动物固体组织蛋白提取-Protocol(可编辑修改word版)

动物细胞或组织的蛋白质抽提步骤步骤一：收集和处理样品首先，需要收集要研究的动物细胞或组织样品。

样品可以是从细胞培养物中收集的细胞，也可以是从动物体内收集的组织。

在收集样品之前，可以用生理盐水冲洗样品，以去除与研究无关的物质。

步骤二：细胞破碎和组织研磨接下来，需要将细胞破碎或组织研磨，以释放细胞内或组织内的蛋白质。

对于细胞破碎，可以使用一些方法，如机械破碎、超声波破碎或冻融破碎等。

对于组织研磨，可以使用搅拌器或研磨器等工具进行研磨。

步骤三：离心步骤四：蛋白质提取将经过离心的上清液取出，即为蛋白质提取物。

蛋白质提取液可以选择不同的组成，以适应研究的目的。

一般来说，一个典型的蛋白质提取液可能包含以下成分：蛋白酶抑制剂（如PMSF）、还原剂（如DTT或β-巯基乙醇）、溶解剂（如甲醇或异丙醇）、洗涤剂（如Triton X-100或Tween-20）以及缓冲液（如磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液）等。

这些成分对于蛋白质的稳定性、可溶性和抽提效果起着重要作用。

步骤五：蛋白质浓缩为了浓缩蛋白质，可以使用一些方法，如醋酸沉淀、有机溶剂沉淀或钙盐沉淀等。

这些方法可以使蛋白质从提取液中沉淀下来，以减少液体体积并提高蛋白质浓度。

步骤六：蛋白质分析最后，可以对蛋白质抽提物进行分析。

常用的蛋白质分析方法包括SDS-凝胶电泳、Western blotting、质谱分析等。

这些方法可以用于分析蛋白质的分子质量、浓度、结构和功能等。

总结起来，动物细胞或组织的蛋白质抽提步骤包括：收集和处理样品、细胞破碎和组织研磨、离心、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质分析。

这些步骤的选择和优化将根据具体的实验目的和要求进行调整。

（完整word版）膜蛋白提取1分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。

2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

3、100000g，4℃离心1hr。

弃去上清，沉淀用适量的Buffer B 重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

4、收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

2取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。

样品蛋白含量测定采用酚试剂法。

3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。

将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。

2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。

这是偶整理的蛋白裂解和提取的protocol，希望对大家有所帮助。

10ml 三去污裂解液配方如下：50 mmol/L Tris-cl (pH 8.0)：0.07882g150 mmol/L NaCl：0.08775g0.2 g/L叠氮钠：0.002g1 g/LSDS 0.01g100 mg/L Aprotin 0.001g10 g/L NP-40 0.1g5 g/L去氧胆酸钠0.05g100 mg/L 苯甲基磺酰氟(PMSF) 0.001g总蛋白抽提程序：1.PBS洗细胞3 次2.加入裂解缓冲液（1.5x106个细胞大约加入100µL 裂解液，或100ml细胞瓶中加入100µL 裂解液），冰上放置20min3.收集裂解液4.离心，12000转，2~10min5.吸取上清，蛋白定量，分装，保存在-80度备用裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。

化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA 断裂。

这两种方法（包括SDS 和溶菌酶处理等）提取纯化DNA中常用的方法。

机械裂解可以更均一的裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。

机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA 的断裂。

一、机械裂解法主要有以下两中：1、热休克（Thermal shock），既反复冻溶法，是一种常用的机械裂解方式比，通常由冷冻和解冻两部分组成（freezing and thawing）,。

原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行，解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和，但是很有效，有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。

2、超声波处理（Ultrasonication）既利用超声加热的方法，把细胞破碎。

但这种处理会导致DNA 的断裂，所以加热不宜过剧烈，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。

蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA。

2、设计蛋白表达引物。

引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA。

4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon(DE3)等。

7、蛋白的诱导表达.1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。

6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。

37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达).2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3）将有表达的菌株10％甘油保种,保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60％，使用时自己计算用量。

