叶绿体色素含量的测定

叶绿体色素含量的测定叶绿体色素含量的测定，这听起来像是科学家的秘密任务，其实说白了就是要看看植物里那些神奇的绿色成分有多少。

大家都知道，植物的颜色基本上是靠叶绿素撑起来的，没了它，植物也就变得跟枯树一样无趣。

所以，今天我们就来聊聊，怎么在实验室里动手动脚，测测这些色素的含量。

我们得准备好一系列工具。

想象一下，实验室里一片忙碌的景象，试管、烧杯、移液管，全都整齐地排开。

嘿，这可不是大厨的厨房，而是科学家们的“战场”。

我们要做的第一步，就是找些新鲜的植物叶子。

最好是那些绿得发亮的，不然会让你失望得想哭。

选好了叶子，接下来就要把它们磨碎，变成一堆绿色的糊状物。

这个过程就像是在做绿豆沙，越细腻越好，嘿嘿。

我们要用溶剂把这些色素提取出来。

这里可有讲究，不同的溶剂对色素的提取效果可是大相径庭。

有的可能会让你的色素提取得像黄金一样闪闪发光，而有的则可能让你一脸无奈，只能看着那些植物的色素慢慢溜走。

你要小心啊，不然就像做饭时放盐放多了，糟糕透了。

提取完色素，我们就可以开始测量了。

这一步可是最关键的，直接关系到你这次实验能不能算成功。

通常，我们会用分光光度计来测量色素的吸光度。

这玩意儿就像是植物的“身份证”，能告诉你它们的色素含量。

调好仪器，按下按钮，看着屏幕上出现的数字，简直就像看电影的高兴部分，紧张又兴奋。

得出的数据只是个开始。

接下来就是分析和计算，估算一下叶绿素的含量。

你得带上你的计算器，准备好数一数。

可别小看这个过程，跟做数学题差不多，有时候还得使点小心思。

算得越精确，越能说明你这次实验的“底气”，就像考卷上的分数，关乎你的荣誉。

如果一切顺利，得到的结果让你满意，那真是高兴得像打了胜仗一样。

想想那些努力磨碎叶子、提取色素的日子，突然觉得一切都是值得的。

可如果结果不如预期，那也没关系，科学就是这样，有时候就是得经历点“波折”。

总结经验，下次努力不懈，才能攀上更高的峰顶。

叶绿体色素含量的测定不仅仅是个实验，更像是一场冒险之旅。

六、思考题
• 1、叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否 、叶绿素 、 在蓝光区也有吸收峰 在蓝光区也有吸收峰， 用这一吸收峰波长进行叶绿素ａ、ｂ的定 用这一吸收峰波长进行叶绿素ａ、ｂ的定 ａ、ｂ 量分析？为什么？ 量分析？为什么？ • 2、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80 、为什么提取叶绿素时干材料一定要用 ％的丙酮或乙醇，而新鲜的材料可以用无 的丙酮或乙醇， 水丙酮或乙醇提取？ 水丙酮或乙醇提取？
四、实验步骤
叶绿体色素是一种酯， 叶绿体色素是一种酯，因 此不溶于水。 此不溶于水。通常用含有少量 1.叶绿体色素的提 1.叶绿体色素的提 水的有机溶剂如80 的丙酮， 80％ 水的有机溶剂如80％的丙酮， 取 或者95%乙醇的混合液来提取 95%乙醇 或者95%乙醇的混合液来提取 叶片中的叶绿体色素， 叶片中的叶绿体色素，用于测 定叶绿体色素含量。 定叶绿体色素含量。 研磨法 之所以要用含有水的有机 溶剂提取叶绿体色素， 溶剂提取叶绿体色素，这是因 为叶绿体色素与蛋白质结合牢， 为叶绿体色素与蛋白质结合牢， 提取方法 需要经过水解作用才能被提取 出来。 出来。 浸提法
• 公式中 为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素 公式中Ca为叶绿素 的浓度 为叶绿素b 为叶绿素 的浓度， 为叶绿素 浓度（ 单位为g/L） ， 82.04和 9.27分别是 浓度 （ 单位为 ） 和 分别是 叶绿素a和叶绿素 在 叶绿素 和叶绿素b在663nm下的比吸收系 和叶绿素 下的比吸收系 浓度为1g/L， 光路宽度为 数 （ 浓度为 ， 光路宽度为1cm时的吸 时的吸 光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素 和 分别是叶绿素a和 光度值） 和 分别是叶绿素 叶绿素b在 下的比吸收系数。 叶绿素 在645nm下的比吸收系数。即混合 下的比吸收系数 液在某一波长下的光吸收等于各组分在此 波长下的光吸收之和

