(完整word版)引物合成常见问题

引物篇（引物合成及各种问题总结）引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

引物设计常见问题与解答先看一下Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。

Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。

大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。

因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。

引物合成常规问题LG GROUP system office room 【LGA16H-LGYY-LGUA8Q8-LGA162】Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

(1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'-O H的保护基团D M T，获得游离的5'-O H；(2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-O H发生耦合反应；(3) 封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；(4)氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。

Q2.引物合成后如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。

常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。

断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。

纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。

常用的纯化方法有：C18、O P C、P A G E和H P L C。

定量：根据寡核苷酸在260n m处的紫外吸收来定量。

储存：分装抽干。

Q3.需要什么级别的引物？根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

应用引物长度要求纯度级别要求一般P C R扩增<60b a s e H E P D >60b a s e P A G E 诊断P C R扩增<40b a s e H E P D,P A G E D N A测序20b a s e左右H E P D 亚克隆，点突变等根据实验要求定H E P D,P A G E，H P L C 基因构建（全基因合成）根据实验要求定H E P D P A G E 反义核酸根据实验要求定H E P D P A G E 修饰引物根据实验要求定P A G E,H P L C Q4.引物的质量是不是跟序列有关四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。

引物合成常见问题分析引物1合成中常见问题的分析。

应该合成多少脱氧寡核苷酸？一般来说，20BP 2 OD引物可进行400-500个50ul标准聚合酶链反应和2000-2500个测序反应因此，2 OD的脱氧核糖核酸的量足以进行一般的实验工作。

如果进行基因剪接或退火后再连接，1 OD就足够了，无论是PAGE纯化还是HPLC纯化，每次增加纯化量都会大大降低产品的纯度因此，为了保证产品的质量，我们通常将净化量控制在每次2 OD左右。

如何确定引物的光密度值:DNA的量与260纳米处的吸光度值(光密度值)成正比，因此用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0。

当测定OD值时，分光光度计上显示的值是每毫升溶液的OD值。

例如，你得到一管引物DNA干粉，用1毫升水将其溶解在母液中。

将50微升母液稀释至1微升，并在1微升标准试管中测量吸光度至0.25，表明50微升含有0.25脱氧核糖核酸，也就是说，最初的1微升母液含有5脱氧核糖核酸2。

如何检测寡脱氧核糖核酸的纯度？实验室检测更方便的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳一般情况下，16%聚丙烯酰胺凝胶加7M尿素用于电泳，20%凝胶用于小于12bp的短链，12%凝胶用于大于60bp的引物取0.2-0.5分钟的引物，用尿素饱和溶液溶解或向引物溶液中加入尿素干粉至饱和，在装载前加热变性(95℃，2分钟)在600伏电压下进行电泳，在一定时间后(约2-3小时)将凝胶剥离。

荧光薄层板在紫外灯下观察。

主带下未发现杂质带，表明纯度良好。

如果条件允许，也可以用银染法染色。

3。

为什么用3%琼脂糖凝胶电泳合成的寡核苷酸产物中有许多条带？由于寡脱氧核糖核酸是单链脱氧核糖核酸，很容易形成复杂的三维结构，所以在进行琼脂糖电泳时，很容易出现多个泳带(更不用说琼脂糖电泳定量)寡核苷酸的电泳必须使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖电泳不能充分区分小的单链DNA引物。

此外，在紫外灯下观察到荧光薄层板，主带下没有杂质带，表明纯度良好。

引物合成及各种问题总结（2）admin1.如何测定引物的OD值？用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。

DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml 标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。

举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

2.怎样溶解引物？我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。

3.合成的引物应如何保存?没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。

使用前，将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后进行实验。

4.如何检测引物的纯度？实验室方便的作法是用PAGE方法。

使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，>60个碱基的引物用12%的胶，取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins)。

加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。

600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带)。

引物合成常见问题分析1．需要合成多少OD的oligo？一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及 2000—2500 次的测序反应。

因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。

如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。

所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。

如何测定引物的OD值：DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。

进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。

例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。

取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

2.如何检测Oligo DNA的纯度？实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。

一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp 的引物使用12% 的凝胶。

取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。

600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

如果条件许可，也可以用银染方式染色。

3.使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带？由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行 Agarose 电泳时，容易出现多条泳带（更不能用 Agarose 电泳来进行定量了）。

Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳，Agarose电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。

引物合成常见问题Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

⑴去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH ；⑵耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-0H仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-0H发生耦合反应；⑶封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；（4）氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。

Q2.引物合成如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。

常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。

断裂下来的寡核苷酸带有自由的3'羟基。

纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。

常用的纯化方法有：C1& OPC PAGE^ HPLC定量：根据寡核苷酸在260n m处的紫外吸收来定量。

储存：分装抽干。

Q3.合成的引物5'端是否有磷酸化？合成的引物5'为羟基，没有磷酸基团。

如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费。

Q4.需要什么级别的引物？Q5.需要合成多少0D数？根据实验目的确定。

一般PCR扩增，2 0D引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。

如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。

Q6.如何计算引物的浓度？引物保存在高浓度的状况下比较稳定。

一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。

加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：V （微升）=OD数x 33 x 10000 / 引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。

