6叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量测定

叶绿体色素的提取分离与理化性质
二、实验原理：
叶绿体中主要成分为叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素，这些色素不溶于水而易溶于有机溶剂，所以用乙醇做提取剂。

提取液用薄层层析法加以分离。

由于硅胶对不同色素的吸附性不同，在展开剂带动各种色素向上移的过程中，有的速度慢有的速度快，从而彼此分开成单独的色带。

叶绿素可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，盐能溶于水，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。

叶绿素吸收光量子而转变为激发态，变回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。

叶绿素容易受强光破坏，而类胡萝卜素较稳定。

叶绿素中的镁可被氢离子取代而成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素。

三、实验仪器和材料：
1.菠菜叶
2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂，苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸—醋酸铜溶液，氢氧化钾—甲醇溶液。

3.天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸，刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml移液管。

四、实验步骤：。

实验四、叶绿素的提取、分离及化学性质鉴定一．实验目的：掌握植物中叶绿体色素的成分分离和定性、定量分析的原理和方法。

二．实验原理：1、溶解性。

叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取2、吸附性。

滤纸对Chlb、Chla、叶黄素、胡萝卜素的吸附能力不同(？)，当用石油醚作推动剂时，其在滤纸上的移动速度不同，可相互分离。

当用适当溶剂推动时，混合物中各成分在两相（固定相和流动相）间具有不同分配系数，所以移动速度不同，一定时间后可将各种色素分离三．实验材料:新鲜植物叶片器具：研钵一个，漏斗一个，刻度试管两支，剪刀一把，长滴管一个，培养皿(直径9cm)一个，圆形滤纸（11cm和7cm)各一张，滤纸条一张试剂：95%乙醇，石油醚四．实验步骤:1.色素提取（乙醇粗提液）a.取新鲜叶片洗净擦干，去中脉称1g左右剪碎于研钵b.研钵中加3-5ml 95%乙醇研磨成匀浆过滤于刻度试管残渣用少许乙醇冲洗一并过滤定容至10ml注：研磨用石英砂或SiO2以利于充分研磨，加入CaCO3以保护叶绿素。

2.荧光观察将乙醇提取液试管放于太阳光下观察反射光和透射光下的颜色现象：透射光下呈绿色，反射光下呈红色为叶绿素荧光3.色素萃取（石油醚提取液）取乙醇提取液5ml与另一支试管加2ml石油醚摇荡静止片刻上层深绿色为石油醚提取液注：用丙酮提取会更好些，各色素在石油醚中溶解度不同4.色素分离a.将（11cm)圆滤纸中间剪一小圆孔取滤纸条捻成紧实芯一端插入圆滤纸中心（孔缘与纸芯紧贴且露出少许，最好相平）用长滴管吸少许石油醚提取液滴于纸芯上端待风干后再滴加几次。

b.将盛有石油醚的内盖（不要过满）放于培养皿中央将插上纸芯的滤纸放在培养皿上纸芯下端浸入石油醚迅速盖好培养皿。

c.推动剂前缘接近滤纸边缘时取出滤纸，风干可见分离色带，用铅笔标出各种色素位置和名称注：带宽和移动速度说明？答：带宽：色素越多，色素带越宽,所以色素共分为好几个带移动速度：溶解度高的移动速度快，就越接近滤纸上边缘。

叶绿体色素的提取分离和理化性质主讲：张海森博士一、实验目的因此，测定叶绿体色素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在实际生产中也有着广泛的应用。

1、学习叶绿体色素的提取方法。

2、了解叶绿素和类胡萝卜素的一些主要理化性质。

绿色植物的光合作用是离不开叶绿体色素的，了解叶绿体色素的组成和性质对于理解光合作用的本质很有帮助。

叶绿体色素分为叶绿素和类胡萝卜素两类。

它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，成为色素蛋白复合体，不溶于水，溶于有机溶剂，因此，可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。

二、叶绿体色素的提取原理三、实验材料：菠菜叶片五、叶绿体色素的理化性质1.光对叶绿素的破坏作用叶绿素（a，b）的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当色素分子与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。

水提取液暗光乙醇提取液暗光1) 取四支小试管，分别加入两种提取液2ml，稀释2-3倍；2) 各取两只试管放于暗处; 另两只试管置于强光下，进行光破坏；3) 30min后，对比观察光破坏的结果。

光对叶绿素破坏的操作步骤：2.提取液中各成分分离：用色层分析的原理加以分离因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在流动相和固定相之间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。