4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140—180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1％的葡萄糖用来抑制本底表达。

葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。

2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。

8、包涵体检测。

方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。

1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1。

5，约5h左右，视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。

2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1。

0左右（约2.5h～3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。

）注：菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

动物固体组织蛋白提取-Protocol2017-07-18动物固体组织蛋白提取 Protocol1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。

早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。

2、裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，现配现用。

（1000ulRIPA+10ulPMSF）。

置入4℃冰上。

3、抽蛋白（应冰上进行）：a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。

一般10ml管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg组织、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。

b、匀浆。

手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。

c、将组织匀浆转入1.5ml的EP管中（eppendorf 管、离心管）。

12000r/min 4°C 离心15min。

d、离心后EP管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP管中。

可-80℃保存。

4、蛋白浓度测定。

a、配工作液：溶液A：溶液B=50：1（200ul：4ul）。

动物组织蛋白提取方法一、准备工作1. 选取适当的动物组织：选择新鲜、无病变的动物组织，如肌肉、肝脏、肾脏等。

2. 清洗和切割组织：将选取的组织清洗干净，切成小块，便于提取。

二、提取步骤1. 浸泡：将切好的组织放入盛有清水的容器中，浸泡一段时间，以便于后续的提取操作。

2. 磨碎：将浸泡过的组织放入匀浆器中，进行充分磨碎，以便于蛋白的释放。

3. 提取：将磨碎的组织放入离心管中，加入适量的蛋白提取液，轻轻振荡离心管，使组织与提取液充分混合。

然后进行离心操作，将上清液去除，得到沉淀的蛋白。

4. 重复步骤3：为了得到更多的蛋白，可以重复步骤3，进行多次离心操作。

5. 保存和利用蛋白：将得到的蛋白保存好，可以用于后续的实验或生产用途。

三、注意事项1. 确保组织新鲜无病变，以避免提取过程中出现污染或无效提取。

2. 磨碎组织时要充分，以释放出更多的蛋白。

3. 提取液要适量，过多或过少都会影响蛋白的提取效果。

4. 离心时要确保离心速度和时间设置正确，以免影响蛋白提取的纯度和数量。

5. 保存蛋白时要确保环境适宜，避免蛋白变质或失效。

四、实验结果评估1. 观察沉淀物：通过观察沉淀物是否含有丰富的蛋白质，可以评估提取效果。

2. 测定蛋白质浓度：可以通过使用特定的蛋白质测定方法，如Bradford 方法等，来测定提取得到的蛋白质浓度。

3. 蛋白质性质分析：可以通过 SDS-PAGE、免疫印迹等方法，分析提取得到的蛋白质的性质和组成。

五、实验结论通过以上步骤，我们可以成功地从动物组织中提取出了蛋白。

这种提取方法简单易行，提取得到的蛋白可用于多种实验和生产用途。

需要注意的是，不同的动物组织和提取目的可能对提取方法有所影响，因此在实际操作中需要根据具体情况进行调整和优化。

六、拓展阅读建议1. 动物组织蛋白提取相关文献查阅：可以参考相关的科研论文和文献，了解更多关于动物组织蛋白提取的方法、影响因素和实验应用等方面的知识。

2. 实验室指南：可以参考实验室指南，了解更多关于实验室常用设备、试剂和实验方法等方面的信息。

动物固体组织蛋白提取 Protocol1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。

早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。

2、 裂解液配制：RIPA ：PMSF=100：1，现配现用。

（1000ulRIPA+10ulPMSF ）。

置入4℃冰上。

3、抽蛋白（应冰上进行）：a 、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。

一般10ml 管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg 组织、1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。

b 、匀浆。

手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min 上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。