引物合成常见问题分析1、如何溶解引物？干燥后的引物质地非常疏松，开盖前需先离心，将引物粉末收集到管底。

根据说明书上的公式计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。

溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5），引物在这种条件下不稳定。

2、如何保存引物？引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。

溶解前的引物在室温状态下可以长期保存。

溶解后的引物-20度可以长期保存。

如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。

修饰荧光引物需避光保存。

3、测序发现引物有突变是怎么回事？测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物，发生的概率很小，但是也会存在。

您所提交引物序列一般是通过电脑直接COPY到合成仪的，我们也有一套控制办法，预防碱基输入错误，基本不存在人工输错的现象。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高为99%，副产品不可以避免。

在合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在。

引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT，导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。

缺失突变，一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。

被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。

对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。

置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。

碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体（脱嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。

引物纯化方式选择指南2012-2-16 10:24:14内容导读一、DNA合成的方法和原理二、引物纯化的方法原理及其效果三、纯化方法与应用指南四、常见问题的原因分析及相应的对策一、DNA合成的方法和原理目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。

基于该方法的DNA合成仪有多种，由ABI/PE 公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。

各合成仪进行引物合成的原理基本相同，主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。

生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。

固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’ →3’方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→ 5’磷酸二酯键连接。

具体的反应步骤如图一。

1、脱保护基(Deblocking)用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。

2、活化(Activation)将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

3、连接(Coupling)亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

4、封闭(Capping)缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

引物设计常见问题引物设计常见问题与解答(⼆)17. 长链引物为什么出错的⼏率⾮常⾼答：引物合成时，每⼀步反应效率都不能达到100%,产⽣碱基插⼊，缺失，置换突变的因素客观条件都有⼀直存在。

引物链越长，突变的频率累加起来就越⾼。

研究⼈员总希望合成的引物万⽆⼀失，这种⼼情可以理解。

但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。

要知道，引物合成中发⽣错误（⾮⼈为因素）的频率，⽐任何⾼保真⾼温聚合酶PCR扩增过程所产⽣的频率都要⾼。

做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

18. 如果测序发现突变，该如何处理答：对您遇到的困惑，我们表⽰同情。

遇到这种情况，⾸先和我们取得联系，我们的⽣产⼈员会检查⽣产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单⼀致，我们在电脑中保留所有原始数据。

如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。

根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是⽤于全⽚段拼接合成的，就需要多测⼀些了。

⼀般情况下，每个克隆突变的位点都不⼀样，提⽰正确的总是有的，就是如何找到它。

您也可以要求我们将引物免费重合⼀次，不过重合的引物和第⼀次的引物⼀样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的⼏率。

基因拼接过程中，如果发现⼀段区域突变点不多，就多测⼏个，否则就重合⼀下引物。

19. 如果测序发现引物突变，是否有补偿答：没有。

我们可以免费重合⼀次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。

原因我们在前⾯已提到，化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物，合成过程中⼀些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。

20. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插⼊答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间⼀个碱基的差别。

但是制备PAGE电泳，上样量都是⾮常⼤，电泳时的条带⾮常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收⽬的引物时，很难说不割到差别仅⼏个碱基的引物。

引物合成常见问题分析1．需要合成多少OD的oligo？一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及 2000—2500 次的测序反应。

因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。

如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。

所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。

如何测定引物的OD值：DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。

进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。

例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。

取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD 的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

2. 如何检测Oligo DNA的纯度？实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。

一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp 的引物使用12% 的凝胶。

取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃2mins)。

600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

如果条件许可，也可以用银染方式染色。

3. 使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带？由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行 Agarose 电泳时，容易出现多条泳带（更不能用 Agarose 电泳来进行定量了）。

Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳，Agarose电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。

Q10.如何保存引物？引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。

干粉：运输时常温运输，-20℃可以保存一年。

储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20℃可以保存半年。

工作液：常规使用，4℃保存，也可-20℃保存，但应避免反复冻融。

修饰荧光引物：需要避光保存，尽快使用为宜。

Q11.引物定量不准是怎么回事儿？我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有：（1）定量错误、分装错误、引物抽干或收样过程中意外丢失。

这种可能性有，但是很少，因为作为专业的引物合成公司，我们的生产人员都是经过严格的专业培训，这种错误是要求谨慎避免甚至杜绝的。

一般情况下，引物都有留样备份，接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题，如确实存在问题，则可安排重新准备一份。

（2）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。

使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。

（3）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。

（4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将OD读数，正确地转换成母液中OD数。

这种情况比较常见。

例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul,加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm,此时光吸收的读数为0.2。

Q12.最长可以合成多长的引物？我们合成过100base的引物，但是产率很低。

除非需要，建议合成片段长度不要超过80base。

引物越长，出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。

Q13.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。

Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

(1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH；(2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应；(3) 封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；(4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。

Q2.引物合成后如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。

常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。

断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。

纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。

常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。

储存：分装抽干。

Q3.需要什么级别的引物？根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增< 60base HEPD>60 base PAGE诊断PCR扩增< 40base HEPD, PAGEDNA测序20base左右HEPD亚克隆，点突变等根据实验要求定HEPD, PAGE，HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定HEPDPAGE反义核酸根据实验要求定HEPDPAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLCQ4.引物的质量是不是跟序列有关？四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。

所以合成难度是不一样的。

难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。

尤其对于后者，国内公司一般都做不了20个G以上的引物。

引物设计常见问题与解答先看一下Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。

Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。

大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。

因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。