4 2014 叶绿体色素含量的测定

叶绿体色素含量的测定叶绿体色素含量的测定，这听起来像是科学家的秘密任务，其实说白了就是要看看植物里那些神奇的绿色成分有多少。

大家都知道，植物的颜色基本上是靠叶绿素撑起来的，没了它，植物也就变得跟枯树一样无趣。

所以，今天我们就来聊聊，怎么在实验室里动手动脚，测测这些色素的含量。

我们得准备好一系列工具。

想象一下，实验室里一片忙碌的景象，试管、烧杯、移液管，全都整齐地排开。

嘿，这可不是大厨的厨房，而是科学家们的“战场”。

我们要做的第一步，就是找些新鲜的植物叶子。

最好是那些绿得发亮的，不然会让你失望得想哭。

选好了叶子，接下来就要把它们磨碎，变成一堆绿色的糊状物。

这个过程就像是在做绿豆沙，越细腻越好，嘿嘿。

我们要用溶剂把这些色素提取出来。

这里可有讲究，不同的溶剂对色素的提取效果可是大相径庭。

有的可能会让你的色素提取得像黄金一样闪闪发光，而有的则可能让你一脸无奈，只能看着那些植物的色素慢慢溜走。

你要小心啊，不然就像做饭时放盐放多了，糟糕透了。

提取完色素，我们就可以开始测量了。

这一步可是最关键的，直接关系到你这次实验能不能算成功。

通常，我们会用分光光度计来测量色素的吸光度。

这玩意儿就像是植物的“身份证”，能告诉你它们的色素含量。

调好仪器，按下按钮，看着屏幕上出现的数字，简直就像看电影的高兴部分，紧张又兴奋。

得出的数据只是个开始。

接下来就是分析和计算，估算一下叶绿素的含量。

你得带上你的计算器，准备好数一数。

可别小看这个过程，跟做数学题差不多，有时候还得使点小心思。

算得越精确，越能说明你这次实验的“底气”，就像考卷上的分数，关乎你的荣誉。

如果一切顺利，得到的结果让你满意，那真是高兴得像打了胜仗一样。

想想那些努力磨碎叶子、提取色素的日子，突然觉得一切都是值得的。

可如果结果不如预期，那也没关系，科学就是这样，有时候就是得经历点“波折”。

总结经验，下次努力不懈，才能攀上更高的峰顶。

叶绿体色素含量的测定不仅仅是个实验，更像是一场冒险之旅。

实验四：叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定实验目的1、了解叶绿素分离与提取的原理和方法2、了解它们的光学特性和理化性质3、了解叶绿素a、b含量测定的方法。

实验原理1.脂溶性叶绿体色素提取：可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

2.分离：（1）叶绿体色素的分离＜纸层析法＞因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。

由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。

（2）叶绿素与类胡萝卜素的分离<皂化反应>叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。

3.叶绿素a、b含量的测定：根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度L成正比，即：A=φCL(φ为吸光系数) 因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。

测定663nm 和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。

其校正过的公式为：Ca＝12.7A663－2.69A645 Ca:叶绿素a浓度,mg/LCb＝22.9A645－4.68A663 Cb:叶绿素b浓度,mg/LCT＝Ca + Cb CT:叶绿素总浓度,mg/L实验器材：1、仪器：剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试管、毛细管、平底大试管、天平、研钵、滤纸2、试剂：石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液3、材料：菠菜实验步骤：1、叶绿素的提取称取去中脉叶片2g左右，剪碎放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成浆，再加入丙酮10ml，用漏斗过滤即为色素提取液，暗处备用。

叶绿体色素的提取、分离及含量测定实验目的叶绿素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。

叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。

叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。

另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。

因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。

实验原理从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。

利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇提取。

分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。

纸层析是其中最简单的一种。

当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。

强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。

而离体的叶绿素提取液中不含有还原酶，光产生的强氧化物质会破坏叶绿素。

叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。

A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.75Ca+45.60Cb（2）公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。

叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL式中：α比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。

各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。

这就是吸光度的加和性。

今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。

在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。

已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm 处的吸光系数分别为16.75和45.60。

根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2）式（1） （2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。

解方程（1） （2）组得C a =12.72 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C TC T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—8.05 A 663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝5.341000652 A (6)有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。

叶绿体色素含量的测定——分光光度法叶绿体色素含量的测定——分光光度法叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。

因此，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中各色素浓度，不同溶剂所提取的色素吸收光谱有差异，因此，应使用不同的计算公式。

叶绿体色素的提取常用丙酮和乙醇有机溶剂。

叶绿体色素80 ％丙酮提取液中叶绿素a 和 b 及类胡萝卜素分别在663nm 、646nm 和470nm 波长下有最大吸收峰，而95 ％乙醇提取液中它们则在665nm 石49nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素丙酮（或乙醇）提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。

[ 实验目的]掌握分光光度法对植物叶绿体色素提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度测定与计算方法，以及植物材料中各种色素含量的求算方法。

[ 器材和试剂]1 ．植物材料新鲜（或烘干）植物叶片，如菠菜叶片等。

2 ．实验器材分光光度计、天平、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、棕色容量瓶、吸水纸、擦镜纸和滴管。

3 ．实验试剂80 ％丙酮（或95 ％乙醇）、石英砂和碳酸钙粉。

[ 操作步骤］1 ．色素的提取①称取新鲜（或干材料）的洗净擦于的植物叶片0.5g （或一定面积），去中脉、剪碎后放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml80 ％丙酮（或95 ％乙醇），冰浴中研磨至组织变白，再加丙酮10ml ，研成匀浆，暗处静置约10m in 。

