态学研究。
5.CARMA：可以通过未拼接的序列来进行物种组成和微生物的遗传潜力的研究。
6.GALAXY：用于高等真核生物的研究，例如昆虫等。
7.Greengenes：16S rRNA的数据库，可以用来做16S rRNA的比对。
8.QIIME：针对454测序数据的宏基因组分析。
9.The Ribosome Database Project（RDP）：针对焦磷酸测序的分析方法。
Miseq Platform：
Miseq平台读长可以是2X250bp或2X300bp。
使用Miseq Reagent Kit V2可以产出7.5-8.5Gb的数据，使用Miseq Reagent Kit V3可以产出13.2-15Gb 的数据。
文库构建：
根据感兴趣的片段设计引物，通过PCR扩增出片段做为模板构建文库。
使用Nextera XT Sample Prep Kit构建文库，按照试剂盒说明书操作。
将建好的文库归一化处理并将其混到一起。
在Miseq系统里自动进行成簇反应，进而完成测序。
文库检验：
用Agilent 2100检测文库大小片段是否与预期一致。
文库片段是否集中。
测序深度：
16S rRNA测序深度应至少在50,000条reads以上，以保证较好的覆盖度。
数据分析：
对微生物生态进行定量观察
Greengenes：16S rRNA基因数据库和分析工具；
宏基因组分析工具：MEGAN
核糖体数据库计划(RDP)
Ion Torrent Platform：
Ion Torrent平台主要有两个测序系统：Ion PGM System和Ion Proton System。
Ion PGM有两种读长，200bp和400bp，Ion PGM主要应用三种芯片，
Ion 314 Chip，Ion 316 Chip和Ion 318 Chip，最多数据产出可以达到2Gb。
Ion Proton读长为200bp，最多数据产出可达到10Gb。
文库构建：
使用Ion Plus Fragment Library Kit为16S rRNA扩增产物加上barcode 标签，一共有96个barcode可以选择。
加上标签后使用Ion PGM™ Template OT2 200 Kit在Ion OneTouch™ DL System上进行乳液PCR，完成文库构建。
测序时根据需要不同的读长选择不同的测序试剂盒。
测序深度：
对于人体肠道微生物16S rRNA测序，对于检测高丰度的样品，每个样品至少要测10000条reads，而对于检测低丰度的样品，则需要1,000,000以上的reads数。
2)全宏基因组测序Whole-metagenomics Sequencing Roche 454 platform:
文库构建：
提取宏基因组DNA，总量不低于10ug，且样品DNA应相对完整。
使用GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit构建文库，按照说明书进行相应操作。
文库检验：
DNA reads数与微球的比例在8%左右，可以达到比较理想的测序结果。
测序深度：
每个样品应至少保证10,000条以上的reads数。
Hiseq platform:
Hiseq平台主要有Hiseq 2000和Hiseq 2500两个测序系统。
Hiseq 2000测序读长是2X100bp Paired-end测序，一次运行通量可达600Gb以上，Hiseq 2500有两种运行模式：快速运行和高通量，快速运行可以达到2X150bp，产生最多180Gb的数据，高通量读长在2X125bp，数据产出在600Gb以上。
文库构建：
将提取的宏基因组DNA用Covaris M220片段化后，使用Truseq DNA XT/LT
Sample Prep Kit (illumina)按照protocol进行文库构建，DNA起始投入量应在1ug以上。
文库检验：
将建好的宏基因组文库使用KAPA SYBR FAST ABI Prism 2X qPCR Master Mix (KAPA Biosystems) 试剂盒，利用ABI 7500荧光定量PCR仪，测定文库的浓度。
文库的浓度必须大于2nM。
使用DNA 1000分析试剂（Agilent），利用Agilent 2100生物分析仪分析文库的片段长度范围和质量。
文库片段的大小范围在目的大小区间内且相对集中。
测序深度：
每个样品应至少测3,100,000条reads以保证比较好的覆盖度。
