牛支原体套式PCR检测方法的建立

牛支原体、无乳支原体和丝状支原体丝状亚种小克隆三重PCR检测方法的建立及初步应用李大伟;黄灿平;张彦明;谢建华;冉智光;熊仲良;范伟兴【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2011(042)002【摘要】The study was aimed at establishing a triplex PCR to differentiate M. bovis, M. mycoides subsp. mycoides Small Colony Type and M. agalactiae out of the same sample, for clinical diagnosis and epidemiological survey. Three pairs of primers were designed and synthesized according to the published literatures in GenBank. And a triple PCR was developed to amplify conservative regions of each bacterial genomes of M. Bovis, M. mycoides subsp. mycoides Small Colony Type and M. agalactiae, with the target sequences of 448, 549 and 375 bp, respectively.Sensitivity of this triple PCR was analyzed. Specificity was verified with template from M. gallisepticum, M. Swine, M. agalactiae and M. mycoides subsp. mycoides Small Colony. And reliability was tested by comparing the results from determinative bacteriology. Three specific fragments of 448, 549 and 375 bp, corresponding to M. Bovis, M. mycoides subsp. mycoides Small Colony Type and M. agalactiae, were amplified under optimized condition, without interference between templates and the primers. And results were in agreement with determinative bacteriology. No band was shown in targeting genomes from M.gallis epticum and M. Swine. Sensitivity was determined as 0. 8 ng ·μL-1. These results suggest that the triplex PCR could differentiate M. Bovlis, M. mycoides subsp. mycoides Small Colony Type and M. agalactiae based on one single sample, with high sensitivity, specificity and reliability,and can be applied in clinical diagnosis and epidemiological survey.%本研究旨在建立一种可一次性区分牛支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体的三重PCR诊断方法,为临床诊断和流行病学调查提供可靠检测技术.根据GenBank发表的上述3种病原的基因组序列保守区域设计3对特异性引物建立三重PCR方法;确定其检测敏感性,以猪支原体、鸡支原体、无乳支原体和丝状支原体丝状亚种小克隆基因作模板检验其特异性;同时和病原分离鉴定结果对比其准确性.结果表明在优化体系和条件下能够同时得到扩增长度为448、549、375 bp 3条特异性片段,未扩增出猪、鸡支原体模板特异性片段;其敏感性(可检测到的最小模板DNA含量)为0.8 ng·μL-1;36份临床样品检测结果显示,三重PCR检测结果与分离培养鉴定方法一致,均能鉴定出牛支原体阳性病料.本研究建立的三重PCR诊断方法能够一次性鉴别3种支原体,具有高敏感性、特异性和准确性,可用于临床诊断和流行病学调查.【总页数】5页(P306-310)【作者】李大伟;黄灿平;张彦明;谢建华;冉智光;熊仲良;范伟兴【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心,青岛,266032;中国动物卫生与流行病学中心,青岛,266032;中国动物卫生与流行病学中心,青岛,266032;重庆市动物疫病预防控制中心,重庆,401147;重庆市动物疫病预防控制中心,重庆,401147;重庆市动物疫病预防控制中心,重庆,401147;中国动物卫生与流行病学中心,青岛,266032【正文语种】中文【中图分类】S852.62【相关文献】1.绵羊肺炎支原体和丝状支原体双重PCR检测方法的建立 [J], 宋勤叶;李潭清;刘兰亚;刘月琴;张英杰2.羊口疮病毒和丝状支原体簇双重PCR检测方法的建立及应用 [J], 林裕胜;江锦秀;江斌;游伟;胡奇林3.丝状支原体丝状亚种SC生物型PCR检测方法的建议 [J], 辛九庆;高玉龙;杨婉容;王砚范4.绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种多重PCR检测方法的建立 [J], 林裕胜;江锦秀;江斌;游伟;胡奇林5.丝状支原体山羊亚种抗体间接血凝检测方法的建立及应用 [J], 储岳峰;逯忠新;赵萍;高鹏程;贺英;石琴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