c 、将组织匀浆转入1.5ml 的EP 管中（eppendorf 管、离心管）。

12000r/min 4°C 离心15min 。

d 、离心后EP 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP 管中。

可-80℃保存。

4、蛋白浓度测定。

a 、配工作液：溶液A ：溶液B=50：1（200ul ：4ul ）。

动物组织蛋白提取实验报告背景蛋白质是生命体内重要的组成部分，对于生物的结构和功能具有关键作用。

在研究动物组织的生物化学、分子生物学以及医学领域中，蛋白质提取实验是一项基础而重要的技术。

通过蛋白质提取实验，可以将动物组织中的目标蛋白质从其他成分中分离出来，并进一步进行纯化和分析。

本实验旨在从动物组织中提取目标蛋白质，并通过酸碱处理、超声波破碎等方法将其从细胞结构中释放出来。

随后，通过离心、过滤等步骤去除杂质，最终得到纯净的目标蛋白质样品。

分析实验设计1.准备工作：清洗实验器具，准备所需试剂和设备。

2.组织样品处理：将动物组织样品切碎，加入适量的缓冲液，并使用超声波破碎仪进行破碎处理。

3.细胞结构破坏：将样品经过酸碱处理，破坏细胞膜和核膜，使目标蛋白质从细胞结构中释放出来。

4.离心：通过离心将细胞碎片和大分子杂质沉淀下来。

5.过滤：使用微孔滤膜去除离心上清液中的小分子杂质。

6.浓缩：将过滤后的液体通过浓缩装置浓缩，得到较为纯净的目标蛋白质样品。

实验结果经过实验操作，我们成功从动物组织中提取到目标蛋白质。

通过酸碱处理和超声波破碎，可明显观察到组织样品的颜色变浑浊，并且在显微镜下可以看到细胞结构的破坏。

离心后，观察到底部沉淀物呈现白色，上清液呈现澄清状态。

经过过滤和浓缩处理后，得到了一定量的目标蛋白质样品。

结果分析通过本实验提取的动物组织蛋白质样品可以用于进一步的纯化和分析。

可以使用电泳技术对提取的蛋白质样品进行分子量分析，以确定目标蛋白质的大小。

此外，还可以使用Western blot等技术检测目标蛋白质在组织中的表达水平，从而研究其在生理或病理状态下的变化。

建议1.实验操作过程中要注意严格控制温度和时间，避免蛋白质降解。

2.在选择缓冲液和酸碱处理条件时，要根据目标蛋白质的特性进行优化，以提高提取效果。

3.在离心和过滤步骤中要注意操作技巧，避免杂质的混入。

4.可以尝试不同的浓缩方法和设备，以提高样品纯度和浓度。

Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×106的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS 500ul重悬洗一次，转至500ul EP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按每1×106的细胞加50ul loading buffer 加入2×loading；5.V ortex一下，煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝；6.每次煮好将其放于冰上，静置约2min，V ortex一下，再甩一下；7.三次后用枪吸起，如没有粘丝，即可；8.每次上样约5ul（50ug/ul蛋白）RIPA裂解抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×107的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS 1ml重悬洗2次，转至1.5ml EP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按照如下比例加入裂解试剂：RIPA：300ul/1×107细胞PMSF：3ul(1:100)Cocktail ：0.3ul(1:1000)5.吹打均匀，冰上放置30-40min，中间每10分钟V ortex一次；6.4℃预冷离心：10000rpm ×10min；7.收集上清，转移至已预冷新EP管，即为总蛋白。

【为了浓缩蛋白，加RIPA的量改为200ul或者更低，可稍微延长冰上裂解时间，而RIPA（1）＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）的比例不变】核，浆蛋白抽提Protocol一.收核-浆蛋白收浆蛋白1.细胞计数（约1.5×107的细胞），离心收集细胞（1100rpm×5min）；2.用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mL的EP管中，离心（4000rpm×5min，4℃）；3.去上清，加入A Buffer1mL/1×107 cell，重悬，4℃放置10min，离心（2500rpm×3min，4℃）；4.去上清，加入A’Buffer250uL/1.5×107cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸取上清（上清是浆蛋白）；收核蛋白5.再用A’ Buffer 500uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干净；6.剩余沉淀中加入B’Buffer (或者RAPI)50uL，重悬（振荡），4℃放置40min（每隔10min振荡一次）；7.离心（12000×10min，4℃），取上清即为核蛋白，－80℃保存。

Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×106的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS 500ul重悬洗一次，转至500ul EP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按每1×106的细胞加50ul loading buffer 加入2×loading；5.V ortex一下，煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝；6.每次煮好将其放于冰上，静置约2min，V ortex一下，再甩一下；7.三次后用枪吸起，如没有粘丝，即可；8.每次上样约5ul（50ug/ul蛋白）RIPA裂解抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×107的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS 1ml重悬洗2次，转至1.5ml EP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按照如下比例加入裂解试剂：RIPA：300ul/1×107细胞PMSF：3ul(1:100)Cocktail ：0.3ul(1:1000)5.吹打均匀，冰上放置30-40min，中间每10分钟V ortex一次；6.4℃预冷离心：10000rpm ×10min；7.收集上清，转移至已预冷新EP管，即为总蛋白。

【为了浓缩蛋白，加RIPA的量改为200ul或者更低，可稍微延长冰上裂解时间，而RIPA（1）＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）的比例不变】核，浆蛋白抽提Protocol一.收核-浆蛋白收浆蛋白1.细胞计数（约1.5×107的细胞），离心收集细胞（1100rpm×5min）；2.用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mL的EP管中，离心（4000rpm×5min，4℃）；3.去上清，加入A Buffer1mL/1×107 cell，重悬，4℃放置10min，离心（2500rpm×3min，4℃）；4.去上清，加入A’Buffer250uL/1.5×107cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸取上清（上清是浆蛋白）；收核蛋白5.再用A’ Buffer 500uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干净；6.剩余沉淀中加入B’Buffer (或者RAPI)50uL，重悬（振荡），4℃放置40min（每隔10min振荡一次）；7.离心（12000×10min，4℃），取上清即为核蛋白，－80℃保存。

Western blot 之蛋白提取（protocol）一、蛋白提取准备：冰浴盒、冰、小烧杯、EP管（1.5ml）、小镊子、RIPA裂解液（4℃保存，试剂盒中含PMSF，-20℃保存）、蛋白酶抑制剂（protease inhibitor tablets）、磷酸酶抑制剂（phosphatase Inhibitor cocktail 3）、15ml离心管(裂解液)、移液器、超声粉碎机、低温高速离心机、BCA蛋白定量试剂盒、96孔板、酶标仪、4×蛋白上样缓冲液（分装1ml/管，-20℃保存）、二、蛋白提取操作：1. -80℃取出组织，冰上复温；由冻存管移入1.5mlEP管，并重新编号；（1、2、3、4、5、6分别为sham、3h、12h、24h、3d、7d）2. 加裂解液;a、裂解液配制：(10mlRIPA（4℃）+100ulPMSF（-20℃）+100ul蛋白酶抑制剂（4℃ 10×、1×）+1-2ul磷酸酶抑制剂)注：磷酸酶抑制剂作用是保护已磷酸化蛋白，避免其降解破坏，所以加之有益无害。

