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彗星试验检测哺乳动物细胞 DNA 损伤样品制备方法
王楠;薛永来;杜道林
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2014(000)006
【摘要】彗星试验（ comet assay ）是近年来逐步发展起来的1种检测单细胞水平DNA损伤的新技术，该技术已被广泛应用于遗传毒理学、，辐射生物学、环境生态学等领域。
在碱性SCGE基础上，对哺乳动物细胞SCGE检测样品制备的方法进行了改进与优化，使改进后的方法更加快速简便、易于推广。
【总页数】3页(P41-42,43)
【作者】王楠;薛永来;杜道林
【作者单位】江苏大学环境与安全工程学院，江苏镇江212013;江苏大学环境与安全工程学院，江苏镇江212013; 江苏大学农业工程研究院，江苏镇江212013;江苏大学环境与安全工程学院，江苏镇江212013; 江苏大学农业工程研究院，江苏镇江212013
【正文语种】中文
【中图分类】Q291;X503.22
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用彗星实验技术检测环境遗传毒性物质
陈颖;王磊;王子健
【期刊名称】《土壤学报》
【年(卷),期】2006(43)4
【摘要】彗星实验(COMET Assay)是近年发展起来的在单细胞水平上定量检测DNA损伤的灵敏方法.经过不断改进和完善,用该方法检验的基因损伤已成为鉴别遗传毒性物质的敏感标记物,在致癌作用机制、环境污染监测以及环境毒理和风险评价等研究中,均发挥了重要作用,国内已有越来越多的研究人员开始采用这项技术.本文对彗星实验技术的发展过程、在环境中的应用以及未来的发展趋势进行综述,以利科研人员更加准确地掌握该技术,合理解释有关数据,来推动其进一步的应用和发展.
【总页数】6页(P673-678)
【作者】陈颖;王磊;王子健
【作者单位】中国科学院生态环境研究中心,北京,100085;中国21世纪议程管理中心,北京,100089;中国科学院生态环境研究中心,北京,100085
【正文语种】中文
【中图分类】X171.5;X131.3
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![一种利用植物彗星实验评价多环芳烃基因毒性的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/379bd555f4335a8102d276a20029bd64783e62b9.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201410633561.5(22)申请日 2014.11.11G01N 27/447(2006.01)(71)申请人南京农业大学地址210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号(72)发明人高彦征 高曦 胡小婕 康福星(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人谷庆红(54)发明名称一种利用植物彗星实验评价多环芳烃基因毒性的方法(57)摘要本发明公开了一种利用植物彗星实验评价PAHs 基因毒性的方法，属于污染物毒性评价技术领域。
该方法是利用染毒的大白皮蚕豆(Vicia Faba)的根尖进行植物彗星实验，用KometVersion6.0软件分析彗星图像，彗星图像的尾动量(TM)值与PAHs 污染浓度间有显著的剂量-效应关系，可用TM 值作为衡量PAHs 致DNA 损伤的评价参数，并直接用于评价PAHs 的基因毒性。
本发明所建立的利用植物彗星实验来评价PAHs 基因毒性的方法，具有科学、高效、快速、准确的特点，适用于PAHs 等有毒有机物基因毒性的定量评价。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页 附图2页(10)申请公布号CN 104458873 A (43)申请公布日2015.03.25C N 104458873A1.一种利用植物彗星实验评价多环芳烃(PAHs)基因毒性的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)选取洁净的过30目筛的石英砂，将浓度1mg/L的PAHs丙酮溶液加入到石英砂中混匀，待PAHs丙酮挥发完全后，制得含一定浓度PAHs的石英砂；(2)挑选大小一致、饱满无虫的蚕豆种子，表面消毒后，用去离子水洗净表面，室温下用去离子水浸泡种子24h，浸泡期间换水2～3次，然后将种子种于PAHs污染处理的石英砂中，20℃条件下培养4天，所述培养4天期间每天光照14h，光照强度4000Lx，80％湿度，培养够4天后种子生根至一定长度；(3)选取经培养后根长一致的蚕豆幼苗，种于盛有PAHs污染石英砂的玻璃烧杯中，烧杯外壁用黑色塑料袋包裹后，置于人工气候箱中(人工气候箱的条件设置为：20℃，80％湿度，14h光照，光照强度4000Lx)染毒48h，染毒后取出蚕豆幼苗，用去离子水清洗根部；(4)取蚕豆幼苗根尖进行彗星实验，用软件分析彗星图像，用尾动量(Tail Moment，TM)作为评价DNA损伤的参数。
药品杂质遗传毒性评价的概述张玉英1,2，李薇1，潘卫松31.广州市药品检验所，广东省药监局缓控释制剂质量分析重点实验室，广东 广州 510160；2.暨南大学药学院，广东 广州 510632；3.武汉药品医疗器械检验所，湖北 武汉 430074［摘要］本文综述了近年来国内外药品杂质遗传毒性评价的进展。
药品遗传毒性评价的结果直接关系到药品杂质限度的制定，各种杂质的遗传毒性评价方法的研究进展迅猛，在现阶段条件下，使用计算机预测药品杂质的遗传毒性；探索以γH2AX为代表的生物标志物检测替代传统的体内外遗传毒性检测体系；并使用斑马鱼模式动物对其遗传毒性进行验证是行之有效的杂质遗传毒性评价策略。