牛支原体快速PCR检测方法的建立r及其应用徐引弟;李海利;王治方;张青娴;索延乐;宋振宇【期刊名称】《中国奶牛》【年(卷),期】2017(0)6【摘要】The aim of this study was to develop a rapid and direct PCR method to detect Mycoplasma bovis from diseased materials. A pair of primers were designed according to the sequence of 16S rRNA gene of Mycoplasma bovis, and the system of direct PCR amplification was prepared. After simple treatment, the samples were added into the system for amplification and electrophoresis. A 1390 bp fragment was amplified, and the specificity and sensitivity were tested. The results showed that the method was specific and sensitive. The method was applied to detect clinical samples, and the detection rate was 100% conform with the traditional PCR. The method can directly detect Mycoplasma bovis from clinical samples and can be used for the detection of a large number of clinical samples of Mycoplasma bovis.%本试验旨在建立一种可直接从病料中快速检测牛支原体的PCR方法,并且应用于临床.根据牛支原体16S rRNA基因设计一对引物,配制PCR扩增体系,样品经简单处理后加入体系进行扩增,最终扩增出1390bp片段,进一步的试验证明该方法具有良好的特异性和敏感性.临床样品检测结果显示,该方法的检出率与传统PCR的符合率为100%.试验表明,该方法能快速直接从临床样品中检测出牛支原体,可用于牛支原体的大量临床样品的检测.【总页数】4页(P41-44)【作者】徐引弟;李海利;王治方;张青娴;索延乐;宋振宇【作者单位】河南省农业科学院畜牧兽医研究所,郑州 450002;河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室,郑州 450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,郑州450002;河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室,郑州 450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,郑州 450002;河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室,郑州450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,郑州 450002;河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室,郑州 450002;济源市动物卫生监督所,济源 459000;济源市动物卫生监督所,济源 459000【正文语种】中文【中图分类】S858.23【相关文献】1.牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒三重二温式PCR检测方法的建立及应用 [J], 范晴;罗思思;邓显文;刘加波;庞耀珊;谢芝勋;谢志勤;谢丽基;黄莉;黄娇玲;张艳芳;曾婷婷;王盛2.牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体双重PCR检测方法的建立及应用 [J], 于新友;李天芝;王金良;沈志强3.牛支原体、巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌多重PCR快速检测方法的建立 [J], 肖淦文;陈颖钰;彭清洁;胡长敏;崔朋;巴晓亮;陈焕春;郭爱珍4.牛支原体病PCR检测方法的建立及初步应用 [J], 吴位珩;黄波;杨茂生;姜玲玲;徐景峨;余波;张涛;余国富;杨莉;冯明祥;孙启跃;刘镜5.牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌三重PCR快速检测方法的建立[J], 杨莉;唐远江;余国富;邹茂华;吴位珩;余波;张涛;姜玲玲;刘镜;杨丽娟;孙启跃;徐景峨;龙玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒三重二温式PCR检测方法的建立及应用范晴;罗思思;邓显文;刘加波;庞耀珊;谢芝勋;谢志勤;谢丽基;黄莉;黄娇玲;张艳芳;曾婷婷;王盛【摘要】为建立一种可同时检测牛支原体(MB)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性支气管炎病毒(IBRV)的三重二温式PCR检测方法.根据GenBank中MB、BVDV和IBRV的保守基因Uvrc基因、5'端非编码区(5'-UTR)和GB基因,分别设计了3对特异引物,将三温式PCR扩增程序简化为两个温度梯度,优化反应条件建立了用于同时检测MB、BVDV以及IBRV 3种常见牛呼吸道传染病痛原的三重二温式PCR.结果显示,该方法特异性好,只对MB、BVDV和IBRV模板进行扩增,扩增的目的片段长度分别为412、170、727 bp,对其他牛病原体无特异性扩增;灵敏度高,最低能同时检测到10 000拷贝的目的核酸;干扰性小,能同时检测3个不同浓度的模板.研究所建立的MB、BVDV和IBRV三重二温式PCR检测方法,具有特异性好、灵敏度高、方便快速等优点,可用于临床鉴别诊断和流行病学调查,具有很高的临床应用价值.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2018(039)002【总页数】6页(P43-48)【关键词】三重二温式PCR;牛支原体;牛病毒性腹泻病毒;传染性鼻气管炎病毒;检测【作者】范晴;罗思思;邓显文;刘加波;庞耀珊;谢芝勋;谢志勤;谢丽基;黄莉;黄娇玲;张艳芳;曾婷婷;王盛【作者单位】广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S858.23;S854.43牛支原体(Mycoplasma bovis，MB)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea，BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)是牛呼吸综合征(Bovine respiratory disease complex,BRD)常见的3种主要病原，由此引起的传染病是危害养牛业最为严重的疾病，制约着全球养牛业的发展[1]。