叶绿体色素的提取、分离 及含量测定
甄 毓 环境科学与工程学院
一、实验目的
掌握叶绿素的提取、分离和定量测定方法。 熟练掌握分光光度计的使用原理及其方法。
1. 2.
二、实验原理
1. 朗伯—比尔定律
某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即： D = kCL
9
式中：k为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1 cm 时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸 收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。
9
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于 各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。
2. 叶绿体色素的提取及分离

提取：叶绿体色素不易溶于水而易溶于有机溶剂特性--丙酮、 乙醇等有机溶剂提取。

色素分离：纸层析法分离。吸附剂对不同物质的吸附力不 同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动 相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度 不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
3. 定量测定

测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡 萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波 长下的光密度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜 素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。
9
以80%丙酮为提取液测定663 nm和645 nm下吸光度即可用下 列公式计算出提取液中各色素的含量。 Ca=12.72D663 - 2.59D645 Cb=22.88D645 - 4.67D663 （ 1） （ 2）
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点样：取前端剪成三角形的滤纸条，用 毛细管取叶绿素提取液，如图点样于 “色 点”处，注意每次所点溶液不可过多，点 样后晾干，再重复操作2～3次。 分离：在大试管中加入推动剂，然后将 滤纸固定于胶塞上，插入试管中，使尖 端浸入溶剂内盖紧胶塞，直立于阴暗处 层析。 当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤 纸，风干，观察色带的分布。

浓度和总浓度代入公式（7）中求出所测材料 单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含 量。
叶片洗净、吸干、去大叶脉 ↓ 称0.5g叶用乙醇或丙酮研磨 ↓ 匀浆过滤（用乙醇或丙酮洗研钵及残渣，合并滤液） ↓ 滤液用乙醇或丙酮定容至25mL ↓ 置分光光度计测定 (注意:不同提取溶剂波长不同)
四. 结果计算
注意分光光度计的规范使用

六. 思考题

为什么植物在不同生长环境下其 Chl含量 有差异？ Chla /Chlb有何适应意义？
实验二. 叶绿素含量的测定
高等植物光合作用过程中利用的光能是 通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿 体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素 和叶黄素组成。 在植物光合生理、发育生理和抗性生理 研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿 素含量也是指导作物栽培生产和选育作 物品种的重要指标。

一.实验原理
组织变白，在暗处静止3-5min后，用滤纸过滤
到25ml容量瓶中。
注意：用滴管吸取96%乙醇或80%丙酮将研钵洗净，
清洗液也要过滤到容量瓶中，并用96%乙醇或 80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残 渣全部变白后，用96%乙醇或80%丙酮定容至刻 度。
3．读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注 意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素 提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触 比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒
4.1 结果计算
C(mg/L)×提取液总量（L）×稀释倍数
Chl = (mg/g叶)
材料鲜重（g）
4.2 比较分析不同植物的叶绿素含量差异及同 种植物在不同生长环境下Chla/Chlb差异。
五. 注意事项

注意叶绿素一定要提干净，避免造成测定误差

叶绿素含量的测定实验报告一、实验目的1、掌握叶绿素含量测定的原理和方法。

2、学会使用分光光度计测定叶绿素的含量。

3、了解叶绿素在植物光合作用中的重要作用。

二、实验原理叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，包括叶绿素 a 和叶绿素 b 两种类型。

叶绿素在特定波长的光下有吸收峰，利用分光光度计分别测定叶绿素提取液在 665nm 和 649nm 波长下的吸光度，根据朗伯比尔定律，可以计算出叶绿素 a 和叶绿素 b 的含量，进而得出叶绿素的总含量。