叶绿体色素的结构决定了它们极性的不同，因而在滤纸上的迁移速率不同。

叶绿体色素叶绿素类胡萝卜素叶绿素a 叶绿素b叶黄素胡萝卜素问题：请根据这四种色素分子的结构比较它们极性的大小。

步骤：（1）取圆形滤纸1张，用细头的吸管在其中心戳一圆形小孔。

（滤纸直径为11cm）（2）另取一张长方形滤纸条（5cm×1.5cm），沿纸条长边方向涂抹色素，风干后，重复涂抹数次。

十次涂抹之后，沿长边方向卷成纸捻。

（3）纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使之与滤纸刚刚平齐（勿凸出）。

（4）将康维皿置于培养皿内，向康维皿中央小室加入推动剂。

实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定摘自王尊本主编,综合化学实验(第二版),第226-244页,北京:科学出版社,2007年9月。

实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定[1-27]一、叶绿体色素的提取(一) 实验目的1)掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。

2)了解皂化-萃取提取胡萝卜素的原理。

3)了解1,4-二氧六环沉淀法提取叶绿素的原理。

(二) 实验原理植物光合作用是自然界最重要的现象,它是人类所利用能量的主要来源。

在把光能转化为化学能的光合作用过程中,叶绿体色素起着重要的作用。

高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类,主要包括叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素四种。

它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表34.1。

表34.1 高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量项目叶绿素类胡萝卜素叶绿素a 叶绿素b 胡萝卜素叶黄素颜色蓝绿色黄绿色橙黄色黄色在叶绿体内各色素含量比例 3 1 2 13 1 叶绿素chlorophylls是叶绿酸的酯,它在植物进行光合作用中吸收可见光,并将光能转变为化学能。

叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。

在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)两种结构相似的形式存在,其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。

叶绿素的基本结构见图34.1。

在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环,它们由四个甲烯基联结成卟啉环,在卟啉环中央有一个镁原子,它以两个共价键和两个配位键与4个吡咯环的氮原子结合成内配盐,形成镁卟啉。

在叶绿素分子中还有两个羧基,其中一个与甲醇酯化成COOCH3,另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。

类胡萝卜素carotenoids是一类不饱和的四萜类碳氢化合物(例如胡萝卜素,carotenes,或它们的氧化衍生物(例如叶黄素类,xanthophylls。

实验日期：2011.9.28叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定1、实验原理叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a 、叶绿素b 、胡萝卜素和叶黄素组成。

它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。

1. 叶绿体色素的结构与分离叶绿素a为蓝黑色固体，在乙醇溶液中呈蓝绿色；叶绿素b为暗绿色，其乙醇溶液呈黄绿色。

Chla与Chlb是吡咯衍生物与镁的络合物，它们很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。

Chla与Chlb 是植物进行光合作用必需的催化剂，易溶于石油醚等非极性溶剂中。

通常植物中叶绿素a的含量是叶绿素b的三倍。

其结构式如下：类胡萝卜素是一种橙色的天然色素，属于四萜，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中β异构体含量最多。

β-胡萝卜素(R=H)和叶黄素(R=OH)叶黄素是一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体内，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在石油醚中溶解度较小。

秋天，高等植物的叶绿素被破坏后，叶黄素的颜色就显示出来。

叶绿素与类胡萝卜素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

提取液可用色谱分析的原理加以分离。

因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

2. 叶绿体色素的物理性质叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。

叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它从第一单线态返回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。

因为分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长。

3. 叶绿体色素的化学性质叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。

叶绿体色素的提取、分离及含量测定实验目的叶绿素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。

叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。

叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。

另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。

因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。

实验原理从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。

利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇提取。

分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。

纸层析是其中最简单的一种。

当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。

强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。

而离体的叶绿素提取液中不含有还原酶，光产生的强氧化物质会破坏叶绿素。

叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。

A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.75Ca+45.60Cb（2）公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。

实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质系别：机械工程系班级：机械11实验者：潘霖学号：2011010389同组姓名：肖鹤翀实验日期：2011.10.22Ⅰ提取与分离一、实验目的：1.学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。

2.了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。

二、实验原理:叶绿体是进行光合作用的细胞器。

叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。

这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。

提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。

薄层层析色谱法是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。

由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。

植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。

本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。

三、实验材料与试剂:1.新鲜的菠菜叶片。

2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1，体积比）。

3.研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。

四、实验步骤:（一）色素提取液的制备1.取新鲜叶片4~5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎，放入研钵中。

2.向研钵中加入少量CaCO3粉末，再加2~3ml体积分数为95%的乙醇，充分研磨至糊状，再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。