DAIRY HEALTH 332020·12河南省某肉牛屠宰场牛支原体感染情况调查徐引弟，焦文强，王治方，张青娴，朱文豪，李海利，王克领，徐照学（河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，郑州 450002）中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1004-4264（2020）12-0033-03DOI: 10.19305/ki.11-3009/s.2020.12.009开放科学(资源服务)标识码(OSID)微信扫描二维码听独家语音介绍与作者在线交流摘 要：为了解河南省屠宰场牛支原体的感染情况，于2019年12月从河南省某肉牛屠宰场采集肺等病料共计320份，进行了牛支原体的分离鉴定。

结果共分离出疑似支原体97株，经进一步进行16S rRNA测序比对，鉴定出15株牛支原体，分离率高达4.68%，表明牛支原体在屠宰场中有较高的感染率。

本结果可为河南省牛支原体的防控提供参考。

关键词：屠宰场；牛支原体；分离鉴定；感染情况调查收稿日期：2020-05-19基金项目：河南省科技攻关计划项目（162102110042）；河南省财政预算项目（20188110）。

作者简介：徐引弟（1974-），女，湖北浠水人，副研究员，博士，主要从事动物病原微生物研究工作。

牛支原体（Mycoplasma bovis ）是一种主要的、但通常被忽视的病原体，它属于柔膜体纲，是以缺乏细胞壁、最小的、能自我复制为特征的微生物。

主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、生殖道炎症以及流产和不孕等疾病，对全世界的养牛业构成了主要威胁[1,2]。

在中国，自2008年以来，该病原体已被证明对牛的健康构成威胁，大约10%的致死率主要是由牛支原体引起的肺炎，到目前为止，还没有有效的疫苗来阻止牛支原体的感染。

与此同时，由于细菌耐药性的增强，抗生素治疗正在降低其有效性，使得它的控制变得难以实现和困难[3,4]。

贵州农业科学2019,47(5):66〜69Guizhou Agricultural Sciences［文章编号］1001-3601(2019)05-0160-0066-04 Animal Husbandry・VeteFinary・Fishery・Resource Insect牛支原体病PCR检测方法的建立及初步应用吴位玮1，徐景峨1，余波1*，张涛1，余国富$，杨莉1，冯明祥彳，孙启跃刘镜黄波杨茂生姜玲玲1(1.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州贵阳550005；2.清镇市动物疫病预防控制中心，贵州清镇551400；3.贵州省关岭自治县畜牧服务中心，贵州关岭561300)［摘要］为快速确诊肉牛牛支原体病，根据牛支原体OPPD/F基因序列设计1对引物，通过反应条件的优化，建立牛支原体PCR诊断方法。

结果表明：该方法可从牛肺、鼻拭子临床样本和其临床样本的培养物中直接检测到牛支原体病病原核酸，该方法可检测的病原核酸最小浓度约为1X1CT7yg,整个检测过程仅需3.5h。

该方法具有快速、灵敏性高、特异性强等特点，对牛支原体感染的诊断、防治与预后评估具有重要意义。

［关键词］牛支原体;OPPD/F基因；PCR［中图分类号］Q953+.3；S856［文献标识码］AEstablishment and Preliminary Application of PCR Assay for theDetection of Mycoplasma bovinaWU Weiheng1,XU Jingle1,YU Bo1*,ZHANG Tao1,YU Guofu2,YANG Li1,FENG Mingxiang3, SUN Qiyue1,LIU Jing1,HUANG Bo1,YANG Maosheng1JIANG Lingling1(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang,Guizhou550005； 2.Animal Disease Control and Prevention Centre of Qingzhen City,Qingzhen,Guizhou551400；3.Animal Husbandry Service Center of Guanling Autonomous County in Guizhou Province,Guanling,Guizhou,561300,C加加)Abstract:To rapidly diagnose Mycoplasma bovinain beef cattle,a pair of primers were designed according to the OPPD/F gene sequence of M.bovina,and the PCR diagnosis method of M.bovina was established by optimizing the reaction conditions.Results：The method could detect the pathogenic nucleic acid of M.bovina directly from the clinical samples of bovine lung and nose swabs and the culture of the clinical samples.Minimum detectable concentration was1X10-7ptg?and the detecting time was 3.5h.It was concluded that the established PCR assay was rapid,highly specific and sensitive?which could be important in disease diagnosis9control applications and prognostic estimation of M.bovina・Key words:Mycoplasma bovina；OPPD/F Gene；PCR牛支原体是危害养牛业的一种主要致病性支原体，除能导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎外，还导致眼结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病工O 1961年,美国人HALE⑵首次从患乳腺炎的牛乳中分离得到牛支原体,1976年报道其与牛呼吸系统疾病有关。