叶绿素 a 和叶绿素 b 在 665nm 和 649nm 波长下的吸光系数分别为8331 和 1675，在 649nm 波长下的吸光系数分别为 2454 和 4466。

三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的菠菜叶片。

2、实验仪器分光光度计、电子天平、研钵、漏斗、容量瓶、移液管、剪刀等。

3、实验试剂95%乙醇、石英砂、碳酸钙。

四、实验步骤1、材料准备选取新鲜的菠菜叶片，用剪刀剪碎，称取 05g 左右，放入研钵中。

2、研磨提取在研钵中加入少量石英砂和碳酸钙，以及 10ml 95%乙醇，充分研磨成匀浆。

3、过滤将研磨好的匀浆用漏斗过滤到 25ml 容量瓶中，用少量 95%乙醇冲洗研钵和漏斗，将滤液收集到容量瓶中，直至刻度线，摇匀。

4、吸光度测定以 95%乙醇作为空白对照，用分光光度计分别测定提取液在 665nm 和 649nm 波长下的吸光度，每个波长重复测定 3 次，取平均值。

五、实验结果与计算1、记录吸光度值665nm 波长下的吸光度平均值记为 A665，649nm 波长下的吸光度平均值记为 A649。

2、计算叶绿素含量叶绿素 a 的浓度（Ca，mg/L）＝ 1395×A665 688×A649叶绿素 b 的浓度（Cb，mg/L）＝ 2496×A649 732×A665叶绿素的总浓度（C，mg/L）＝ Ca ＋ Cb叶绿素含量（mg/g）＝（C×V）／（W×1000）其中，V 为提取液总体积（ml），W 为叶片鲜重（g）。

思考题
• 1、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮， 而新鲜的材料可以用无水丙酮提取? • 2、叶绿素的提取中加入碳酸钙、石英砂各有什么作 用？ • 3 、叶绿素 a 、 b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一 吸收峰波长进行叶绿素 a 、 b 的定量分析 ? 为什么 ?
三、实验步骤
• 1. 取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中 脉），混匀。 • 2. 称取剪碎的新鲜样品 0.5 g ，分别放入研钵中，加入少 量石英砂和碳酸钙粉及 5ml丙酮，研成匀浆，再加80∮丙 酮5 mL ，继续研磨至组织变白，静止 3 ～ 5 min 。 • 3. 取滤纸 1 张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒把提取 液倒入漏斗中，过滤到 25mL 棕色容量瓶中，用少量乙醇 冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗 中。 • 4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量 瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至 25 mL ，摇匀。
• 另外，由于叶绿素 a 、 b 在 652mn 的吸收峰相交，两者 有相同的比吸收系数（均为 34.5 ），也可以在此波长下 测定一次消光度（ D 652 ）而求出叶绿素 a 、 b 总量： • C T = （ D 652 × 1000 ）／ 34.5 （ 7） • 在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法也可以同时测定 出溶液中类胡萝卜素的含量。 Lichtenthaler 等对 Arnon 法进行了修正，提出了 80 ％丙酮提取液中 3 种色素含量 的计算公式： C a = 12.21D 663 – 2.81D 646 （ 8） C b = 20.13D 646 – 5.03D 663 （ 9） C x = （ 1000D 470 – 3.27C a – 104C b ）／ 229 （ 10 ） • 式中： C a 、 C b —叶绿素 a 和 b 的浓度。 C x —类胡萝卜素的总浓度。 • D 663 、 D 646 和 D 470 —叶绿体色素提取液在波长 663 nm 、 646 nm 和 470 nm 下的消光度。

植物叶绿体色素含量的测定实验四植物叶绿体色素含量的测定高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素吸收的。

叶绿体色素含量与光合作用密切相关，是反应叶片生理状态的重要指标。

在植物光和生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。

叶绿素含量也是知道作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。

一、原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公事计算出提取液中个色素的含量。

根据朗博—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A=aCL。

式中：a为比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a为该物质的吸光系数。

各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合溶液在某一波长下的吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。

这就是吸光度的加和性。

今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿体a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。

