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一、实验目的1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。
3. 学会筛选和鉴定转化子。
二、实验原理质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。
通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。
本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）2. 受体菌：大肠杆菌DH5α3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。
（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。
（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。
（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。
（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。
（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。
（7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。
2. 筛选和鉴定转化子（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。
（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。
五、实验结果1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。
2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。
3. 阳性克隆PCR产物与预期相符，测序结果验证目的基因正确导入。
转化子筛选方法所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移,使受体细胞表现新的遗传性状。
将经转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体（transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。
一.a互补所谓基因内互补作用，在LacZ体系中，是指二个彼此互补的突变基因(突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β—半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X—gal(5-溴-4-氯—3-吲哚-β—D—半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴—4—氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。
然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多克隆位点后，就会阻断α序列的读码结构，使其编码的α肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成α-互补，因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。
根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。
此法又称蓝白筛选法。
二.杂交筛选该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。
将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。
菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板，它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。
因此，能够进行重复筛选，效率高,可靠性强,而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。
2。
斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来。
2）抽提纯化，蛋白质、杂DNA等减少，所以能得到更为确切的结果，既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。
3。
Southern blot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位于基因.三.插入失活根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。
3. 熟悉转化实验的基本流程，包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。
4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。
二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一，其原理主要包括以下几个方面：1. 基因克隆：通过酶切、连接等操作，将目的基因与载体连接起来，构建成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制、表达。
3. 筛选：通过选择性培养基和分子生物学方法，筛选出含有目的基因的转化子。
4. 鉴定：对筛选出的转化子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。
3. 细胞：感受态细胞（如大肠杆菌DH5α）。
4. 基因组DNA：目的基因片段和载体DNA。
四、实验步骤1. 目的基因片段的制备：采用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体DNA的制备：提取载体DNA，进行酶切处理。
3. 基因连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。
4. 转化：将连接产物转化感受态细胞。
5. 涂布培养：将转化后的细胞涂布在选择性培养基上，培养过夜。
6. 筛选：挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。
7. 鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。
五、实验结果与分析1. PCR检测结果：根据PCR检测结果，筛选出含有目的基因的转化子。