建立从计算机预测（in silico）、体外生物标志物（in vitro）到体内验证（in vivo）的药品杂质遗传毒性评价平台，有助于建立科学的杂质控制标准，提高药品质量的科学性，药品杂质遗传毒性评价水平的提升对于建设药品关键质量属性评价平台水平意义重大。
［关键词］药品杂质；γH2AX；遗传毒性；安全性评价；综述DOI: 10.19939/ki.1672-2809.2021.04.04Review on the Evaluation of Genotoxcity for Drug ImpuritiesZHANG Yuying1,2, LI Wei1, PAN Weisong31. Guangzhou Institute for Drug Control, GDMPA Key Laboratory for Quality Analysis of Sustained and Controlled Release Preparations, Guangzhou Guangdong 510160, China;2. College of Pharmacy Jinan University, Guangzhou Guangdong 510632, China;3. Wuhan Institute for Medical Products Control, Wuhan Hubei 430074, China.[Abstract] This article reviews the progress in the evaluation of genetic toxicity of pharmaceutical impurities in recent years.·综述·基金项目：广东省药品监督管理局科研项目（2020ZDB06）作者简介：张玉英，主任药师。
2种植物材料彗星实验的对比赵丽英;庞震玲【摘要】@@%利用不同浓度的叠氮化钠对蚕豆根尖细胞和小麦叶片细胞进行诱变处理,通过彗星试验测定蚕豆根尖细胞和小麦叶片细胞中的遗传损伤情况.结果表明,同阴性对照和蚕豆根尖相比,小麦叶片作为植物材料监测环境致突变物灵敏度最佳.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2012(040)011【总页数】3页(P40-42)【关键词】彗星实验(SCGE);蚕豆根尖;小麦叶片【作者】赵丽英;庞震玲【作者单位】南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南阳473061;南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南阳473061【正文语种】中文【中图分类】X173彗星实验又称单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)，是一种在单细胞水平检测DNA损伤的技术。
该技术最初由Ostling等[1]于1984 年在Cook等的方法上进行改进建立的。
彗星实验可以定量检测真核细胞中多种类型的DNA损伤，例如单链断裂、双链断裂、碱性不稳定位点、不完全切除修复位点和DNA交联等[2]。
彗星实验常用于动物细胞研究化学物质对DNA损伤和修复的影响，直到1996年Kopen等第一次报道了利用植物为材料进行彗星实验[3]。
利用植物彗星实验可以进行环境致突变物的检测，建立环境污染引起植物DNA损伤的监测系统，及时有效地进行环境污染风险评价。
为筛选最敏感的植物材料，本研究特进行小麦叶片与蚕豆根尖2种植物材料的彗星实验对比分析。
1 材料与方法1.1 材料蚕豆(Vicia faba Linn.)种子，小麦(Triticum aestivum)种子。
1.2 试验方法1.2.1 浸种催芽经浸种催芽后，蚕豆根尖长至2～3 cm、小麦叶片长至3～5 cm 时，选取发育良好、大小近似的幼苗备用。
1.2.2 根尖、叶片染毒处理剪下4～6条发育良好的蚕豆根尖和小麦叶片，分别用0.15、1.5 15 mmol/mL叠氮化钠常温染毒12 h，以蒸馏水做阴性对照。
彗星电泳法引言彗星电泳法（Comet assay），又称为碱性单细胞凝胶电泳（alkaline single-cell gel electrophoresis），是一种常用于评估DNA单链断裂程度及修复能力的实验技术。
该方法采用凝胶电泳原理，可以通过观察DNA在电泳中的迁移情况，定量分析DNA的双链断裂、单链断裂及碱解位点等信息，从而评估DNA的损伤程度。
彗星电泳法的原理彗星电泳法的原理是基于以下核心步骤：首先，细胞样品被混悬于低熔点琼脂糖凝胶中，并在裂解液中经过裂解，使DNA在凝胶中解旋并生成碱性单链凝胶。
然后，电泳运行期间，电场引起DNA向阳极移动，而碱解位点产生的碱性断裂会导致DNA 片段扩散，形成类似彗星尾巴的凝胶结构。
最后，经过染色和显微镜观察，可以评估DNA的尾巴长度和形态，进而对DNA的损伤程度进行定量分析。
彗星电泳法的步骤1.细胞样品准备：从感兴趣的组织或细胞中获取细胞样品，确保准备成单细胞悬液。
2.碱性裂解：将细胞样品与裂解液混合，并孵育一段时间，使DNA完全解旋并生成碱性单链凝胶。
3.电泳运行：将样品嵌入琼脂糖凝胶中的水平电泳槽中，通过施加电压使DNA向阳极运动，进行电泳分离。
4.染色和显微镜观察：完成电泳后，对凝胶进行染色处理，然后在显微镜下观察和拍照记录。
5.图像分析和结果计算：通过图像处理软件对拍摄的彗星图像进行分析，计算出DNA尾巴长度、形态等参数，从而评估DNA的损伤程度。
彗星电泳法的应用彗星电泳法在生物医学研究领域具有广泛的应用，主要用于以下几个方面：1. 检测环境致突变物质彗星电泳法可以用于评估环境中存在的致突变物质对细胞DNA的损伤程度，如化学物质、辐射等。
