primer premier5引物设计步骤

Primer5.0 目的基因序列引物设计
GA TTtCTTGGCTTtATA TA TCTTGT GGAaAGGaCGAAACACCGTGCTCGCTTCGGCAGCAC ATATACTAGTCGACGGGTCTAGACAA TGA TGCTGGGTAA TGACACCAAGCTGGGACTG GTACAGAAAGTCAGAGAACACTTACAGAACGGCA TCTAGACAATGA TGCTGGGTAATA CACTTACAGAACGGCA TCTAGA TGCCGTTCTGTAAGTGTTTGTTGAATGAATGAGTGTT GAACAAACTGCTAAGGTATCTTT ACAAGGTAG
从中扩增出目的基因片段（绿色的部分）：
首先：将绿色部分复制到primer5.0引物设计软件中，ctrl+v用鼠标右键不管用
.选择As is后，惦记OK出现：
然后惦记，出现
图中右上角标记，其中惦记S合成的是上游引物，A是下游引物，点击S后出现，然后点击出现
这些就是上游引物，选中后ctrl+c复制到引物合成单中，发给公司，下游引物：回到
点击A出现
用前后调节框，如下，将序列向右移动移到最后，得到下图
注意显示的是3—5，ctrl+c—ctrl+v后悔发现序列变成5---3了，这是软件的好处，因为公司引物合成就是从5—3的
其实上下游引物只是相对的，将得到的引物序列填表后发给公司就好了。

利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究引言：PCR (Polymerase Chain Reaction) 是一种广泛应用于分子生物学和基因工程领域的技术，通过引物（primers）的选择和设计，能够扩增特定的DNA片段。

PCR引物设计的质量和合理性对PCR扩增的成功与否起着至关重要的作用。

PrimerPremier5.0 是一款被广泛使用的引物设计软件，具有许多功能，可以辅助研究人员选择高质量的引物。

本文旨在研究和探讨利用PrimerPremier5.0软件进行PCR引物设计的方法和优势。

方法：1. 引物设计目标：在PCR实验中，为了获得准确和高效的扩增结果，引物设计时需要考虑以下几个因素：- 引物长度：通常情况下，引物的长度应在18到30个碱基对之间。

- GC含量：GC含量应尽量控制在40%到60%之间，过高或过低都会影响引物的特异性和扩增效率。

- 引物间的互补性：引物之间应避免互补性或三联体结构的形成，以避免非特异性扩增。

- 引物的熔解温度(Tm)：引物的Tm值应接近，以确保特异性扩增。

2. PrimerPremier5.0软件的使用：- 安装并启动PrimerPremier5.0软件。

- 导入所需扩增区域的目标序列。

- 在软件中设置引物的参数，如长度、GC含量和Tm值等。

- 执行引物设计程序，软件会根据设置的参数，自动在目标序列中搜索合适的引物。

结果与讨论：通过PrimerPremier5.0软件的使用，可以高效地选择到符合设计要求的引物。

软件会根据设定的参数，自动搜索并筛选出多个候选引物。

1. 引物长度：为了确保引物能够与模板DNA进行特异性结合，通常将引物长度设定在18到30个碱基对之间。

经过软件筛选后，可得到一组长度适当的引物。

2. GC含量：合适的GC含量可以提高引物的稳定性和特异性。

软件会自动根据设定的GC含量范围，筛选出具有适当GC含量的引物。

PCR引物设计流程详解本文目的：复制出IL-4基因片段一、查找基因序列1、进入NCBI主页，下拉选框选择Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因,即IL—4，点击搜索2 、在搜索结果选择灵长类(Homo sapiens）2、在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列3、查看基因的相关信息外显子区域CDs区域4、点击FASTA格式,并将序列保存到文档二、使用primer premier 5。