2. 酶切鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切，观察酶切图谱，确认重组质粒是否构建成功。
3. 序列鉴定：对酶切鉴定阳性的菌落进行测序，与目的基因序列进行比对，验证其是否正确。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒，并对其进行了鉴定。
一、实验目的1. 掌握细菌转化的基本原理和方法。
2. 熟悉电击法和热激法两种转化方法。
3. 学习如何筛选和鉴定转化子。
二、实验原理细菌转化是指将外源DNA分子导入细菌细胞内，使其获得新的遗传性状的过程。
转化过程包括：感受态细胞的制备、DNA分子的转化、转化子的筛选和鉴定。
三、实验材料1. 菌株：大肠杆菌DH5α感受态细胞。
2. 质粒载体：pUC19质粒。
3. 试剂：氯化钙（CaCl2）、无菌水、DNA分子量标准、琼脂糖、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker、LB培养基、抗生素（如氨苄青霉素）等。
4. 仪器：电击仪、电击杯、离心机、PCR仪、凝胶成像系统、培养箱等。
四、实验方法1. 感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5α感受态细胞接种于LB培养基，37℃培养过夜。
（2）取过夜培养的细菌，按1:100的比例加入无菌水，轻轻吹打混匀。
（3）将混匀的细菌溶液在冰浴中放置30分钟。
（4）4℃下以4000 r/min离心5分钟，弃上清。
（5）向沉淀中加入500 μL无菌水，轻轻吹打混匀。
（6）4℃下保存备用。
2. 电击转化（1）将pUC19质粒和感受态细胞按照1:1的比例混合，轻轻吹打混匀。
（2）将混合液转移到电击杯中。
（3）在电击仪上设置电压为2.5 kV，电容为25 μF，电阻为200 Ω。
（4）进行电击转化，时间约为5秒。
（5）将电击后的混合液立即加入到2 mL LB培养基中，混匀。
（6）37℃培养1小时。
3. 转化子筛选（1）将培养好的转化子涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上。
（2）37℃培养过夜。
（3）观察并记录菌落生长情况。
4. 转化子鉴定（1）取转化子菌落，提取质粒DNA。
（2）进行PCR扩增，检测质粒载体上的目的基因。
（3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
五、实验结果与分析1. 转化子筛选经过培养，观察到平板上出现了白色菌落，表明转化成功。
2. 转化子鉴定通过PCR扩增，观察到目的基因条带，说明转化子中含有目的基因。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要：以质粒pUC19作为载体、λDNA作为外源片段来源，限制性核酸内切酶Hin dⅢ分别对其进行单酶切，产生相同的黏性末端后用T4 DNA连接酶连接从而构建重组质粒，用CaCl2制备E.coli感受态细胞，并用热激法进行重组质粒的转化，培养并用α-互补筛选法进行筛选，最后用试剂盒提取质粒DNA进行检测。
根据在实验过程中所遇到的问题及对结果的分析，探讨关键步骤及影响转化/重组效率的相关因子，并说明实验过程中应当注意的问题。
关键词：DNA酶切连接感受态细胞转化重组子的筛选与鉴定引言：实验目的为掌握限制性核酸内切酶的分类、特性与作用原理以及对DNA进行酶切的实验技术，掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4 DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术，掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理和方法，掌握α-互补筛选法的原理，学习用试剂盒提取质粒DNA的方法，复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。
限制性核酸内切酶分为三类，Ⅰ型与Ⅲ型：识别位点与切割位点不一致，故同一种酶切产生的片段长度不同；Ⅱ型：固定的识别序列处切割，故每次都产生完全相同的片段。
影响限制性内切酶活性的因素有：DNA纯度，DNA甲基化程度，反应温度，DNA 的分子结构，缓冲液。
DNA连接酶在体内合成DNA某条链上丢失的磷酸二酯键，体外连接反应中，DNA连接酶则需要合成两个磷酸二酯键。
T4-DNA连接酶不需要PEG等就能进行平端的连接，所以实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。
影响DNA连接的因素有：温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备:1.挑取酵母单菌落,接种至含有５ml YPＤ培养基的50ml 三角瓶中，30℃、２50－300r ／min培养过夜;2．取100-5０0µl(≤1:100)的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200ｍＬ三角摇瓶中，28~30℃、250-30０r/ｍｉn培养过夜(约2０h),至ＯＤ60０达到１.3~1.5;3．将细胞培养物于４℃，1500g 离心５miｎ,用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；４.按步骤3 离心,用２5ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬５．按步骤3 离心,用２-5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；６. 按步骤３离心，用１60µl的冰预冷的1moｌ的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul;备注：可将其分装为８0 µl 一份的包装-70冷冻起来，２周之内使用,但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9Ｋ的载体转GＳ115一般先用MD平板初筛,然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G４１８抗性的YPＤ平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶ＢMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GＳ11５生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LＯX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Ｃｕ2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存:挑单克隆到YPD中培养1８-2４ｈ,然后取菌液以１:1加入30%灭菌甘油，-8０ｏC ul/管冻存（一般用10ｕｇ以上质粒用ＳalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，７０%乙醇洗一遍,约20ul ｄdH2O重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kｉt，回收的D ＮA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下:1）酶切体系(８０ul）中2倍体积的无水乙醇加1/1０体积的PH5.２NaAC,混匀ﻫ２）-20℃20分钟沉淀ﻫ３)1３2０0rpm,２0min,离心后弃上清ﻫ4）７5%乙醇3０0uｌ轻轻洗,同上离心５ｍin，弃上清5)３７度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。
