利用不同的方法筛选和鉴定转化子

一、实验目的1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。

2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。

3. 学会筛选和鉴定转化子。

二、实验原理质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。

通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。

本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。

三、实验材料1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）2. 受体菌：大肠杆菌DH5α3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。

（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。

（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。

（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。

（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。

（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。

（7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。

2. 筛选和鉴定转化子（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。

（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。

（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。

（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。

五、实验结果1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。

2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。

3. 阳性克隆PCR产物与预期相符，测序结果验证目的基因正确导入。

转化子筛选方法所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。

进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移,使受体细胞表现新的遗传性状。

将经转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体（transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。

一.a互补所谓基因内互补作用，在LacZ体系中，是指二个彼此互补的突变基因(突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β—半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X—gal(5-溴-4-氯—3-吲哚-β—D—半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴—4—氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。

然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多克隆位点后，就会阻断α序列的读码结构，使其编码的α肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成α-互补，因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。

根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。

此法又称蓝白筛选法。

二.杂交筛选该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。

将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。

菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板，它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。

因此，能够进行重复筛选，效率高,可靠性强,而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。

2。

斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来。

2）抽提纯化，蛋白质、杂DNA等减少，所以能得到更为确切的结果，既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。

3。

Southern blot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位于基因.三.插入失活根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。

转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。

再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。

因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。

一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。

2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。

3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。

4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。

二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。

（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。

（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。

2、根据报告基因筛选转化子。

（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。

由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。

（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。

如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。

3、根据形成噬菌斑筛选转化子。

第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。

2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。

3. 熟悉转化实验的基本流程，包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。

4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。

二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一，其原理主要包括以下几个方面：1. 基因克隆：通过酶切、连接等操作，将目的基因与载体连接起来，构建成重组质粒。

2. 转化：将重组质粒导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制、表达。

3. 筛选：通过选择性培养基和分子生物学方法，筛选出含有目的基因的转化子。

4. 鉴定：对筛选出的转化子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。

三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。

2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。

3. 细胞：感受态细胞（如大肠杆菌DH5α）。

4. 基因组DNA：目的基因片段和载体DNA。

四、实验步骤1. 目的基因片段的制备：采用PCR技术扩增目的基因片段。

2. 载体DNA的制备：提取载体DNA，进行酶切处理。

3. 基因连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。

4. 转化：将连接产物转化感受态细胞。

5. 涂布培养：将转化后的细胞涂布在选择性培养基上，培养过夜。

6. 筛选：挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。

7. 鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。

五、实验结果与分析1. PCR检测结果：根据PCR检测结果，筛选出含有目的基因的转化子。

2. 酶切鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切，观察酶切图谱，确认重组质粒是否构建成功。

3. 序列鉴定：对酶切鉴定阳性的菌落进行测序，与目的基因序列进行比对，验证其是否正确。

六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。

2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒，并对其进行了鉴定。

一、实验目的1. 掌握细菌转化的基本原理和方法。

2. 熟悉电击法和热激法两种转化方法。

3. 学习如何筛选和鉴定转化子。

二、实验原理细菌转化是指将外源DNA分子导入细菌细胞内，使其获得新的遗传性状的过程。

转化过程包括：感受态细胞的制备、DNA分子的转化、转化子的筛选和鉴定。

三、实验材料1. 菌株：大肠杆菌DH5α感受态细胞。

2. 质粒载体：pUC19质粒。

3. 试剂：氯化钙（CaCl2）、无菌水、DNA分子量标准、琼脂糖、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker、LB培养基、抗生素（如氨苄青霉素）等。

4. 仪器：电击仪、电击杯、离心机、PCR仪、凝胶成像系统、培养箱等。

四、实验方法1. 感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5α感受态细胞接种于LB培养基，37℃培养过夜。

（2）取过夜培养的细菌，按1:100的比例加入无菌水，轻轻吹打混匀。

（3）将混匀的细菌溶液在冰浴中放置30分钟。

（4）4℃下以4000 r/min离心5分钟，弃上清。

（5）向沉淀中加入500 μL无菌水，轻轻吹打混匀。

（6）4℃下保存备用。

2. 电击转化（1）将pUC19质粒和感受态细胞按照1:1的比例混合，轻轻吹打混匀。

（2）将混合液转移到电击杯中。

（3）在电击仪上设置电压为2.5 kV，电容为25 μF，电阻为200 Ω。

（4）进行电击转化，时间约为5秒。

（5）将电击后的混合液立即加入到2 mL LB培养基中，混匀。

（6）37℃培养1小时。

3. 转化子筛选（1）将培养好的转化子涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上。

（2）37℃培养过夜。

（3）观察并记录菌落生长情况。

4. 转化子鉴定（1）取转化子菌落，提取质粒DNA。

（2）进行PCR扩增，检测质粒载体上的目的基因。

（3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

五、实验结果与分析1. 转化子筛选经过培养，观察到平板上出现了白色菌落，表明转化成功。

2. 转化子鉴定通过PCR扩增，观察到目的基因条带，说明转化子中含有目的基因。

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要：以质粒pUC19作为载体、λDNA作为外源片段来源，限制性核酸内切酶Hin dⅢ分别对其进行单酶切，产生相同的黏性末端后用T4 DNA连接酶连接从而构建重组质粒，用CaCl2制备E.coli感受态细胞，并用热激法进行重组质粒的转化，培养并用α-互补筛选法进行筛选，最后用试剂盒提取质粒DNA进行检测。

根据在实验过程中所遇到的问题及对结果的分析，探讨关键步骤及影响转化/重组效率的相关因子，并说明实验过程中应当注意的问题。

关键词：DNA酶切连接感受态细胞转化重组子的筛选与鉴定引言：实验目的为掌握限制性核酸内切酶的分类、特性与作用原理以及对DNA进行酶切的实验技术，掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4 DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术，掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理和方法，掌握α-互补筛选法的原理，学习用试剂盒提取质粒DNA的方法，复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。

主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。

限制性核酸内切酶分为三类，Ⅰ型与Ⅲ型：识别位点与切割位点不一致，故同一种酶切产生的片段长度不同；Ⅱ型：固定的识别序列处切割，故每次都产生完全相同的片段。

影响限制性内切酶活性的因素有：DNA纯度，DNA甲基化程度，反应温度，DNA 的分子结构，缓冲液。

DNA连接酶在体内合成DNA某条链上丢失的磷酸二酯键，体外连接反应中，DNA连接酶则需要合成两个磷酸二酯键。

T4-DNA连接酶不需要PEG等就能进行平端的连接，所以实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。

影响DNA连接的因素有：温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。