0设计引物1、建立新文件，将所得的序列复制进输入框内2、点击搜索按钮，搜索引物3、设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知,外显子区域分别为：1—200、201-248、249-425、426-618,又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子，PCR产物长度通常为100—150bp，故设定上游引物位置为201—248,下游引物位置为249—425,产物长度为100-150bp）4、确认条件后，显示搜索结果4、双击选中得分最高的引物查看引物情况(上图为上游引物情况，下图为下游引物情况）5、将设计的上下游引物复制出来,保存到文档中三、使用oligo 6.0对设计的引物进行评价1、建立新文件，将从cnki上获得的cDNA复制进输入框，并点击accept接收2、接收后显示出该序列的相关信息3、点击edit按钮录入用primer设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接收4、同理,录入下游引物5、分析上下游引物二聚体形成情况6、分析上下游引物发卡形成情况7、分析上下游引物GC％8、检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况9、分析PCR整体情况四、引物特异性检验（primer blast）1、进入NCBI主页,并选择blast2、选择primer blast3、在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击get primer进行对比4、查看blast结果Blast 结果显示，尽管IL—4与其它基因有相似区，但是引物的3’端没有完全互补。

Primer5.0 目的基因序列引物设计
GA TTtCTTGGCTTtATA TA TCTTGT GGAaAGGaCGAAACACCGTGCTCGCTTCGGCAGCAC ATATACTAGTCGACGGGTCTAGACAA TGA TGCTGGGTAA TGACACCAAGCTGGGACTG GTACAGAAAGTCAGAGAACACTTACAGAACGGCA TCTAGACAATGA TGCTGGGTAATA CACTTACAGAACGGCA TCTAGA TGCCGTTCTGTAAGTGTTTGTTGAATGAATGAGTGTT GAACAAACTGCTAAGGTATCTTT ACAAGGTAG
从中扩增出目的基因片段（绿色的部分）：
首先：将绿色部分复制到primer5.0引物设计软件中，ctrl+v用鼠标右键不管用
.选择As is后，惦记OK出现：
然后惦记，出现
图中右上角标记，其中惦记S合成的是上游引物，A是下游引物，点击S后出现，然后点击出现
这些就是上游引物，选中后ctrl+c复制到引物合成单中，发给公司，下游引物：回到
点击A出现
用前后调节框，如下，将序列向右移动移到最后，得到下图
注意显示的是3—5，ctrl+c—ctrl+v后悔发现序列变成5---3了，这是软件的好处，因为公司引物合成就是从5—3的
其实上下游引物只是相对的，将得到的引物序列填表后发给公司就好了。

primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。

点击Primer，进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。

在Search Parameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。

此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。

若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。

1.安装软件Primer premier5.0。

程序下载：Primer Premier 5.0 /Soft/2005/114.htm 2.程序中双击打开3.点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图所示。

4.输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。

5.选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏6.选中OK键，分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶7.选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。

8.软件默认引物为25个碱基9.可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可10．在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。

11.选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。

如图，选中EDIT PRIMERS图标，开始设计反义链。

12.从3端删除7－9个碱基同正义链。

13.将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。

完成后点analyze，认为可以后点OK。

14.最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。

GC含量不应超过60％15.该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印16.如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示。

同上输入目的基因片段，选SEARCH 图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere中的参数可以不选，为默认设置。

点OK。

最近刚开始做PCR，参考了很多与引物设计相关的帖子，结合自己使用primer5和oligo的体会，想谈谈自己设计引物的方法和步骤，恳请各位前辈指正。

RT-PCR引物设计原则和方法在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy 目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。

点击Primer，进入引物窗口。

此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。

在Search Parameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp。

点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG 或CCC，否则容易引起错配。

此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。

若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

2. 安装好以后就会在程序中双击打开。

开始设计克隆目的基因的引物。

打开后的界面如图。

点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图所示。

输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。

选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏选中OK键，分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。

软件默认引物为二-五个碱基可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7-9个碱基，保留16-18个配对即可在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。

选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。

如图，选中EDIT PRIMERS图标，开始设计反义链。

从3端删除7－9个碱基同正义链。

将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。

完成后点analyze，认为可以后点OK。

最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。

GC含量不应超过60％该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示。

同上输入目的基因片段，选SEARCH 图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere中的参数可以不选，为默认设置。

点OK。

显示满足设计参数的候选结果，点OK.点SENES选择正义链，RATING表示引物评分，最好选评分高的。

点ANTI-SENSE,相同方式选择反义链。