实验十三转化子的鉴定一．原理采用煮沸法快速提取阳性克隆质粒DNA，对提取的DNA电泳鉴定对与设计大小一致的质粒DNA进行目的DNA片段PCR扩增，对扩增产物进行电泳．若扩增产物中出现特异条带，则可初步确定所得到的转化子力含目的基因的克隆。
(一)煮沸法快速提取质粒DNA1.取一张白纸，剪成培养皿大小，打上小格，每个小格标上号．贴在盛LB培养基的培养皿上。
将散落在转化培养皿上白色菌落(蘸色菌落中载体质粒一般未插入片段)，分别接种到每一小格中，37℃培养过夜。
2.用已灭菌的扁平牙签，按种编好号的白色苗落的细菌至相应编号的含氨苄青霉素的LB 液体培养基试管5ml／15ml中，于37℃剧烈振摇下培养过夜。
3.将1．5ml培养物倒人1．5ml微量离心管中，用微量离心机于4℃以12 000 r／min 离心30s，将剩余的培养物贮存于4℃。
4.吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
5.向含细菌沉淀的微量离心管中加入350μl STET，重悬菌体6.加25μl新配制的10mg／ml溶菌酶溶液，振荡3秒钟以混匀之7.将离心管放人煮沸的水浴巾，时间恰为10s。
8.用微量离心机于室温以12 000 r／rain离心10mm。
9.用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。
10.在上清液加入40μl 5mol／L乙酸钠(pH5.2)和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5min。
11.用微量离心机以15 000r／min离心12.小心吸去上清液，将离心骨倒置于—张纸巾上，以使所有液体流出。
再将附于管壁的液滴除尽。
4℃以12 000r／111111离心振荡混匀，于室温放置15nun，回收核酸沉淀，13.加lml70％乙醇。
以15 000r／min离心l0min。
14.小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。
除去管闭上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发完，使管内无可见液体。
L5.用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg／ml)的TE(pH8.0)溶解核酸，稍加振荡，贮存于-20℃。
转化子筛选方法转化子筛选是一种广泛应用于生物信息学领域的技术，它可以在大规模基因表达数据集中发现具有生物学含义的基因集合。
该技术通过将基因表达数据转化为一组数学表达式，然后对这些表达式进行筛选和聚类，最终找到相互关联且与特定生物过程相关的基因子集。
本文将介绍转化子筛选方法的基本原理、应用和未来发展方向。
转化子是指一种在细胞内存在的代谢产物或信号分子，例如葡萄糖、氨基酸和激素等物质。
这些转化子可以直接或间接地反映出基因表达的变化情况，因此被认为是评估生物系统状态的关键指标。
转化子方面的研究已经发展出了大量的实验和计算方法，其中最流行和实用的是代谢组学和基因组学方法。
转化子筛选方法的基本原理是将基因表达数据转化为与转化子水平相关的数学表达式。
这些数学表达式可以是已知的生物学模型或未知的根据数据情况建立的新模型，例如PCA、PLS、SVM等算法。
通过这些数学表达式，我们可以将基因表达数据进行有效的降维和聚类，最终找到具有生物学意义的基因集合。
为了提高筛选的效率和准确性，我们通常会进行以下步骤：1.数据预处理：去噪、归一化、标准化等方法，以提取出数据的最有价值特征。
2.特征选择：筛选出与特定转化子水平相关的基因集，例如差异表达分析、共表达网络分析等方法。
3.数学表达式的构建：建立可以描述基因表达数据的数学表达式，例如PCA、PLS、SVM等算法。
4.基因子集的聚类和筛选：将经过特征选择和数学表达式计算后的基因数据进行聚类分析和筛选，提取出具有生物学意义的基因子集。
5.生物学意义分析：通过对筛选出来的基因子集合进行生物学意义分析，确定这些基因集合与特定生物过程相关的程度。
转化子筛选方法被广泛应用于生物学研究领域，尤其是在基因表达谱、代谢组学、蛋白质组学等方面。
下面将介绍该方法在几个重要领域的应用。
1.基因表达谱研究基因表达谱可以反映出细胞或组织中所有基因的表达水平，因此具有广泛的应用前景。
转化子筛选方法可以通过将基因表达数据转化为与转化子水平相关的数学表达式，从大规模基因表达谱数据中挖掘出与疾病发生和进展相关的基因集合。
山东大学实验报告 2013年 10 月 22日至11月19日姓名系年级 2011级生技一班学号 201100140112 组别四题目DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定同组者一、【实验目的】1.学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理。
2.掌握对DNA进行限制性内切酶酶切的实验技术。
3.学习和掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术。
4.学习和掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理与方法。
5.学习和掌握热激法转化E.coli感受态细胞的原理与方法。
6.掌握α-互补筛选法的原理。
7.学习用试剂盒提取质粒DNA的方法。
8.复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
9.学习和掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。
二、【实验原理】通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶，其中特异水解断裂RNA分子的酶被称为核糖核酸酶，而特异性水解断裂DNA分子的酶被称为脱氧核糖核酸酶。
核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式，分为两种类型，一种是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶。
另一种是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶。
重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。
限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。
