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细菌的分离与培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
课时安排：2课时操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
实验四：细菌的接种、培养和分离技术一、实验目的与要求：（1）掌握从环境土壤、水体、活性污泥等中分离培养细菌的方法;从而获得若干种细菌纯培养技能（2）掌握细菌纯种分离的方法：稀释平板分离法和平板划线法..（3）掌握几种接种技术：斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等..二、实验原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中;不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起;当我们希望获得某一种微生物时;就必须从混杂的微生物类群中分离它;以得到只含有这一种微生物的纯培养;这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化..为了获得某种微生物的纯培养..一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同;而供给它适宜的培养条件;或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长;而抑制其他菌生长的环境;从而淘汰其他一些不需要的微生物;再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物;直至得到纯菌株..三、实验器材1、牛肉膏蛋白胨培养基2、盛9ml无菌水的试管;盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶;1ml和5ml无菌吸管;无菌培养皿；3、接种环;土样;酒精灯等..四、操作步骤1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板;并标明培养基的名称..2、贴标签接种前在试管上贴上标签;注明菌名、接种日期、接种人姓名等..贴在距试管口径2-3厘米的位置..3、点燃酒精灯..4、接种取接种环右手拿接种环如握钢笔一样、在火焰上将环端烧红灭菌;然后将有可能伸入试管的其余部分;均用火烧过灭菌..环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管;先使环接触边壁;使其冷却..取菌种待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环;然后将接种环移出菌种管;注意不要使环的部分碰到管壁;取出后不可使环通过火焰..接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线..划线的方法很多;但无论哪种方法划线;其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释;使形成单个菌落..常用的划线方法有下列二种：⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环;先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条;再转动培养皿约70°角;并将接种环上剩余物烧掉;待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线;再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线图A..划线完毕后;盖上皿盖;倒置于温室培养..⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线图 B..划线完毕后;盖上皿盖;倒置温室培养..环灭菌将接种环烧红灭菌..5、挑菌将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上;分别置25℃和28℃温室中培养;待菌苔长出后;检查菌苔是否单纯;也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物;若有其他杂菌混杂;就要再一次进行分离、纯化;直到获得纯培养..四、注意事项1、实验操作过程中无菌操作..。
细菌的分离培养技术一、常用培养基的制备（一）肉膏汤培养基 (broth medium)1、成分牛肉浸膏3～5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml2、制法(1)于1000ml蒸馏水中加入上述成份，混合加热溶解。
(2)调整pH为7.4～7.6，煮沸3～5min，用滤纸过滤。
(3)分装于适当容器内，高压灭菌103.43Kpa 20min ,置阴暗处或冰箱中贮存备用。
3、用途供一般细菌培养之用，亦可制备糖发酵管及琼脂培养基用。
（二）肉浸汤培养基(infusion medium)1、成分⑴新鲜牛肉(去脂绞碎)500g 蛋白胨10g⑵氯化钠5g 蒸馏水1000ml2、制法(1)取新鲜牛肉(兔肉)除去肌键、肌膜及脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎或用刀剁碎，置于糖瓷或铝制锅中，每500g碎肉加水1000ml混合后置冰箱中过夜。
(2)次日取出肉浸液，搅拌均匀，煮沸30min并常搅拌以免沉淀烧焦。
如蛋白质已凝固，即停止加温，补足失去水分。
(3)用纱布或绒布挤压过滤，使所有肉汁尽量挤出，再用脱脂棉滤入大三角烧瓶内。
(4)在滤液中加入蛋白胨(10g/L)、氯化钠(5g/L)，再加热使其全部溶解。
(5)调整pH至7.6～7.8，煮沸10min，以滤纸过滤。
(6)分装三角烧瓶，塞好棉塞，再用厚纸将瓶口扎好，高压灭菌103.43KPa 20min，冷却后置阴暗或冰箱中保存备用。
3、用途供作基础培养基用，营养较肉膏汤好。
一般营养要求不高的细菌均能生长。
（三）普通琼脂培养基(agar medium)1、成分牛肉浸膏3～5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂20～25g蒸馏水1000ml2、制法⑴将上述成分置于三角烧瓶中，煮沸使其溶解(须防止外溢)，并补足由于蒸发失去的水分。
⑵趁热调整pH至7.6，以绒布过滤，分装试管或烧瓶内，高压灭菌103.43KPa 15min。
⑶琼脂斜面培养基制法：高压灭菌后，趁琼脂尚未凝固前，将其分装在已灭菌的试管内，斜放在台面上，待凝固后即成琼脂斜面培养基。