在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

二、植物材料、仪器设备及试剂配制：（一）植物材料：完全液和缺素溶液培养的烟草苗叶片（二）仪器设备：分光光度计、电子天平、剪刀1把、镊子一把、玻璃研钵2个、4个25mL具塞棕色容量瓶、漏斗2个、移液管若干只、吸球、洗瓶、玻璃棒、吸水纸、保鲜膜等。

（三）试剂配制：95%乙醇（分析纯）、石英砂和碳酸钙三、实验步骤：1.称取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2.称取剪碎的新鲜叶片0.2g，共4份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及2mL95%乙醇，研成匀浆，在加入乙醇10mL，继续研磨至组织变白。

静置3~5min。

3.取滤纸1张，置漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗钵体、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

实验四植物叶绿体色素含量的测定高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素吸收的。

叶绿体色素含量与光合作用密切相关，是反应叶片生理状态的重要指标。

在植物光和生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。

叶绿素含量也是知道作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。

一、原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公事计算出提取液中个色素的含量。

根据朗博—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A=aCL。

式中：a为比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a为该物质的吸光系数。

各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合溶液在某一波长下的吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。

这就是吸光度的加和性。

今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿体a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。

在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

二、植物材料、仪器设备及试剂配制：（一）植物材料：完全液和缺素溶液培养的烟草苗叶片（二）仪器设备：分光光度计、电子天平、剪刀1把、镊子一把、玻璃研钵2个、4个25mL具塞棕色容量瓶、漏斗2个、移液管若干只、吸球、洗瓶、玻璃棒、吸水纸、保鲜膜等。

（三）试剂配制：95%乙醇（分析纯）、石英砂和碳酸钙三、实验步骤：1.称取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2.称取剪碎的新鲜叶片0.2g，共4份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及2mL95%乙醇，研成匀浆，在加入乙醇10mL，继续研磨至组织变白。

静置3~5min。

3.取滤纸1张，置漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗钵体、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

植物叶绿体色素的提取、分离、及含量测定（一）叶绿体色素的提取一、实验目的1．掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。

2．了解皂化-萃取提取β−胡萝卜素原理。

3. 了解1,4-二氧六环沉淀法提取叶绿素原理。

二、实验原理植物光合作用是自然界最重要的现象，它是人类所利用能量的主要来源。

在把光能转化为化学能的光合作用过程中，叶绿体色素起着重要的作用。

高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、β−胡萝卜素和叶黄素四种。

它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表12.1。

叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转变为化学能。

叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。

在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。

叶绿素的基本结构见图47.1。

在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。

在叶绿素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。

类胡萝卜素(carotenoids)是一类不饱和的四萜类碳氢化合物（例如胡萝卜素，carotenes)，或它们的氧化衍生物（例如叶黄素类，xanthophylls)。

所有的类胡萝卜素均源于非环状的C40H56结构。

类胡萝卜素在强光下可防止叶绿素的光氧化；在弱光下，可作为辅助色素吸收光能并传递给叶绿素分子。

胡萝卜素有三种异构体，即α−、β−和γ−胡萝卜素，其中β−胡萝卜素含量最多，也最为重要。

β−胡萝卜素还具有维生素A的生理活性，其结构是由两分子维生素A 在端链失去两分子水结合而成。

叶绿体色素的提取、分离及含量测定一、实验原理叶绿体色素是植物进行光合作用吸收光能的重要物质基础。

叶绿体色素主要包含叶绿素a, 叶绿素b,叶黄素和胡萝卜素。

利用四种不同色素在流动相（扩展剂）和固定相（滤纸中吸附的水）中的分配系数不同而将其分开；叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。

因此，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中各色素浓度，不同溶剂所提取的色素吸收光谱有差异，因此，应使用不同的计算公式。

叶绿体色素80％丙酮提取液中叶绿素a和b分别在663nm、646nm波长下有最大吸收峰，据此所测得的吸光值代入不同的经验公式，计算出叶绿体色素丙酮提取液中叶绿素a和b的浓度及总浓度，并依据所使用的单位植物组织，求算出色素的含量。