1．限制性核酸内切酶（1）限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解，Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解，Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
生物工程上游技术综合设计实验利用不同的方法筛选和鉴定转化子生命科学学院生物工程09级1班同组成员：指导教师：摘要：通过转化子筛选、菌落直接PCR、重组质粒大小鉴定、重组质粒酶切鉴定、重组质粒的进一步PCR鉴定等一系列步骤，我组成功筛选并鉴定了含有pET32-CaM5转化子的两个菌落，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。
关键词：转化子；筛选；鉴定；PCR；凝胶电泳引言：在质粒载体上进行克隆时，由于量少，连接产物没有也不可能再经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。
同时，细菌（宿主）的转化效率极低，即转化实验后绝大部分细菌（宿主）是没有被转化的，因此有必要对转化产物进行筛选和鉴定。
首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。
然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。
最后，从候选重组子中提取质粒。
一、使用仪器、材料1、材料实验九装备好的转化产物：含pET32-CaM5 或pET32的E. coli DH5α菌株（R—，M—，Amp—）2、设备用具PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、eppendorf管（1.5mL离心管）等。
3、主要试剂大肠杆菌培养试剂、质粒提取试剂、酶切试剂、PCR反应试剂、电泳试剂以及其他常规试剂。
二、实验步骤1、转化子筛选（已做）（1）每组连接反应转化原液取100μL用无菌玻璃棒均匀涂布于筛选培养基上，37℃下培养半小时以上，直至液体被完全吸收。
（2）倒置平板于37℃继续培养12~16h，平板上所长出的单菌落即为转化子。
因为不带质粒的细胞无Amp抗性，不能在含有Amp的培养基时成活。
2、菌落直接PCR(1)用无菌牙签分别挑取4个白色转化子菌落和一个已知的pET32- CaM5菌落，先在编好号的5支PCR反应管中的底部分别涂搽，然后点在新的含有Amp的筛选平板上，在其背面编号，置37℃过夜后保存于4℃。
生物工程上游技术实验综合实验设计
利用不同的方法筛选和鉴定转化子
生命科学学院
生工121
指导老师: 田长恩、周玉萍
摘要
本次实验我们小组通过含Amp的培养基初步筛选出转化子、菌落直接PCR、摇菌培养观察细菌表达形态等一系列实验方法，从6个转化子中筛选出了2个目的重组子.，从而达到实
验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。
关键词
筛选、菌落直接PCR、摇菌培养、电泳
引言
在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。
同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。
首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。
然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。
最后，摇菌培养观察菌株表达形态。
通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。
因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。
通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。
但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。
从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了GFP荧光蛋白。
三、使用仪器、材料
1、材料：实验九准备好的菌株。
2、实验仪器及设备:PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。
3、主要试剂：10×PCR buffer 、dNTP mixture 、前向引物(P1) 、反向引物r(P2) 、 rTaq 酶、灭菌蒸馏水、LB液体培养基：
四、实验步骤
1、转化子筛选：在实验九含有Amp的筛选培养基中长出的菌落中挑选出6个白色单菌
落，并做好标记，这6个单菌落即为转化子。
2、菌落直接PCR：用无菌牙签把6个白色单菌落，先在编好号的6支PCR反应管中的
底部分别涂擦，然后在PCR管中配制60μL反应体系.并按每管9μL分装好反应体系。
反应体系如下:
DNA template buffer （用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹）
10×PCR buffer 6μL
dNTP mixture 4.8μL
前向引物(P1) 2.4μL
反向引物r(P2) 2.4μL
rTaq 酶 0.2μL
灭菌蒸馏水 43.8μL
所有试剂按量仔细添加后,轻轻混匀,稍离心即可.然后每支PCR 涂抹反应管内分装9μL 为了防止反应混合液蒸发,最后添加15μL 矿物油
PCR 仪的参数设置
94℃ 4min
94℃ 30s
61℃ 30s
40 cycles
72℃ 50
72℃ 5min
琼脂糖凝胶电泳检测:
PCR 反应结束后，往每只PCR 反应管加入2μL 的6×loading buffer,稍离心混匀后从每支PCR 管中取6μL 产品点样,电泳15min.观察产物带。
3、配置LB 液体培养基， 称胰蛋白胨10g ，酵母提取物5g ，NaCl 10g 于1000ml
的三角瓶中，加入1000ml 蒸馏水搅拌溶解，然后用NaOH 调pH 至7.5，加塞，包扎瓶口。
并把电泳结果中有荧光条带的4个样品分别接种到装有15ml 培养液的锥形瓶中，然后将锥形瓶放置到摇床中过夜恒温培养，于第二天观察菌株生长情况。
五、 实验结果及分析
1 2 3 4 5 6 （这是我们小组的6个样本）
图一 菌落直接PCR 电泳图
结果分析：有电泳图中可以看出六个电泳样本中第1、2、3、4、6号泳带都扩增出特异性条带，表明这五个菌落的菌PCR结果为阳性，说明第1、2、3、4、6号菌是所需鉴定的重组子。
我们选取了1、3、4、6号这4个样本做了下面的摇菌培养处理，实验效果图如下：
1号 3号阴性对照阳性对照
4号 6号阴性对照阳性对照
图二摇瓶培养的菌落生长情况
结果分析：从摇菌结果可以看出3号，6号菌株出现了荧光效果（图片由于像素原因只能看出浅浅的绿光），因此可以得出结论3号、6号菌是成功转化并表达GFP荧光蛋白的菌株，实验结果符合实验预期。
六、参考文献
《生物工程上游技术实验书册》田长恩科学出版社《基因工程技术》冯斌谢先芝编著化学化工出版社《生物技术综合实验》刘晓晴编科学出版社。