第九章细菌的培养与分离技术本章内容一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L 型的检查基本条件（一）细菌实验室：生物安全柜。
（二）无菌实验室（三）基本设备和器具：温箱、 CO2培养箱、厌氧培养设备；显微镜；高压蒸汽灭菌器、干烤箱；接种环和接种针；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
细菌的接种与分离技术平板划线分离法：分散生长，各自形成菌落。
连续划线法：杂菌不多。
分区划线法：杂菌多。
斜面接种法：单个菌落纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。
液体接种法：多用于一些液体生化试验管的接种。
穿刺接种法：半固体培养基，接种针。
倾注平板法：测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数。
将标本适当稀释后，取一定量加入已灭菌的平皿内，再倾入已溶化并冷却至 45℃左右的定量培养基，混匀，待凝固后倒置、培养。
涂布接种法：常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。
细菌的培养方法培养条件：根据临床初步诊断及待检细菌的种类，选用不同环境条件进行培养。
细菌的生长现象分离培养基上菌落的生长现象观察菌落的大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度等。
血琼脂上的溶血：α溶血：菌落周围出现绿色环状，红细胞外形完整无缺。
β溶血：菌落周围形成一个完全清晰透明的环，红细胞溶解。
γ溶血：没有溶血，红细胞无溶解。
双环：菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。
气味液体培养基中的生长现象肉汤培养基的混浊度、沉淀、菌膜，气味和色素等。
细菌数量达106～ 107CFU/ml，培养肉汤才见混浊。
血液培养的检查和传代培养：肉眼观察其生长现象，如溶血、产生气体或混浊度等。
半固体培养基中细菌的动力有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见混浊或细菌生长的小菌落。
细菌 L 型的检查1.标本采集：无杂菌污染的组织或体液标本应加 20%蔗糖无菌溶液保持高渗；血液标本应接种高渗肉汤增菌培养。
细菌的分离培养技术一、常用培养基的制备（一）肉膏汤培养基 (broth medium)1、成分牛肉浸膏3～5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml2、制法(1)于1000ml蒸馏水中加入上述成份，混合加热溶解。
(2)调整pH为7.4～7.6，煮沸3～5min，用滤纸过滤。
(3)分装于适当容器内，高压灭菌103.43Kpa 20min ,置阴暗处或冰箱中贮存备用。
3、用途供一般细菌培养之用，亦可制备糖发酵管及琼脂培养基用。
（二）肉浸汤培养基(infusion medium)1、成分⑴新鲜牛肉(去脂绞碎)500g 蛋白胨10g⑵氯化钠5g 蒸馏水1000ml2、制法(1)取新鲜牛肉(兔肉)除去肌键、肌膜及脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎或用刀剁碎，置于糖瓷或铝制锅中，每500g碎肉加水1000ml混合后置冰箱中过夜。
(2)次日取出肉浸液，搅拌均匀，煮沸30min并常搅拌以免沉淀烧焦。
如蛋白质已凝固，即停止加温，补足失去水分。
(3)用纱布或绒布挤压过滤，使所有肉汁尽量挤出，再用脱脂棉滤入大三角烧瓶内。
(4)在滤液中加入蛋白胨(10g/L)、氯化钠(5g/L)，再加热使其全部溶解。
(5)调整pH至7.6～7.8，煮沸10min，以滤纸过滤。
(6)分装三角烧瓶，塞好棉塞，再用厚纸将瓶口扎好，高压灭菌103.43KPa 20min，冷却后置阴暗或冰箱中保存备用。
3、用途供作基础培养基用，营养较肉膏汤好。
一般营养要求不高的细菌均能生长。
（三）普通琼脂培养基(agar medium)1、成分牛肉浸膏3～5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂20～25g蒸馏水1000ml2、制法⑴将上述成分置于三角烧瓶中，煮沸使其溶解(须防止外溢)，并补足由于蒸发失去的水分。
⑵趁热调整pH至7.6，以绒布过滤，分装试管或烧瓶内，高压灭菌103.43KPa 15min。
⑶琼脂斜面培养基制法：高压灭菌后，趁琼脂尚未凝固前，将其分装在已灭菌的试管内，斜放在台面上，待凝固后即成琼脂斜面培养基。
细菌的分离培养技术一、常用培养基的制备（一）肉膏汤培养基 (broth medium)1、成分牛肉浸膏3～5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml2、制法(1)于1000ml蒸馏水中加入上述成份，混合加热溶解。
(2)调整pH为7.4～7.6，煮沸3～5min，用滤纸过滤。
(3)分装于适当容器内，高压灭菌103.43Kpa 20min ,置阴暗处或冰箱中贮存备用。
3、用途供一般细菌培养之用，亦可制备糖发酵管及琼脂培养基用。
（二）肉浸汤培养基(infusion medium)1、成分⑴新鲜牛肉(去脂绞碎)500g 蛋白胨10g⑵氯化钠5g 蒸馏水1000ml2、制法(1)取新鲜牛肉(兔肉)除去肌键、肌膜及脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎或用刀剁碎，置于糖瓷或铝制锅中，每500g碎肉加水1000ml混合后置冰箱中过夜。
(2)次日取出肉浸液，搅拌均匀，煮沸30min并常搅拌以免沉淀烧焦。
如蛋白质已凝固，即停止加温，补足失去水分。
(3)用纱布或绒布挤压过滤，使所有肉汁尽量挤出，再用脱脂棉滤入大三角烧瓶内。
(4)在滤液中加入蛋白胨(10g/L)、氯化钠(5g/L)，再加热使其全部溶解。
(5)调整pH至7.6～7.8，煮沸10min，以滤纸过滤。
(6)分装三角烧瓶，塞好棉塞，再用厚纸将瓶口扎好，高压灭菌103.43KPa 20min，冷却后置阴暗或冰箱中保存备用。
3、用途供作基础培养基用，营养较肉膏汤好。
一般营养要求不高的细菌均能生长。
（三）普通琼脂培养基(agar medium)1、成分牛肉浸膏3～5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂20～25g蒸馏水1000ml2、制法⑴将上述成分置于三角烧瓶中，煮沸使其溶解(须防止外溢)，并补足由于蒸发失去的水分。
⑵趁热调整pH至7.6，以绒布过滤，分装试管或烧瓶内，高压灭菌103.43KPa 15min。
⑶琼脂斜面培养基制法：高压灭菌后，趁琼脂尚未凝固前，将其分装在已灭菌的试管内，斜放在台面上，待凝固后即成琼脂斜面培养基。