二、实验目的掌握用纸层析法提取分离叶绿体色素的原理和方法；掌握叶绿体色素提取液中叶绿素a和b的浓度及其总含量的测定与计算方法。

三、器材和试剂1、植物材料：新鲜菠菜2、实验器材：电子天平、分光光度计3、实验试剂：丙酮、扩展剂四、操作步骤1、色素的提取1）称取新鲜的洗净擦干的植物叶片0.5g ，去中脉、剪碎后放入研钵中，加少量石英沙和碳酸钙，再加入2ml 丙酮，研磨成匀浆后再加入4ml 丙酮，放暗处静置萃取5min 后过滤（取滤液进行纸层析），再用4ml80％丙酮冲洗研钵和研棒后也一并进行过滤2、纸层析1）准备滤纸2）点样3）层析 时间40分钟左右4）层析结果3、含量测定1）去除残渣，取上清液，用80％丙酮定容至10ml 。

2）取1ml 稀释溶液，加4ml80％丙酮稀释5倍。

3）吸光度的测定以80％丙酮为对照，分别测定663nm、646nm 波长下的光吸收值五、结果计算80％丙酮提取液中色素浓度计算公式：C a =12.21A 663-2.81A 646C b =20.13A 646-5.03A 663C T =C a +C b =17.32A 646＋7.18A 663浓度单位：mg/L单位植物组织中叶绿体色素的含量：叶绿体色素的含量＝色素的浓度（mg/L）×提取液体积（L）×稀释倍数/样品鲜重。

• 【附注】 叶绿体色素简便提取方法 • 采用上述研磨方法提取叶绿体色素，既费工费时， 又容易出现误差。为此，可采用乙醇–丙酮混合液 浸泡法。其方法是，将待测叶片剪碎，装入具塞 刻度试管中，加入乙醇–丙酮混合液（ 1 ∶ l ， v ／ v ） 10 mL ，使叶片完全浸入液体之中，加盖。 放置于暗处，如能置于 30 ～ 40 ℃温箱中更好。 当叶片完全变白时即可比色。此法简便易行，重 现性好，尤其适用于大量样品的测定。最好是在 浸泡过程中轻轻摇动几次。
式中： D 663 和 D 645 ：叶绿素溶液在波长 663nm 和 645nm 时的消光度； C a 和 C b ：叶绿素 a 和 b 的浓度mg/L 。 解方程组 （2）和 （ 3）得：
C a = 12.72D 663 – 2.59D 645 （ 4） C b = 22.88D 645 – 4.67D 663 （5 ） 将 C a 与 C b 相加即得叶绿素总量 C T ： C T = C a +C b =20.29D 645 + 8.05D 663 （ 6）
思考题
• 1、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮， 而新鲜的材料可以用无水丙酮提取? • 2、叶绿素的提取中加入碳酸钙、石英砂各有什么作 用？ • 3 、叶绿素 a 、 b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一 吸收峰波长进行叶绿素 a 、 b 的定量分析 ? 为什么 ?
• 四、结果计算 • 求得色素的浓度后再按下式计算组织中各 色素的含量（用每克鲜重或干重所含叶绿 体色素的毫克数表示）： • （ mg/g ）
• [ 注意事项 ] • 1. 为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研 磨时间应尽量短些。 2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在 710 或 750 nm 波长 下测量消光度，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时消 光度值的 5 ％，否则应重新过滤。 • 3. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长 精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差 l nm ， 则叶绿素 a 的测定误差为 2 ％，叶绿素 b 为 19 ％，使用 前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器 说明书外，还应以纯的叶绿素 a 和 b 来校正。4. 在使用 低档型号分光光度计（如： 72 、 125 、 721 型等）测定 叶绿素 a 、 b 含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差， 单色光的纯度低（± 5 ～ 7 nm ），与高中档仪器如岛津 UV-120 、 UV-240 等测定结果相比，叶绿素 a 的测定值 偏低，叶绿素 b 值偏高， a ／ b 比值严重偏小。因此， 使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校 正。

叶绿体色素含量的测定----分光光度法中文摘要：本实验利用菠菜叶作为原料用80%的丙酮提取叶绿体色素，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，带入公式计算出色素溶液中各色素浓度。