通过比较不同处理组织样品的彗星图像特征，可以评估不同处理条件下DNA的损伤程度，进而评估致突变物质的毒性和致突变性。
2. 评估细胞DNA修复能力彗星电泳法可以用于评估细胞对DNA损伤的修复能力。
研究人员可以在不同时间点收集细胞样品，然后通过彗星电泳法评估不同时间点DNA损伤的程度，从而了解细胞DNA修复过程中的动态变化。
彗星实验————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期：ﻩ彗星实验(Cｏｍet ａsｓay)，又称单细胞凝胶电泳(Ｓiｎglｅ celｌ geｌeleｃtrophｏreｓｉs,SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[１～3],并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4］。
本实验对Ｓｉnｇh等[５]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯［可发射波长为254 nm的紫外线(Ulｔraviｏlet,UV），属于UＶC波段范围]作为DＮA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞ＤNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度,验证改良的实验系统是否可靠,同时筛选并评价ＤNＡ损伤的分析指标。
１材料与方法1.1 细胞K５６2细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5% ＣＯ2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSＺ-20型,２0 W，天津市紫晶特种光源有限公司）。
1．３主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司）,９0% RPMI-1640培养液(Hyclonｅ公司）;双抗(青、链霉素，1０0 ＵＩ/mｌ);Trito ｎＸ-10０(Ｇenｖiew分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠（Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMＣ分装)；常熔点琼脂糖（Spaｎish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供;电泳槽:DYＣ33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜:Ｌeｉｃａ DM LB 2 (Ｌeｉｃａ公司)；彗星图象分析软件:CAＳP软件(cａsp-1．2.２,下载);CＯ２培养箱：BB16HＦ型(上海力申科学仪器有限公司);环地牌紫外辐照计（北京师范大学光电仪器厂）。
1.４实验分组及UV处理收集对数生长的K5６2细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于９5％，用Han ｋ's(ｐH7.４)调整细胞密度至1×１05/mｌ,接种于塑料培养皿中（ф=３5 mm,2 mｌ/plate)，然后进行紫外线照射（0.3 mW/cｍ２)。
大黄素通过抑制ATP与拓扑异构酶II的结合导致DNA产生双链断裂李妍，栾洋，任进（药物安全评价研究中心，上海药物研究所，中国科学院，201203）摘要：目的：大黄素作为泻药中常见的一种成分，广泛应用于临床，近期研究表明它能够引起遗传毒性，但是机制尚不清楚。
为了探讨大黄素引起遗传毒性的机制，我们开展了一系列的研究。
方法：采用Ames试验，TK基因突变试验以及体内和体外的微核试验来评价大黄素的遗传毒性。
在研究大黄素与拓扑异构酶的相互作用时，进行了一系列的分子和细胞水平的实验，研究了大黄素对拓扑异构酶II (topoisomerase II, Topo II) 活性以及Topo II α-DNA可切割复合物的影响。
另外，我们还应用了计算机模拟分子对接技术来预测大黄素与Topo II的相互作用位点。
最后，通过同位素标记技术和核磁共振技术（Nuclear Magnetic Resonance, NMR)验证模拟结果并检测了大黄素对Topo II介导的ATP水解的影响。
结果：TK基因突变试验和体外微核试验表明，在非代谢活化的条件下，80 µg/mL 的大黄素具有弱的遗传毒性。
但是中性彗星试验和磷酸化的H2AX的表达上调表明，大黄素能够引起DNA的双链断裂。
而且，在非细胞体系中，大黄素能够抑制Topo II α介导的pBR322的解螺旋和kDNA的去连环，表明大黄素能够抑制Topo II的活性。
Topo II催化抑制剂阿克拉霉素能够保护大黄素对TK6细胞引起的DNA双链断裂的损伤作用，同样的结果也显现在Topo II缺陷型HL-60/MX2细胞中。
实验表明大黄素能够通过与ATP竞争结合至Topo II的ATP结构域，并能抑制ATP的水解来影响Topo II的活性。
结论：试验结果表明，大黄素能够抑制ATP结合至Topo II，从而影响Topo II的活性，导致DNA双链断裂。