牛支原体套式PCR检测方法的建立李媛;董惠;张美晶;陈超;曹培丽;郭丹;姜海芳;辛九庆【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2009(031)009【摘要】为建立牛支原体检测方法,本研究采用牛支原体的oppD/F基因的两对特异性引物,建立了牛支原体的套式PCR检测方法.该套式PCR可以从100ccu/mL(color change unit颜色变化单位)的牛支原体培养物中检出目的片段;同时还可以从病牛肺脏、病牛鼻拭子中扩增出目的片段,而且结果与病原分离结果一致.特异性试验结果表明,该方法与其它支原体无交叉反应,是一种特异性强、敏感性高的牛支原体检测方法.【总页数】3页(P709-711)【作者】李媛;董惠;张美晶;陈超;曹培丽;郭丹;姜海芳;辛九庆【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室,黑龙江哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室,黑龙江哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室,黑龙江哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室,黑龙江哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室,黑龙江哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室,黑龙江哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室,黑龙江哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室,黑龙江哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S852.61【相关文献】1.蜱传牛巴贝斯虫套式PCR检测方法的建立及应用 [J], 王素华;袁淑辉;蔡军;帅江冰;吴绍强;张晓峰2.Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法的建立与应用 [J], 朱小甫;吴旭锦;高睿;尚红梅3.猪圆环病毒3型套式PCR检测方法的建立及应用 [J], 张静;韩业芹;何长生;魏建忠;孙裴;李郁4.猪源肉孢子虫双重套式PCR检测方法的建立 [J], 刘婕;闫文朝;钱伟锋;韩利方;薛瑞5.猪肺炎支原体套式PCR检测方法的建立及应用 [J], 栾璐;刁小龙;刘云迎;张家铭;王飞;何海蓉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

牛呼吸道综合征多重PCR检测方法的建立及牛呼吸道合胞体病毒的分离鉴定牛呼吸道综合征多重PCR检测方法的建立及牛呼吸道合胞体病毒的分离鉴定引言：牛呼吸道综合征（bovine respiratory disease，BRD）是一种常见的牛群传染病，对牛群健康和养殖业造成了严重的经济损失。

其中，牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）是导致牛呼吸道综合征的重要病原体之一。

因此，建立一种准确、快速的多重PCR检测方法，并对BRSV进行分离鉴定，对疾病的预防和控制具有重要意义。

方法：1. 样品采集和处理：从临床疑似感染的牛群中采集呼吸道分泌物样品，并使用生理盐水或PBS溶解样品。

2. RNA/DNA提取：采用商业化的RNA/DNA提取试剂盒进行样品中RNA或DNA的提取，并按照说明书进行操作。

3. 多重PCR试剂的设计和制备：根据BRSV的特异性基因序列，设计引物和探针，通过合成化学方法制备多重PCR试剂。

4. PCR反应条件的优化：确定最佳的PCR反应体系、引物和模板浓度，并优化反应条件（温度、时间）以提高PCR的灵敏度和特异性。

5. PCR扩增：将提取的RNA/DNA样品作为PCR反应的模板进行扩增，使用PCR扩增仪进行PCR反应，最终获得扩增产物。

6. 凝胶电泳和分析：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，通过比较产物的大小和阳性对照，判断样品中是否存在目标基因。

7. BRSV的分离鉴定：对PCR阳性样本进行病毒分离，通过对病毒感染细胞的观察，确认是否存在BRSV病毒。

结果：1. 多重PCR方法的建立：通过反复优化和验证，确定了一套高度特异性和敏感性的多重PCR方法，可以同时检测多种BRD相关病原体，包括BRSV。

2. PCR阳性样本的分离鉴定：将PCR阳性样本接种于感受器官良好的细胞系中，观察细胞是否形成合胞体，通过电镜观察和免疫荧光染色，最终成功分离鉴定了BRSV。