提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其他相关实验（如后面的叶绿素理化性质的验证）。

（二）叶绿体色素的分离1.取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，保证划线细直。

植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定引言：叶绿体是植物细胞中的一个重要细胞器，其中主要存在着叶绿素等色素，它们在光合作用中起着重要的作用。

研究叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定，对于了解光合作用的机理以及研究植物生理生化过程具有重要意义。

本实验旨在通过实验手段提取叶绿体色素，进行色素的分离、理化性质的研究和叶绿素含量的测定。

材料与方法：材料：菠菜叶片、研钵、磨杵、丙酮、乙醇、石油醚、叶绿素提取液、测色皿、高锰酸钾溶液、浓硫酸。

方法：1.取适量菠菜叶片放入研钵中，加入适量丙酮，用磨杵捣碎成糊状。

2.将捣碎的菠菜糊状物转移到玻璃漏斗中，用石油醚冲洗3次，使叶绿体附着物进一步析出。

3.将漏斗中的上清液收集，并加入适量乙醇，振摇混合，使叶绿素慢慢析出。

4.将释放出的叶绿体颗粒通过离心机离心沉淀10分钟，收集沉淀。

5.取收集到的叶绿体沉淀，加入适量叶绿素提取液，用乳钙酸钠解离剂进行叶绿素含量的测定。

6.将其中一部分叶绿体溶液加入高锰酸钾溶液，观察颜色变化。

7.将其余叶绿体溶液与浓硫酸混合，观察颜色变化。

结果与讨论：通过上述方法，我们成功地提取并分离出菠菜叶片中的叶绿体色素。

加入石油醚可以去除一部分杂质，使叶绿体进一步纯化。

加入乙醇可以使叶绿素从叶绿体中溶出。

通过离心沉淀，我们收集到了叶绿体的沉淀物。

叶绿体的提取液与高锰酸钾溶液反应后呈现蓝色或紫色，这是由于高锰酸钾通过氧化反应将一些具有现菌酮结构的物质氧化为合成叶绿素的前体物质所引起的。

这种反应也证实了叶绿体的存在。

叶绿体溶液与浓硫酸混合后呈现蓝绿色，这是由于浓硫酸通过剥离叶绿体周围的蛋白质和其他有机物质，将叶绿素分子释放出来，产生颜色变化。

叶绿素的含量测定是通过与乳钙酸钠解离剂反应来进行的。

乳钙酸钠解离剂能够与叶绿体中的叶绿素结合，并形成稳定的叶绿素-乳钙酸钠络合物。

这种络合物通过光密度的测定，可以根据比色法来测量叶绿素的含量。

实验名称：叶绿体色素的提取分离及其理化性质【中文摘要】本实验在提取叶绿体色素（叶绿素和类胡萝卜素）后，分别进行色素的分离和植物叶绿素理化性质的观察与检验。

【英文摘要】In this study, the extraction of chloroplast pigments (chlorophyll and carotenoids), the pigments were separated and the physical and chemical properties of chlorophyll observation and testing.【实验原理】提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。

对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。

理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。

叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。

【实验目的】以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化性质.【实验器材和试剂】1、材料：菠菜2、用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试管等3、试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3)，20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、醋酸铜【实验步骤】1.叶绿体色素的提取1).取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;2).加入少许石英砂和CaCO,再加入无水丙酮10ml,研磨成匀浆,再加丙酮15ml;33).用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处).2.纸层析分离叶绿体色素1）.层析样纸制备,将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条,将一端剪成中央留约1cm×0.5cm 的窄条;2）.点样,用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央部,用吹风机吹干后在原处重复点样7-8次;3）.展层,在层析缸中加入3-5ml层析推动液,然后将已点样的层析纸插入缸的側壁槽内,调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中,盖好盖子,于阴暗处展层约10min,即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层;3.叶绿体理化性质的观察1）.荧光现象的观察取浓的叶绿体色素提取液化3ml,在透射光和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色.2).皂化作用在观察过荧光现象的叶绿体色素提取液中加入2ml的20%KOH-甲醇溶液,充分混匀.吹打5分钟;沿试管壁缓慢加入3ml乙醚+4ml的蒸馏水,边滴加边摇动,直至看到溶液逐渐分为两层为止. 对照不加KOH-甲醇溶液.3).叶绿素分子中Mg2+的取代作用取2只试管,分别加入2ml叶绿体色素提取液,第1只作为对照,第2只加入数滴5%HCl,摇匀,观察溶液颜色变化.当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末,并微加热.与对照比较,观察溶液颜色变化.【实验结果】1、纸层析分离叶绿体色素2、叶绿体理化性质的观察1）荧光现象的观察溶液的透射光为绿色，反射光为暗红色。