英文摘要：In this experiment , we used spinach leaves as raw material and used 80% of acetone to extract pigments from them ,and apply spectrophotometer at a particular wavelength to determine absorbance, then take the absorbance into the formula to calculate concentration of each pigment.实验原理：利用80%丙酮提取叶绿体色素，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是663nm、646nm和470nm。

根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出丙酮提取液中叶绿体色素含量。

实验目的：掌握分光光度法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。

实验器材和试剂：1、材料：菠菜叶片2、用具：分光光度计、天平、研钵、漏斗、剪刀、容量瓶、烧杯、滤纸、滴管等3、试剂：80%丙酮、石英砂和碳酸钙实验步骤：1.叶绿体色素的提取取新鲜菠菜叶片0.5克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入少许石英砂和CaCO3,再加入80%丙酮3ml,研磨成匀浆,再加80%丙酮10ml,静置10分钟;用漏斗滤去残渣,用丙酮反复冲洗研钵、残渣至无色;用容量瓶定容至50ml 。

2.吸光度的测定取光径1cm比色杯，注入上述叶绿素提取液,以80%丙酮注入另一同样的比色杯内作为空白对照,在波长663、646和470nm下测定吸光度。

3.结果计算依据下列丙酮提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。

实验二叶绿体色素吸收光谱曲线及含量的测定一、实验目的掌握分光光度计的使用方法，学会绘制叶绿体色素的吸收光谱曲线。

了解叶绿体色素含量测定的原理，掌握叶绿体色素含量测定的方法。

二、实验原理叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。

叶绿素吸收光谱最强的吸收区有两个：一个在波长640~660nm的红光部分，另一个在波长430~450nm的蓝紫光部分。

在光谱的橙光、黄光和绿光部分只有不明显的吸收带，其中尤以对绿光的吸收最少。

胡萝卜素和叶黄素的最大吸收带在蓝紫光部分，不吸收红光等长波的光。

根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：D＝KCLD：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度,K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm。

95 ％乙醇提取液中叶绿素a 和b 及类胡萝卜素分别在在665nm 、649nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素乙醇提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。

三、实验材料及器材仪器及试剂：研钵、量筒、滴定管、烧杯、比色杯、滤纸、脱脂棉、分光光度计、95%乙醇材料：菠菜叶片四、实验步骤1、提取称取1g菠菜叶片，加入少许95%乙醇，研磨，用量筒定容至25ml。

2、吸收光谱去1ml提取液，加3ml95%乙醇，置于比色杯中，用95%乙醇作为对照，在400~700nm 之间每隔20nm测一次光，记录波长和吸光度D于下表中，并在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线。

λ（nm）400 420 440 460 480 500 …... 600 620 640 660 680 700 A3、将色素提取液充分混匀后，取光径1cm 的比色杯，注入提取液，以95%乙醇作为空白对照，在波长665nm 、649nm 和470nm 下测定吸光度（、和）。

叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL式中：α比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。

各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。

这就是吸光度的加和性。

今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。

在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。

已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm 处的吸光系数分别为16.75和45.60。

根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2）式（1） （2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。

解方程（1） （2）组得C a =12.72 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C TC T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—8.05 A 663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝5.341000652 A (6)有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。

叶绿体色素的定量测定叶绿素含量的测定叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。

方法Ⅰ一、目的掌握叶绿素含量测定的基本原理和方法。

二、原理叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。

已知叶绿素a 、b在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。

因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a 、b的总量。

三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。

2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；漏斗；25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。

3. 试剂：95﹪乙醇、石英砂、碳酸钙粉。

四、实验步骤1. 叶绿素的提取称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml 95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。

2. 测定取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652 nm波长下读取吸光度（A）值。

五、计算值代入公式(1), 即可求得提取液中叶绿素浓度。

所得结将测得的吸光度A652果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg ·g－1Fw）。

A652C ( mg .ml－1 ) = ———— (1)34.5公式中： C —叶绿素（a 和b ）的总浓度( mg ·ml－1 )—表示在652nm 波长下测得叶绿素提取液的吸光度A65234.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm, 样品浓度为1g·L－1时的吸光度）。

C（mg.ml－1）×提取液总量（ml）叶绿素含量（mg .g－1Fw）= ———————————————— (2)样品鲜重（g）方法Ⅱ一、目的掌握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。