b、加入EP管，1mg：10-20ul；（400ul/EP管，不要求精确）3. 匀浆；机械（电动匀浆机）；超声粉碎机√附：超声粉碎机操作：a、打开电源；b、确认设置；（默认）c、蒸馏水清洗机头；（每次换样本均要清洗、避免污染、并擦干）d、匀浆；（电源键控制机头启停，装有标本的1.5mlEP管置入小烧杯冰浴中，匀浆过程反复上下活动，充分匀浆组织）4. 冰浴静置30分钟；（再加裂解液600ul至总量1000ul；）5. 预开机制冷，12000rpm，4℃，离心20分钟；离心结束后，取上清至新1.5mlEP管；附：低温高速离心机操作：a、开机；b、设置speed、time、temp，注意ROTOR内外对应；12154（1.5ml或2mlEP管）c、温度降至预设温度后，配平，开始；6. BCA试剂盒蛋白定量a．配制工作液；BCA试剂：CU试剂=50:1（5mlBCA+100ulCU）；（标准品数量+样品数量）×200ul；充分混匀，24小时室温稳定；b．各孔加BCA工作液200ul；c、稀释标准品；（0.5mlEP管）①90ulPBS稀释液+10ulBSA标准品（-20℃），至100ul，浓度0.5mg/ml；②加稀释后的标准品至96微孔板标准孔中：20、16、12、 8、 6、 4、 2、 0 ul加PBS补足至20ul：0、 4、 8、12、14、16、18、20 ul实际浓度：0.5、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.05、0mg/mld、样品稀释；（0.5mlEP管）（尽可能让样品点落在标准线1/2后）,样品量不能少于2ul，否则误差太大。

实验一动物组织蛋白质的提取【目的要求】1、掌握动物组织蛋白质的提取方法。

2、了解动物组织蛋白质提取的原理。

【实验原理】由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。

但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。

因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。

蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。

故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。

温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。

提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。

但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化液等）中，可以不必经过提取直接进行分离。

蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。

蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。

本实验采用CWBio公司的蛋白抽提试剂盒（该试剂盒带有蛋白酶抑制剂混合物，可有效避免蛋白提取过程中蛋白的降解。

）提取动物组织总蛋白。

【试剂器材】动物组织、蛋白提取试剂盒、1.5 ml离心管、-20℃储存的冰块【操作步骤】1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。

2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。

3、10,000×g 离心15分钟。

4、收集上清，进行下一步的实验。

【注意事项】在整个制备过程中使组织始终置于冰上，以防蛋白质的降解。

的浓度。

蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。

以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。

由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。

常用抑制剂PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride（剧毒）1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);2)10mg/ml溶于异丙醇中;3)在室温下可保存一年; 2-8℃可以存放数月之久。

欲长期保存，可冻存在-20℃4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 储存液浓度为100或200mM5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。

EDTA1)抑制金属蛋白水解酶;2)0.5mol/L水溶液，pH8~9; 3)溶液在4℃稳定六个月以上;4)工作浓度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml);5)加入NaOH调节溶液的pH值，否则EDTA不溶解。

胃蛋白酶抑制剂(pepstantin)l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶;2)1mg/ml溶于甲醇中;3}储存液在4℃一周内稳定，-20℃稳定6个月; 4)1作浓度:0.7ug/ml(1umol/L) 5)在水中不溶解。

亮抑蛋白酶肽(leupeptin)1)抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶B;2)lOmg/ml溶于水;3)储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月; 4)工作浓度0.5mg/ml。

胰蛋白酶抑制剂(aprotinin)1)抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;2)lOmg/ml溶于水，pH7~83}储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月; 4)工作浓度:0.06~2.0ug/ml(0.01~0.3umol/L); 5)避免反复冻融:6)在pH 12.8时失活。

动物组织蛋白提取实验报告蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它们在细胞的结构和功能中起着重要的作用。

因此，研究蛋白质的结构和功能对于生命科学的发展至关重要。

本实验旨在提取动物组织中的蛋白质，为后续的蛋白质分析和研究打下基础。

实验步骤：1.准备样品：取新鲜的动物组织，如肝脏、肌肉等，用生理盐水清洗干净，切成小块备用。

2.制备提取液：将10mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）中加入1mM EDTA、1mM PMSF、1% Triton X-100等蛋白酶抑制剂和表面活性剂，制成提取液。