关键词：大黄素、DNA双链断裂、拓扑异构酶、ATPEmodin inhibited ATP binding to Topoisomerase II toinduce DNA double-strand breaksLi Yan, Luan Yang, Ren Jin(Center for Drug Safety Evaluation and Research, Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences)AbstractOBJECTIVE: Emodin has been widely used as a component of laxatives, whereas it can lead to genotoxicity. However, the mechanism underlining its genotoxicity is not entirely clear. We applied different assays to investigate the mechanisms by which emodin induces genotoxicity.METHODS: Ames assay, thymidine kinase (TK) gene mutation assay and in vitro and in vivo micronucleus (MN) test were used to evaluate genotoxicity caused by emodin. A series of standard biochemical and cellular methods were applied to investigate the inhibition of emodin on topoisomerases. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) was used to investigate the effects of emodin on ATP hydrolysis. Finally, molecular docking analyses were used to demonstrate the direct interaction between emodin and Topo II.RESULTS: Without metabolic activation, emodin at 80 µg/mL was mildly genotoxic as indicated in thymidine kinase (TK) gene mutation assay and micronucleus (MN) test. But in the neutral comet assay and the detection of γ-H2AX, emodin at 80 µg/mL induced DNA double-strand breaks (DSBs). Moreover, results obtained from inhibitions of kDNA decatenation and relaxation of supercoiled pBR322 induced by topoisomerase II (Topo II) showed that emodin inhibited Topo II activity. Further, using both aclarubicin, a Topo II catalytic inhibitor, and HL-60/MX2 cells deficient in Topo II, we showed that emodin-triggered DSBs s were in a Topo II –dependent manner. However, emodin did not intercalate into DNA. In contrast, emodin interacted with Topo II by competing with ATP for binding to the ATPase domain of human Topo II α and inhibited ATP hydrolysis.CONCLUSION: Taken together, these results suggested that emodin inhibited ATP binding to Topo II to induce DSBs.Key words: emodin, DNA double-strand breaks, topoisomerase II α, ATP一、前言大黄素，化学名称是6-甲基-1，3，8-三羟基蒽醌，是从大黄属、蓼属、鼠李属和番泻叶等中药中分离得到的活性成分，目前广泛用于中药为基础的泻药制备中。
专利名称：一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法专利类型：发明专利
发明人：黄鹏程,李若婉,周长慧,常艳
申请号：CN201810936276.9
申请日：20180816
公开号：CN110836972A
公开日：
20200225
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种基于γ‑H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法。
该检测方法包括下述步骤：(1)将与计数微珠混合后的待检测细胞与抗体、以及通透液和封闭液混合、孵育后使用流式细胞仪进行荧光检测；所述的抗体包括抗γ‑H2AX抗体、p53蛋白抗体、磷酸化组蛋白H3抗体和抗Cleaved PARP抗体；(2)结果分析：排除死亡细胞，并通过Cleaved‑PARP阳性排除凋亡细胞后，根据活细胞的γ‑H2AX的表达分析细胞毒性信息。
该检测方法检测体外细胞遗传毒性的方法简便、快速、准确并且可以提供多种机制信息的体外遗传毒性检测方法。
申请人：上海益诺思生物技术股份有限公司
地址：201203 上海市浦东新区自由贸易试验区郭守敬路199号
国籍：CN
代理机构：上海弼兴律师事务所
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