②将提取液过滤到50 ml 棕色容量瓶中，用丙酮反复冲洗研体与研棒数次并用少量丙酮反复冲洗滤纸和残渣，直至无绿色为止，以使色素全部转移入容量瓶。

最后用丙酮定容至50 ml ，摇匀，并保存于暗处备用待测。

叶绿素含量的测定及计算叶绿素含量的测定及计算方法如下：1. 原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

2. 计算公式：根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：A=acl。

式中：a为比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a 为该物质的吸光系数。

各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。

3. 测定波长的选择：在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a、h的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663 nm 和645 nm，又知在波长663 nm下，叶绿素a、b在该溶液中的吸光系数分别为82.04和9.27，在波长645 nm下分别为16.75和45.60。

4. 计算：叶绿素a（Ca）、叶绿素b（Cb）和类胡萝卜素（Cx）的浓度可以根据测定的波长吸光度计算得出。

计算公式如下：Ca=（13.95*A665-6.88*A649）；Cb=（24.96*A649-7.32*A665）；Cx=（1000*A470-2.05*Ca-114.8*Cb）/245。

5. 叶绿素含量计算：根据求得的色素浓度（mg/L），再计算出各色素含量（mg/g鲜重表示）。

叶绿素含量（mg/g）=（色素浓度mg/L * 提取液体积ml * 稀释倍数）/(1000 * 样品鲜重g)。

上述信息仅供参考，如果想要获取更多关于叶绿素含量测定的专业指导，可以查阅相关的学术文献或者咨询专业科研人员。

叶绿体色素测定方法实验、植物叶绿素含量测定----丙酮提取法沈阳农业大学：高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。

叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。

叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。

叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反j 叶片生理状态的重要指标。

在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。

叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。

[原理]叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂。

它可以通过研磨或用各种有机溶剂浸泡来提取，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜。

叶绿色素在特定的萃取溶液中对特定波长的光有最大的吸收。

用分光光度计测量该波长下叶绿素溶液的吸光度（也称光密度），然后根据该波长下叶绿素的吸收系数计算叶绿素含量。

利用分光光计测定叶绿素含量的依据是lambert-beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。

其数学表达式为：a=kbc式中：a为吸光度；k为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。

叶绿素a和B丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别为663nm和645nm。

叶绿素a和B在663nm处（溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为GL-1）的吸收系数分别为82.04和9.27；在645nm处的吸收系数分别为16.75和45.60。

根据朗伯-比尔定律，叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（a663和a645）与叶绿素a之间的关系，B和溶液中的总浓度（a+B）（CA，CB，CA+B，单位：GL-1）可以用以下方程式表示：a663=82.04ca+9.27cb （1）a645=16.76ca+45.60cb（2）解方程（1）和（2）：ca=12.7a663―2.59a645(3)cb=22.9a645―4.67a663(4)ca+b＝20.3a645－8.04a663（5）从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。

实验四植物叶绿体色素含量的测定高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素吸收的。

叶绿体色素含量与光合作用密切相关，是反应叶片生理状态的重要指标。

在植物光和生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。

叶绿素含量也是知道作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。

一、原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公事计算出提取液中个色素的含量。

根据朗博—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A=aCL。

式中：a为比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a为该物质的吸光系数。

各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合溶液在某一波长下的吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。

这就是吸光度的加和性。

今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿体a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。

在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

二、植物材料、仪器设备及试剂配制：（一）植物材料：完全液和缺素溶液培养的烟草苗叶片（二）仪器设备：分光光度计、电子天平、剪刀1把、镊子一把、玻璃研钵2个、4个25mL具塞棕色容量瓶、漏斗2个、移液管若干只、吸球、洗瓶、玻璃棒、吸水纸、保鲜膜等。

（三）试剂配制：95%乙醇（分析纯）、石英砂和碳酸钙三、实验步骤：1.称取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2.称取剪碎的新鲜叶片0.2g，共4份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及2mL95%乙醇，研成匀浆，在加入乙醇10mL，继续研磨至组织变白。

静置3~5min。

3.取滤纸1张，置漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗钵体、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

叶绿素含量的测定ﻫ一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯—比尔定律,某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 与液层厚度Ｌ成正比,即A ＝αCL式中:α比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1ｃｍ时,α为该物质的吸光系数。

各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总与。

这就就是吸光度的加与性。

今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 与类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。

在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a 、叶绿素b 的8０%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于6６３、６45nm 处。

已知在波长66３nm 下叶绿素a 、叶绿素ｂ在该溶液中的吸光系数的分别为８2.04与９、27;在波长645n ｍ处的吸光系数分别为1６、75与45.60。

根据加与性原则列出以下关系式:A663=82、04Ca+9、2７Ｃb (1) A645＝16、76Ca+4５、6０Cb (２)式(1) (2)A 6６３nm 与Ａ６45nm 为叶绿素溶液在66３nm 与６45n ｍ处的吸光度,C ａ C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度,以m ｇ/L 为单位。

解方程(1) (2)组得Ｃa =12.72 A 663—2、59 A 64５ (3) C b =22、８８ A ６４５—4、67 Ａ６63 (4) 将Ｃa +Ｃb 相加即得叶绿素总量C ＴC T ＝ C a 十C b ＝20、２９A 645—8、0５ Ａ66３ (5)从公式(３)、(4)、(5)可以瞧出,,就可计算出提取液中的叶绿素ａ、b 浓度另外,由于叶绿素ａ 叶绿素b 在６5２ｎｍ的吸收峰相交,两者有相同的吸光系数(均为３0、５),也可以在此波长下测定一次吸光度(A 652)而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算: C T ＝5.341000652 A (６)有叶绿素存在的条件下,用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。