3.组织破碎：将组织块加入提取液中，用超声波或搅拌器等方法破碎组织细胞，使蛋白质释放到提取液中。

4.离心：将破碎后的混合液离心，分离出上清液和沉淀。

5.测定蛋白质浓度：用Bradford方法或Lowry方法等测定蛋白质浓度。

实验结果：经过提取和测定，我们成功地从动物组织中提取出了蛋白质。

通过测定蛋白质浓度，我们发现提取液中的蛋白质浓度较高，可以用于后续的蛋白质分析和研究。

实验总结：本实验通过提取动物组织中的蛋白质，为后续的蛋白质分析和研究打下了基础。

在实验过程中，我们需要注意以下几点：1.组织的选择和处理：不同的组织中含有不同种类和含量的蛋白质，因此在选择组织时需要考虑后续研究的需要。

同时，在处理组织时需要注意避免蛋白质的降解和氧化。

2.提取液的制备：提取液中的蛋白酶抑制剂和表面活性剂可以保护蛋白质不被降解和聚集，提高提取效率。

3.测定蛋白质浓度：蛋白质浓度的测定方法需要选择合适的试剂和标准曲线，同时需要注意样品的稀释和干扰物的去除。

本实验为我们提供了一种简单、快速、有效的动物组织蛋白提取方法，为后续的蛋白质研究提供了可靠的基础。

组织蛋白提取编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（组织蛋白提取）的内容能够给您的工作和学习带来便利。

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本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为组织蛋白提取的全部内容。

鼠脑组织总蛋白提取一：蛋白提取1.脑组织称重，按照1:8（1g脑组织加8ml)的比例计算蛋白酶抑制剂的量（Aprotinin 、Pepstatin、NaF、Na3VO4、Leupeptin ，PMSF不稳定最后取出来加,都是1:100的稀释）和TNE的量，先在每个EP管中加入计算好的TNE再加蛋白酶抑制剂，每个ＥＰ管中加入３颗珠子,用匀浆器匀浆或用研磨棒研磨。

（蛋白酶抑制剂五种从-20拿到4度冰箱中溶解。

各取100微升加入10毫升的TNE中（13层析柜中)，TNE缓冲液（1.21g Tris，5.84g NaCl,0。

37g EDTA/升)，2.匀浆完毕后用枪头将混合好的溶液吸入EP管，一般大块组织加600微,小块加300微，4°离心14000转/min,20min。

3。

取上清移入新EP管(最好离两次) ，溴酚蓝·甘油·SDS·巯基乙醇等组成sample buffer（4X)，Sample Buffer与蛋白比为3:1，在97度煮5分钟。

防止盖子开，最好用东西盖住。

始终在冰盒中操作，最后蛋白放入—80。

二：测蛋白浓度计算所需BCA的量，按MA：MB:MC=25：24：1的比例配好，每个孔总量为300ul,BSA：A-I各加150ul，Mix加150ul因BSA是溶解在NaCl,故加样时蛋白溶液和0.9％NaCl共加150ul（蛋白3ul,NaCl 147ul)注意加样时要加复孔。

动物固体组织蛋白提取Protocol1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。

早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干：也可放入烤箱中，速度校快。

2、裂解液配制：RIPA： PMSF=100： U 现配f见用「（lOOOulRIPA+lOulPMSF）^ 謹入49冰上。

3、抽蛋白（应冰上进行）：a.适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。

一般10ml管体系中加入：7~8粒磁珠、lOOmg组织、lnilRIPA+1 OulPMSF、I tablet Cocktail。

b、匀浆。

手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂宜插入套管中，上下转动研磨数十次（6〜8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

机器匀浆：用组织捣碎机10000〜15000r/mm上下研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3〜5次，在冰水中进行），皮缺、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep 150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3〜5次。

反复冻融：培养或考分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。

C、将组织匀浆转入1.5ml的EP管中（cppendorf管、离心管）。

12000r/min 4°C离心15min.d、离心后EP管中液体分三层，提取中间无色液相•移入新的EP管中。

«J-8OX；保存。

4、蛋白浓度测左。

a、配工作液：溶液A：溶液B=50： 1 （200U1： 4ul）。

实验一动物组织蛋白质的提取【目的要求】1、掌握动物组织蛋白质的提取方法。

2、了解动物组织蛋白质提取的原理。

【实验原理】由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。

但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。

因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。

蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。

故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。

温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。

提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。

但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化液等）中，可以不必经过提取直接进行分离。

蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。

蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。

本实验采用CWBio公司的蛋白抽提试剂盒（该试剂盒带有蛋白酶抑制剂混合物，可有效避免蛋白提取过程中蛋白的降解。

）提取动物组织总蛋白。

【试剂器材】动物组织、蛋白提取试剂盒、1.5 ml离心管、-20℃储存的冰块【操作步骤】1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。

2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。

3、10,000×g 离心15分钟。

4、收集上清，进行下一步的实验。

【注意事项】在整个制备过程中使组织始终置于冰上，以防蛋白质的降解。

固体组织蛋白提取•相关推荐固体组织蛋白提取固体组织蛋白提取1. 每100mg固体组织剪碎后加入0.5 ml裂解液，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。

注意：初始组织的量应在10-100mg范围。

肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量的组织，否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。

2. 取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管，加2倍体积的(1 ml)抽提试剂充分混匀。

室温或4℃静置10分钟，偶尔晃动。

注意：(1)组织量<10mg且静置时间短30min，在下一步离心时所形成的蛋白膜易碎，此时可静置30min。

(2)提取脂肪组织时应4℃静置40min以上以充分去除油脂。

3. 10,000g 4℃离心10分钟，溶液分为两相，中间为蛋白膜。

吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。

蛋白膜将附着于离心管壁。

注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。

(2)如果初始组织量较少(<10mg)，离心后难以得到完整的蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入0.5-0.8ml纯乙醇混匀，10,000g 4℃离心5分钟。

弃所有液体，蛋白沉淀在管底。

4. 敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。

5. 每100mg组织所得到的蛋白加 200ml用户自备的缓冲液，95℃煮10分钟。

室温放置20分钟溶解沉淀。

注意：(1)可4℃过夜溶解沉淀，偶有少量不溶性组织纤维碎片可离心去除。

(2)有时染色体DNA可与蛋白质一起被抽提出来，溶解时则形成粘稠物。

延长95℃热变性时间、不时振荡、用注射针头反复抽吸，有助于彻底打断DNA。

3．样本组织RNA提取：取液氮保存的肺组织，研碎后加入RNAisoTMPlus，将研碎的样品完全覆盖，室温静置至样品完全融化，在研磨至裂解液呈透明状。

移至离心管后加入l／5l埘AisoTMPlus体积量的氯仿，用力振荡后移至离心管中，室温静置5min。

资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载蛋白提取步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容提蛋白及WB的步骤整个过程细胞或蛋白都必须放冰上准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记1.5ml 离心管及0.6ml 离心管、细胞刮板、开低温高速离心机细胞裂解液配制：1ml cell lysis10ul NP-40（离心机后）25ul 焦磷酸钠40ul NaF1ul β-甘油磷酸2 ul Na3VO41ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱）10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒）细胞裂解和收集观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。

将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加0.1ml ），冰上静置1-2min。

刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。

细胞破碎超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。

（超声波破碎仪的铁棒不要碰到离心管的壁和底部）超声波设置：工作功率5% 工作时间3min开机时间15s，关机时间30s温度0度，报警温度1度4℃、13000r/min，离心15min。

（离心机用后一直保持打开的状态，）蛋白保存蛋白保存及分装：吸上清液至0.6ml离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。

-80℃保存。

注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。

样品处理超过1h，补加一次。

BCA测定蛋白浓度测空白板，选差异较小的孔。